益母草堿調節Fas/FasL信號通路對乳腺癌細胞惡性生物行為的影響

宋夢 許承彬 張來香 宋煒

乳腺癌發生于乳腺上皮組織細胞,其發病率居女性惡性腫瘤發病率首位,嚴重危害女性生命健康[1]。目前,乳腺癌的治療以手術切除為主,再根據病情以放療、化療等為輔助治療,放療費用高、不良反應大,現階段,化學藥物治療仍為主要的臨床治療手段[2]。由于乳腺癌易復發、易轉移,篩選高效、低毒的治療藥物對乳腺癌的治療具有重要的臨床意義。益母草堿是從益母草中提取的一種天然生物堿,具有多種藥理活性,如抗氧化、神經保護、抗癌、抗炎等[3],已被用于抗癌藥物的研究中。Lin等[4]研究表明,益母草可以顯著促進人宮頸癌細胞的凋亡。Liu等[5]研究表明,益母草堿可以通過抑制的miR-18a-5p/SOCS5/JAK2/STAT3軸活性,破壞CML惡性腫瘤。且益母草堿在動物的毒性實驗中尚未出現明顯的不良反應[6],具有較高的臨床應用價值。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fas)與脂肪酸合成酶配體(fatty acid synthase ligand,FasL)信號通路(Fas/FasL),可以介導細胞外源性凋亡[7],是調控細胞凋亡的主要途徑之一。本研究以4T1細胞株為研究對象,探究益母草堿對Fas/FasL信號通路的調節作用,以及對乳腺癌細胞增殖、遷移、凋亡等的影響,以期為乳腺癌的臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 4T1乳腺癌細胞購自中國科學院(上海)細胞庫;益母草堿(≥98%)購自上海西格生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(CA1210)、凋亡試劑盒(CA1020),購自索萊寶生物科技有限公司;N-cadherin(AF0243)、Vimentin(AF1975)、Fas(AF6861),細胞周期試劑盒(C1052)購自碧云天生物科技有限公司;FasL(sc-19988)購自圣克魯斯生物技術有限公司;LipofectamineTM 3000 試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖活性的檢測:取對數期生長的4T1乳腺癌細胞,制備單細胞懸液,以2×104個/孔接種于96孔板中,加入完全培養基,分別再加入終濃度為10、20、40、80、160 mmol/L的益母草堿,培養箱中培養12、24、48 h,加入10 μL的CCK-8,孵育4 h,使用酶標儀,測定每孔在450 nm處的OD值,計算細胞存活率。

1.2.2 細胞的處理與分組:將4T1乳腺癌細胞分為對照組(Control組)、益母草堿低、中、高濃度組(Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組)、益母草堿高濃度+轉染短發夾RNA慢病毒陰性對照組(Leo-H+sh-NC組),益母草堿高濃度+轉染Fas短發夾RNA慢病毒組(Leo-H+sh-Fas組)。取對數期4T1乳腺癌細胞,以5×104個/孔接種于24孔板中,培養至貼壁生長(密度70%～90%),加入病毒溶液,按照細胞∶病毒=1∶50,感染細胞24 h,將培養基更換為新鮮的完全培養基,加入嘌呤霉素繼續培養1周,在熒光顯微鏡下觀察細胞呈綠色熒光,即獲得穩定感染Fas短發夾RNA慢病毒細胞、感染短發夾RNA慢病毒細胞,加入濃度為30 mmol/L的益母草堿,記為Leo-H+sh-Fas組、Leo-H+sh-NC組;Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細胞給予10、20、30 mmol/L的益母草堿;Control組加入等量DMEM。6組細胞均于37℃(5%CO2)恒溫培養箱中培養。

1.2.3 細胞遷移能力:Transwell小室法評價細胞的遷移能力,取各組對數期生長的4T1細胞,加入胰消化酶進行消化,用無血清RPMI-1640培養基配置2×105個/mL的單細胞懸液,取100 μL加入Transwell上室,下室加入500 μL含10%FBS的RPMI-1640培養基,于37℃(5%CO2)恒溫培養箱中培養24 h,室溫下在4%多聚甲醛中固定20 min,結晶紫染色,在顯微鏡下隨機選取5個視野,觀察并記錄細胞遷移數目。

1.2.4 細胞凋亡:Hoechst33258染色法觀察細胞形態,6組處于對數期4T1細胞,配制濃度為2×105個/mL的單個細胞懸液,接種于6孔板,培養24 h,加入多聚甲醛室溫下固定20 min,PBS清洗,加入Hoechst33258染液染色15 min,PBS洗滌多余的染色液,使用熒光倒置顯微鏡,觀察細胞。

1.2.5 細胞凋亡與周期進展:收集6組處于對數期的4T1細胞,加入70%預冷乙醇溶液,固定12 h,部分細胞加入Annexin V-FITC,混勻,再加入PI染液染色5 min,流式機檢測細胞凋亡率;另一部分細胞,加入PI染液染色20 min,上流式機檢測細胞周期進展。

1.2.6 細胞N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL表達:Western blot法檢測,取6組對數期的4T1細胞,加入RIPA,低溫處理30 min,4 000 r/min離心20 min,取上清液,測定總蛋白含量;蛋白樣本中加入緩沖液,經凝膠電泳、轉膜,加入5%脫脂乳粉,封閉120 min;加入一抗N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL(稀釋度為1∶1 000),4℃孵育12 h,磷酸緩沖液洗滌3次,加入對用二抗,室溫繼續孵育2 h,ECL發光顯影,以β-actin作為內參蛋白,分析目標蛋白相對表達水平。

1.2.7 荷瘤小鼠模型的建立:取對數期生長的4T1細胞,加入胰消化酶進行消化,配置濃度為5×106個/mL 4T1細胞單細胞懸液,于裸鼠第二對乳腺脂肪墊處接種4T1細胞單細胞懸液0.1 mL[8],接種1周后,小鼠接種處可明顯檢測到移植瘤,乳腺癌模型建立成功。將小鼠隨機分為Control組和Leo組,每組6只,Leo組小鼠每天灌胃150 mg/kg的益母草堿[5],Control組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,連續給藥4周,每周測量小鼠移植瘤體積,實驗結束后,脫頸處死,取出移植瘤檢測質量以及檢測Fas、FasL蛋白表達。

2 結果

2.1 益母草堿對4T1細胞增殖活性的影響 10、20、40、80、160 mmol/L的益母草堿處理4T1細胞12 h、24 h、48 h,均可顯著降低細胞存活率,呈濃度和時間依賴效應,以不同濃度的益母草堿處理4T1細胞12 h后,細胞IC50值(半數抑制濃度)為(53.61±1.729) mmol/L;綜合結果,選擇濃度為10.0、20.0、40.0 mmol/L的益母草堿,處理細胞12 h,進行后續實驗。見表1。

表1 益母草堿對4T1細胞增殖活性的影響 n=6,%,

2.2 益母草堿對4T1細胞遷移與凋亡的影響

2.2.1 益母草堿對4T1細胞遷移能力的影響 與control相比,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細胞遷移個數呈濃度依賴性減少(P<0.05);與Leo-H組相比,Leo-H+sh-Fas組細胞遷移個數顯著增多(P<0.05)。見圖1,表2。

表2 益母草堿對4T1細胞遷移能力及細胞凋亡的影響 n=6,

2.2.2 益母草堿對4T1細胞凋亡的影響:control組細胞形態飽滿,呈彌散、微弱藍色熒光;Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細胞核、細胞質中均可見濃染致密顆粒塊狀熒光,且熒光強度逐漸增強;而相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組細胞核藍色熒光減弱。相比于control組,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組細胞凋亡率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖2、3。

圖2 Hoechst 33258染色觀察細胞形態(Hoechst 33258染色×400)

圖3 流式細胞術檢測細胞的凋亡

2.3 益母草堿對4T1細胞周期進展的影響 相比于Control組,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組G0/G1期細胞比例顯著升高,G2/M期細胞比例及S期細胞比例顯著降低(P<0.05),呈濃度依賴效應;相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組G0/G1期細胞比例顯著降低,G2/M期細胞比例及S期細胞比例顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 益母草堿對4T1細胞周期進展的影響 n=6,%,

2.4 益母草堿對4T1細胞上皮間質轉化及Fas、FasL表達的影響 相比于Control組,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細胞N-cadherin、Vimentin表達顯著降低,Fas、FasL表達顯著升高,呈濃度依賴性(P<0.05);相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組細胞N-cadherin、Vimentin表達顯著升高,Fas、FasL表達顯著降低(P<0.05)。見圖4,表4。

圖4 益母草堿對4T1細胞皮間質轉化及Fas、FasL表達的影響;A Control組;B Leo-L組;C Leo-M組;D Leo-H組;E Leo-H+sh-NC組;F Leo-H+sh-Fas組

表4 益母草堿對4T1細胞上皮間質轉化及Fas、FasL表達的影響 n=6,

2.5 益母草堿對乳腺癌移植瘤生長的影響 小鼠乳腺癌移植瘤實驗結果顯示,在接種5周后,小鼠第2對乳頭處可見明顯腫瘤腫塊,移植瘤模型建立成功。相比于Control組,Leo組小鼠移植瘤體積及質量顯著降低,N-cadherin、Vimentin表達顯著降低,Fas、FasL表達顯著升高(P<0.05)。見表5、6,圖5。

圖5 益母草堿對乳腺癌移植瘤N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL蛋白表達的影響;A Control組;B Leo組

表5 益母草堿對乳腺癌移植瘤生長的影響 n=6,cm3,

表6 益母草堿對乳腺癌移植瘤生長及N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL蛋白表達的影響 n=6,

3 討論

目前,乳腺癌已成為發病率最高的惡性腫瘤之一,相對于發達國家,發展中國家以及低收入國家,乳腺癌的生存預后差,病死率高,嚴重威脅人們生命安全[9-10],尋找價廉、高效的治療藥物,對乳腺癌的防治至關重要。益母草堿來源廣泛,毒副作用小,已被大量研究證明具有顯著的抗癌活性,如,羅娜等[11]研究發現,益母草堿可以通過調控LINC00461,抑制宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡;Liang等[12]研究表明,益母草堿可以通過調控miR-18a-5p/SLC40A1軸,抑制前列腺癌體外和體內生長。乳腺癌細胞的過度增殖與遷移關系到乳腺癌疾病的復發和轉移[13]。本研究中以4T1細胞株為研究對象,使用益母草堿進行處理,結果顯示,益母草堿可以顯著抑制4T1細胞的增殖與遷移,促進細胞凋亡,荷瘤小鼠實驗進一步驗證益母草堿可以顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長,但機制尚不明確。

癌細胞最顯著的特征即為無限增殖,細胞周期是細胞增殖分化的關鍵,阻滯細胞周期進程是降低細胞增殖能力的有效手段之一[14]。本研究結果顯示,益母草堿干預處理后,4T1細胞處于G0/G1期的細胞比例顯著升高,S期的細胞比例顯著降低,細胞被阻滯于G0/G1期,增殖能力明顯被抑制。因此推斷,益母草堿可能通過阻滯細胞周期進程,誘導細胞凋亡。

細胞凋亡是目前腫瘤研究的主要方向之一,受多種信號通路調節,其中Fas/FasL信號通路是非常重要的凋亡途徑。Fas存在于多種組織和器官中,是腫瘤壞死因子受體的一種,FasL是Fas的天然受體,參與細胞內多種信號的傳遞[15]。Fas與FasL結合(Fas/FasL信號通路激活)凋亡途徑被激活,引起細胞凋亡,維持機體正常免疫功能[16]。有研究表明,腫瘤組織中Fas表達受到抑制,表達量顯著低于癌旁組織和正常組織[17-18],上調Fas水平可以促進腫瘤細胞的凋亡。宋文龍等[19]使用辣椒素激活Fas/FasL信號通路,誘導為癌細胞的凋亡。朱垠等[20]研究發現,Fas/FasL信號通路通路的激活可以抑制大腸癌惡性生物學特性。上皮間質轉化(EMT)是腫瘤遷移的關鍵,EMT的發生伴隨著間質細胞蛋白N-cadherin、Vimentin表達上調,阻止EMT進程可以抑制癌細胞的增殖與遷移[21-22]。本研究中益母草堿處理組4T1細胞Fas、FasL表達顯著上調,N-cadherin、Vimentin表達顯著下調;Leo-H+sh-Fas組中抑制Fas表達,可以逆轉益母草堿對4T1細胞增殖、遷移的抑制作用,細胞凋亡率降低。

綜上所述,益母草堿可以上調4T1細胞Fas、FasL表達,抑制細胞的增殖、遷移與EMT進程,具有治療乳腺癌疾病的潛力。但抗癌作用機制復雜,其臨床引用仍需進一步研究。