非小細胞肺癌患者血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達與病理特征的關系

崔本科 王巖 盧云鳳

原發性支氣管肺癌(肺癌)是我國最常見和死亡率最高的惡性腫瘤,據國家癌癥中心最新報道,2016年我國肺癌發病數和死亡數分別為82.81萬例、65.70萬例[1]。臨床中85%的肺癌為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),由于缺乏有效的早期診斷方法和治療方法,導致NSCLC患者死亡率居高不下[2]。尋找相關分子標志物評估NSCLC患者預后至關重要。研究表明,非編碼RNA能通過調控多種靶基因參與NSCLC發生發展[3-4]。序列相似性家族138成員B(family with sequence similarity 138 member B,FAM138B)是新近發現的一種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)。有學者通過RNA測序分析發現,LncRNA FAM138B為肺腺癌潛在的診斷和預后生物標志物[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)-105-5p是一種miRNA,有研究報道miR-105-5p與胃癌、肝癌等惡性腫瘤預后有關[6-7]。同時有學者指出,循環miR-105-5p可作為NSCLC早期診斷標志物[8]。但關于LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達與NSCLC病理特征的預后的關系尚未可知。本研究擬探討NSCLC患者血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達與病理特征的預后的關系,以期為改善NSCLC患者預后提供更多思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年12月遼寧省人民醫院收治的110例NSCLC患者為NSCLC組,男64例,女46例;年齡24～77歲,平均年齡(60.57±8.63)歲;吸煙63例;病理類型:腺癌37例,鱗癌73例;腫瘤大小:≥5 cm 49例,<5 cm 61例;分化程度:低分化51例,中高分化59例;TNM分期[9]:Ⅰ期28例,Ⅱ期38例,Ⅲ期27例,Ⅳ期17例;淋巴結轉移61例。另選取同期60例體檢健康者為對照組,男35例,女25例;年齡20～75歲,平均年齡(60.41±7.53)歲;2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 納入與排除標準 (1)納入標準:①經病理檢查確診為NSCLC;②患者或家屬書面知情同意;③初次確診為NSCLC;④入院前未接受抗腫瘤治療;(2)排除標準:①年齡<18歲;②合并慢阻肺等其他肺部疾病;③合并其他部位惡性腫瘤;④合并急慢性感染;⑤合并免疫、血液、神經系統損害;⑥院內死亡、拒絕接受隨訪。

1.3 方法 采集NSCLC患者入院翌日晨和對照組體檢時空腹肘靜脈血3 mL,離心留取上層血清,Trizol試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司,編號:WLA088a)提取血清總RNA,微量分光光度計(武漢艾維斯特科技有限公司,型號:Nano-300)鑒定RNA濃度和純度合格后,使用反轉錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司,編號:R1011)合成cDNA。反轉錄條件:37℃ 1 h,80℃ 5 s。按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,編號:R223-01)進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應。反應體系共20 μL:cDNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、2×TransStart Top Green qPCR SurperMix 10 μL、無核酸酶水8.5 μL;反應條件:95℃ 90 s(1次),95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(循環40次)。LncRNA FAM138B、miR-105-5p分別以GAPDH、U6為內參校正,2-ΔΔCt法計算血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p相對表達量。LncRNA FAM138B正向引物:5’-GCCTGGAGAGCACCAAGAGGCC-3’;反向引物:5’-ATGGTCCCCAGCCAAAAGCCTC-3’;GAPDH正向引物:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’;反向引物:5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’;miR-105-5p正向引物:5’-TCGGCAGGTCAAATGCTCAGAC-3’;反向引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;U6正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 隨訪 NSCLC患者出院后通過電話或門診隨訪3年(第1年3個月1次,第2、3年6個月1次),隨訪終止事件為患者死亡或隨訪終點時間(2022年12月),統計3年總生存率。根據NSCLC組織中LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達均值分為高、低表達組。

2 結果

2.1 NSCLC組與對照組血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達比較 NSCLC組血清LncRNA FAM138B表達低于對照組,miR-105-5p表達高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC組與對照組血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達比較

2.2 NSCLC患者血清LncRNA FAM138B與miR-105-5p表達的相關性 經StarBase數據庫https://starbase.sysu.edu.cn/預測,LncRNA FAM138B與miR-105-5p存在互補序列。Pearson相關性分析顯示,NSCLC患者血清LncRNA FAM138B與miR-105-5p表達呈負相關(r=-0.770,P<0.001)。見圖1。

圖1 NSCLC患者血清LncRNA FAM138B與miR-105-5p表達的線性散點圖

2.3 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達與NSCLC患者病理特征的關系 不同分化程度、TNM分期、淋巴結轉移NSCLC患者LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達比較,差異有統計學意義(P<0.05),不同性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小NSCLC患者LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達與NSCLC患者病理特征的關系

2.4 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達與NSCLC患者生存率的關系 110例NSCLC患者隨訪3年,失訪4例,死亡48例,3年總生存率為56.36%(62/110)。K-M生存曲線分析顯示,LncRNA FAM138B高表達組(≥0.871,58例)總生存率67.24%(39/58)高于低表達組(<0.871,52例)的44.23%(23/52);miR-105-5p高表達組(≥1.494,56例)總生存率44.64%(25/56)高于低表達組(<1.494,54例)的68.52%(37/54),差異有統計學意義(Log-rankχ2=7.339、5.356,P=0.007、0.021)。見圖2。

圖2 不同LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達的NSCLC患者K-M生存曲線

2.5 NSCLC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析 排除4例失訪患者,性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、LncRNA FAM138B、miR-105-5p為自變量,隨訪時間為時間變量,生存狀態為因變量(死亡/存活=1/0)。多因素Cox回歸分析顯示,低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移和miR-105-5p≥1.494為NSCLC患者死亡的獨立危險因素,LncRNA FAM138B≥0.871為獨立保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 NSCLC患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

2.6 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達對NSCLC患者預后的預測價值 ROC曲線分析顯示,血清LncRNA FAM138B聯合miR-105-5p表達預測NSCLC患者預后的AUC大于LncRNA FAM138B、miR-105-5p單獨預測(Z=3.269、3.406,P=0.001、0.001)。見表4,圖3。

圖3 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達預測NSCLC患者預后的ROC曲線

表4 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達對NSCLC患者預后的預測價值

3 討論

肺癌是起源于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤[2]。近年來隨著低劑量螺旋CT的開展和居民健康意識的提高,NSCLC早期診斷率有所提高,但由于早期癥狀不明顯,僅25%患者初診處于可切除的早中期,多達75%的患者在初診時處于晚期,失去最佳根治性切除機會[9-10]。盡管近年來基于表皮生長因子受體、ROS原癌基因1、間變性淋巴瘤激酶等的靶向藥物[11]和基于程序性死亡受體1等的免疫藥物[12]提高了患者客觀緩解率,但僅部分NSCLC患者獲得臨床效益,且隨著獲得性耐藥隨著治療時間的延長越來越多,導致NSCLC患者預后仍然較差。因此發現預后準確預測標志物和潛在的治療靶點,對提高NSCLC患者臨床干預和生存率具有重要意義。

NSCLC是多因素、多基因、多機制參與的復雜過程,表觀遺傳能通過修飾或改變特定染色體區域結構等因素影響基因表達,進而參與NSCLC發生發展[13]。LncRNA是一類新興表觀遺傳調控分子,能通過直接與蛋白質相互作用、與miRNA相互作用形成內源競爭RNA、編碼蛋白質或多肽等多種方式調控NSCLC進程。LncRNA FAM138B定位于人染色體2q14.1,Li等[5]首次通過RNA測序證實,LncRNA FAM138B在肺腺癌組織中低表達,且與患者預后生存率降低有關。Zhuo等[14]研究報道,LncRNA FAM138B在肝癌中低表達,上調LncRNA FAM138B能靶向下調miR-765,進而抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲?；谏鲜鲅芯?我們推測LncRNA FAM138B可能與NSCLC患者預后有關。本研究結果顯示,NSCLC組血清LncRNA FAM138B表達降低,與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關,說明LncRNA FAM138B低表達參與NSCLC發生發展。LncRNA FAM138B在NSCLC中低表達可能與其啟動子被甲基化而表達沉默有關[15]。而隨著LncRNA FAM138B表達降低,可能降低ATP結合盒轉運蛋白、環磷酸腺苷,導致NSCLC細胞持續分裂和增殖,促進NSCLC惡性進展[5]。

miRNA也是一類新興表觀遺傳調控分子,能通過引發信使RNA的降解或轉錄后基因沉默,進而參與NSCLC發生發展。miR-105-5p定位于人染色體Xq28,近年來大量研究報道了其與腫瘤的關系,如艾恒玲等[16]研究報道,miR-105-5p能靶向上調XIAP相關因子1促進宮頸癌細胞遷移和侵襲。上述研究表明,miR-105-5p是一種癌基因。同時有學者報道,miR-105-5p高表達與乳腺癌、原發性骨髓瘤等惡性腫瘤患者的預后不良有關[17]?；谏鲜鲅芯?我們推測miR-105-5p可能與NSCLC患者預后有關。本研究結果顯示,NSCLC組血清miR-105-5p表達升高,這與既往報道結果[8]相符。本結果還顯示,NSCLC組血清miR-105-5p表達與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關,說明血清miR-105-5p表達升高參與NSCLC發生發展。miR-105-5p在NSCLC中高表達可能與其啟動子被癌基因激活而大量表達有關[8]。而隨著miR-105-5p表達升高,能上調GTP酶IMAP家族成員6,促進NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲[18]。

本研究通過StarBase數據庫預測發現,LncRNA FAM138B與miR-105-5p存在互補序列,相關性分析也發現兩者在NSCLC患者血清中表達呈負相關,提示LncRNA FAM138B與miR-105-5p可能共同參與NSCLC進程。Gao等[19]實驗也顯示,上調LncRNA FAM138B表達能靶向抑制miR-105-5p,進而抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲。進一步佐證了本研究結果。本研究通過隨訪分析LncRNA FAM138B、miR-105-5p與NSCLC患者預后的關系發現,LncRNA FAM138B高表達和miR-105-5p低表達患者3年總生存率顯著提升,miR-105-5p≥1.49為NSCLC患者死亡的獨立危險因素,LncRNA FAM138B≥0.87為獨立保護因素,說明血清LncRNA FAM138B低表達和miR-105-5p高表達與NSCLC患者預后不良密切相關。最后我們通過繪制ROC曲線也發現,血清LncRNA FAM138B聯合miR-105-5p表達預測NSCLC患者預后的AUC為0.905,較LncRNA FAM138B、miR-105-5p單獨預測的AUC顯著增加。說明血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達對NSCLC患者預后具有一定預測價值,且聯合檢測血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達能提升其預測價值。

綜上所述,NSCLC患者血清LncRNA FAM138B表達降低,miR-105-5p表達升高,與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和預后有關,血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達對NSCLC患者預后具有一定預測價值,二者聯合預測NSCLC患者預后的價值較高,可能成為NSCLC患者預后的輔助預測指標。