基于生物信息學分析二仙湯治療膝關節骨性關節炎合并骨質疏松癥的機制

汪 青，黃昊強，陳 勇，徐 鋒，彭志堅

（昆山市中醫醫院骨科，江蘇 昆山 215300）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）及膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）都是年齡相關的退行性骨骼疾病，兩者在流行病學、發病機制及病理變化等諸多方面有共同點[1]。中醫藥具有多靶點多途徑的特點，在膝關節骨性關節炎與骨質疏松癥共病治療上具有一定的價值。二仙湯由上海中醫藥大學張伯納教授創制，臨床用于骨質疏松癥具有不錯的療效；然而該方對于膝關節骨性關節炎與骨質疏松癥共病治療是否有作用，仍不清楚。本研究應用生物信息學的方法，篩選出二仙湯、膝關節骨性關節炎及骨質疏松癥共同的靶點并進行分析，旨在為二仙湯臨床治療膝關節骨性關節炎與骨質疏松癥共病提供理論依據。

1 數據來源與方法

分別以骨質疏松癥及膝關節骨性關節炎作為關鍵詞，在疾病數據庫[Disgenet（https://www.disgenet.org/home/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Genecards（https://www.genecards.org/）]中篩選靶點，其中Disgenet 評分≥0.1，Genecards 篩選相關度≥5。在中藥數據庫平臺（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選二仙湯六味中藥（仙茅、仙靈脾、巴戟天、當歸、知母、黃柏）的有效化合物，通過Netinfer 平臺（http://lmmd.ecust.edu.cn/netinfer/）預測二仙湯的靶標。使用Venny2.1.0 進行交集，獲得二仙湯治療OP 合并KOA 的靶點，通過String 數據庫（https://cn.stringdb.org/）制作靶點間相互作用PPI 網絡，并導入cytoscape3.7.2。使用R 語言進行GO 生物過程富集分析以及KEGG 通路富集分析，并進行可視化。

2 結果

2.1 二仙湯治療KOA 合并OP 的靶點 通過疾病數據庫查詢，共獲得OP 相關基因共533 個，KOA 相關基因共302 個。通過TCMSP 數據庫平臺，共獲得二仙湯有效化合物共104 個，使用Netinfer 平臺，預測靶標共278 個，取3 者的交集生成韋恩圖，映射出共同靶點14 個，即二仙湯治療KOA 合并OP 的靶點，見圖1。

圖1 二仙湯治療膝關節骨性關節炎合并骨質疏松癥的共同靶點

2.2 PPI 網絡及關鍵靶點基因 共同的14 個基因靶標經String 數據庫在0.4 信度下構建PPI 網絡見圖2，網絡共有14 個節點，具有52 條相互作用關系，導入cytoscape 軟件并進行分析，按照degree 值大小順序，靶標有：CXCL8、PTGS2、MMP9、ACE、MMP2、ESR1、MMP3、MMP1、IL2、PPARG、ESR2、VDR、COMT、MMP8，見圖3。

圖2 共同靶點相互作用PPI 網絡圖（置信度為0.4）

圖3 核心靶點圖（靶點大小為degree 值）

2.3 GO 及KEGG 富集分析 使用R 語言clusterProfiler 包進行GO 及KEGG 富集分析。GO 生物學過程主要集中在調節炎癥反應等，KEGG 主要富集在IL-17、雌激素等，結果以氣泡圖的形式展示見圖4、圖5。使用cytoscape 軟件繪制二仙湯治療OP 合并KOA 的基因靶點-信號通路相互作用圖見圖6，IL-17 信號通道見圖7，雌激素信號通路見圖8。

圖4 GO 富集分析結果

圖5 KEGG 富集分析結果

圖6 二仙湯治療OP 合并KOA 的基因靶點-信號通路相互作用圖

圖7 IL-17 信號通道

圖8 雌激素信號通路

3 討論

OP 合并KOA 在臨床上十分常見，兩者有一些共同的發病機制，包括炎癥、激素、腸道菌群及代謝等。對于OP 合并KOA，尚沒有特效藥物。中藥具有多靶點多途徑的特點，對于共病的治療可能具有一定的優勢。本研究應用生物信息學的方法，探討二仙湯治療骨質疏松癥合并膝關節骨性關節炎的可能機制，為臨床應用提供依據。

本研究結果表明，二仙湯治療OP 合并KOA 的主要靶標有CXCL8、PTGS2、MMP9、ACE、MMP2、ESR1、MMP3、MMP1、IL2、PPARG、ESR2、VDR、COMT、MMP8。這些靶標大致可以歸類為白介素、雌激素受體、金屬基質蛋白酶等。CXCL8，即白介素8（interleukin-8,IL-8），主要由單核-巨噬細胞產生，具有吸引和激活中性粒細胞，促進炎癥反應的作用[2]。MMP9、MMP3、MMP1、MMP8 均屬于基質金屬蛋白酶，其主要的生物學作用為降解細胞外基質，在骨質疏松、骨關節炎等多種疾病的發生發展中具有重要的作用[3，4]。ESR1 及ESR2 為雌激素受體。雌激素通過與細胞中的雌激素受體結合，發揮生物學作用。KEGG 富集在IL-17、雌激素等信號通道。IL-17由CD+T 細胞分泌，能夠誘導上皮細胞、內皮細胞等多種細胞合成分泌多種炎癥因子。研究發現[5，6]，IL-17 信號通道參與成骨細胞、破骨細胞等多種骨細胞的調控，與骨質疏松、骨關節炎等多種炎癥性骨病的發生發展有關。雌激素信號通道能夠調控成骨細胞、破骨細胞、骨髓間充質干細胞、軟骨細胞等多種骨細胞的增殖分化，參與骨質疏松、骨關節炎等多種退行性骨病的病理過程。由此推測，二仙湯治療OP 合并KOA 的主要機制可能是調節炎癥因子、調節性激素水平等途徑。

炎癥是OP 及KOA 發病的共同病理因素[7]。炎癥因子促進骨吸收主要的機制有炎癥因子促進RANKL 的表達，進而刺激破骨細胞增殖、分化，增強骨吸收能力。研究發現[8]，IL-8 能夠刺激破骨細胞分化，進而促進骨吸收；抑制間充質干細胞活性及成骨分化能力，抑制成骨細胞功能。絕經后骨質疏松癥患者的IL-8 水平升高，并與骨密度呈負相關[9]。另一項研究發現[10]，血清IL-17 在絕經后骨質疏松人群中顯著高于對照組人群。同時，炎癥也在KOA 的發病及進展起著關鍵作用。炎癥因子通過關節液等其他機制擴散至軟骨中，誘導軟骨細胞凋亡。血清及滑膜中IL-17 的水平與KOA 的嚴重程度相關[11]。這些說明炎癥因子與OP 及KOA 的發生密切有關。大量的研究證實[12，13]，二仙湯復方具有抗炎、調節免疫系統的作用。Wang N 等[14]研究發現，二仙湯抑制去卵巢小鼠的炎癥因子表達，促進細胞活性。楊文昌等[15]發現二仙湯能夠抑制膝關節炎的炎癥因子水平。另外，二仙湯單味中藥，仙茅、仙靈脾、巴戟天等均具有一定的抗炎及免疫調節作用[16-18]。由此推測，調節免疫功能、抑制炎癥反應可能是二仙湯治療OP合并KOA 的一個機制。

雌激素水平下降是OP 及KOA 發生發展的另一個重要原因。雌激素與雌激素受體結合，通過多種途徑調控骨代謝。雌激素一方面誘導破骨細胞凋亡，抑制破骨細胞數量及破骨細胞分化，另一方面促進成骨細胞增殖分化，促進膠原合成及礦化。研究發現，雌激素能夠緩解軟骨細胞炎癥及氧化應激[19，20]，減少軟骨細胞損傷[21]。雌激素能夠抑制雌激素受體介導的滑膜細胞金屬基質蛋白酶的表達，抑制軟骨細胞凋亡[22]。雌激素受體在骨細胞及軟骨細胞中表達，其基因多態性與OP 及KOA 的發生發展密切有關[23]。研究發現二仙湯具有雌激素樣作用。李翠云[24]應用二仙湯治療卵巢早衰，結果表明二仙湯治療后，雌二醇水平升高。項曉覺等[25]的一項研究也表明，二仙湯治療后，雌二醇水平升高，卵泡刺激素水平下降。動物實驗中發現，二仙湯能夠調節雌激素受體[26]。因此，調節雌激素水平及雌激素受體可能是二仙湯治療OP 合并KOA 的另一個機制。

綜上所述，OP 合并KOA 在臨床比較常見，其治療方法各異，療效不確定。中藥二仙湯可能能夠通過調節免疫功能、抑制炎癥反應，調節雌激素及雌激素受體水平，治療OP 及KOA 共病，這為二仙湯的臨床應用提供了一定的依據。然而，本研究僅從生物信息學的角度探討，仍存在較大的局限性。后續將開展臨床及動物實驗，以明確二仙湯在OP 及KOA 共病治療中的價值及作用機制。