利用生物信息學方法分析青黛治療潰瘍性結腸炎的藥理作用機制

張卉青，韋卓純，林 繪，方澤慧，張 越，仲 春，黃衛娟

（1.東莞市濱海灣中心醫院臨床藥學科，廣東 東莞 523900；2.青島市即墨區人民醫院藥劑科，山東 青島 266200；3.上海市北蔡社區衛生院藥劑科，上海 200000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的特發性炎癥性腸病，其發病機制受多種因素影響，包括飲食、環境、遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應失調等[1-4]。目前臨床上尚無徹底治愈UC 的方法，西醫治療以控制急性發作、黏膜修復、維持緩解、減少復發、預防并發癥發生為主，治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質激素類、免疫抑制劑、生物制劑等[5]。中醫將UC 歸為中醫學“腸澼”“痢疾”“便血”等病范疇，通過辨證施治給予口服中藥治療或中藥灌腸治療[6，7]。中藥青黛具有清熱、解毒、涼血、定驚的功效，歷代醫家多用其治療瘡瘍癤毒、驚厥躁動、吐血便血等癥?，F代臨床將其用于促進皮膚黏膜愈合、潰瘍性結腸炎、白血病等[8-10]。本研究采用網絡藥理學的研究方法，探索青黛治療潰瘍性結腸炎的藥理作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 青黛相關靶點篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫獲得青黛的化學組分，根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）及類藥性（drug-likeness，DL）藥物代謝動力學參數進行活性成分初步篩選，以獲得活性化合物及其作用的蛋白質靶點，并根據已發表的文獻報道補充未檢測到的活性化合物的已知靶點。最后使用Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）對化合物的蛋白質靶點名稱進行統一規范。

1.2 UC 相關靶點的篩選以“Ulcerative Colitis”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫（http://www.genecards.org/）、DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/home/）中獲取UC 相關靶點，并以DrugBank 數據庫（http://www.godrugbank.com）中臨床一線治療藥物的靶點為補充。合并3 個數據庫得到的靶點后，刪除重復值最終得到UC 潛在治療靶點。

1.3 青黛成分-UC 靶點PPI 網絡構建 利用R 語言將青黛成分相關靶點與UC 靶點取交集繪制韋恩圖，獲取兩者共有靶點，即青黛治療UC 的潛在作用靶點。將獲得的共有靶點導入String 數據平臺（http://cn.string-db.org/），生物類型設定為“Homo sapiens”，最小互作閾值設定為“Highest confidence”（＞0.9），其余選項設為默認值，得到蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖。

1.4 共有靶點GO 功能與KEGG 通路富集分析 GO對基因和蛋白質功能進行限定和描述，將基因功能分為3 個部分：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。KEGG 是一個整合基因組、化學和系統功能信息的數據庫。將獲取的共有靶點輸入Metascape 數據平臺（http://metascape.org/gp/index.html），設置P＜0.01，進行GO 及KEGG 富集分析，對結果進行可視化分析，得到青黛治療UC 的生物功能和信號通路。

1.5 藥物成分-靶點-通絡網絡圖構建 運用CytoScape3.7.1 構建藥物成分-靶點-通路網絡圖，利用CytoScape3.7.1 內置工具包分析成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（closenness）等，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 結果

2.1 青黛及UC 靶點的獲取 以“青黛”為關鍵詞檢索并設置篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18 后，最終得到其活性成分9 個（表1）。通過TCMSP 數據庫篩選得到青黛有效成分的潛在作用靶點64 個。運用GeneCards 數據庫設定Score≥2 倍中位數的目標靶點為UC 的潛在靶點，結合DisGeNET，DRUGBANK數據庫補充，合并刪除重復值后，得到1599 個UC相關靶點。

表1 青黛主要成分

2.2 青黛-UC 靶點PPI 網絡構建 將獲取的青黛靶點及UC 治療靶點取交集作韋恩圖（圖1），得到青黛-UC 共同靶點32 個。將32 個共靶點提交至String數據庫平臺，得到青黛-UC 共同靶點的PPI 網絡圖（圖2）。

圖1 青黛-UC 韋恩圖

2.3 靶點功能與通路富集 應用Metascape 數據平臺對青黛-UC 相關靶點進行信號通路分析，并對結果進行可視化，結果顯示青黛與UC 共同靶點在CC 中主要富集條目為細胞膜的膜閥（membrane raft）、膜微結構域（membrane microdomain）和膜區（membrane region）（圖3A）；共同靶點在BP 中主要富集條目為脂多糖應答（response to lipopolysaccharide）、對細菌源性分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、有毒物質反應（response to toxic substance）等（圖3B）。共同靶點在MF 中主要富集條目為細胞因子受體（cytokine receptor binding）、DNA 結合轉錄因子（DNA-binding transcription factor binding）、血紅素結合（Heme binding）等（圖3C）。青黛治療UC 主要參與的信號通路包括脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（hepatitis B）、EB 病毒感染（epstein-bar virus infection）等疾病相關信號通路（圖3D），靶點通路富集結果見表2。

圖3 青黛-UC 共靶點富集分析

表2 青黛治療潰瘍性結腸炎靶點通路富集結果（前20 位）

2.4 藥物成分-靶點-通路網絡圖構建 運用CytoScape 3.7.2 構建成分-靶點-通路網絡（圖4），運用CytoScape 3.7.2 內置的Network Analyzer 分析青黛治療潰瘍性結腸炎的網絡拓撲學參數，得到核心成分及靶點見表3、表4。

圖4 藥物成分-靶點-通路網絡圖

表3 青黛主要活性成分網絡節點特征參數

表4 共靶點網絡節點參數特征

3 討論

UC 是一種病因不明，主要累及直結腸黏膜，表現為以結直腸黏膜連續性、彌漫性炎癥改變為特征的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[11]。隨著近年來人民生活水平的提高及飲食習慣的改變，UC 的發病率逐年增高[12]。流行病學調查發現[13，14]，我國南方（廣東省中山市）發病率為2.05/10 萬，北方（黑龍江省大慶市）發病率為1.64 萬/10 萬。以往研究表明[1-4]，UC的發病機制主要涉及環境、免疫、遺傳因素、腸道粘膜屏障破壞、感染、腸道菌群失調等。其中，免疫系統中免疫細胞（CD4+T 細胞、Th17 細胞、調節性T細胞）、炎性細胞因子（TNF-α、IL）、TLR4/NF-κB 信號通路等均參與UC 的發病過程。

本研究通過網絡藥理學的研究方法得到青黛治療UC 的主要活性成分、主要作用靶點及參與調控的信號通路。通過GO 及KEGG 富集分析，結果表明青黛治療UC 的主要靶點為RELA、TNF、IKBKB、CASP3、MAPK14、CASP8 等。RELA 是NF-κB 家族的重要成員之一，NF-κB 調控細胞增殖、分化及凋亡相關基因表達，涉及腫瘤、炎癥、免疫反應等眾多生理和病理活動。RELA/p65 翻譯修飾后能夠精細地調控NF-κB 的轉錄激活[15-17]。IKBKB（又名IKKβ）是IKK 復合物重要的催化亞基，它與催化亞基IKKα 以及IKKγ 共同構成IKK 復合物。IKK 復合物的磷酸化可以激活NF-κB，使得NF-κB 轉入細胞核內調控一系列基因表達[18]。TNF-α 是一種重要的促炎細胞因子，能夠與多種細胞因子產生協同作用，進一步誘導機體中炎癥介質的釋放。研究表明[19]，TNF-α 水平的上調與UC 的發生、發展密切相關。絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是4 種p38 MAPK之一，可以通過紫外線照射、炎性細胞因子刺激等激活，在細胞級聯反應中發揮重要作用，調節細胞的生長、分化和對環境的應激適應、炎癥反應等多種病理生理過程[20]。有研究表明[21-23]，雷公藤多苷、參苓白術散、葛根芩連湯等多種中藥制劑能夠通過調p38 MAPK 信號通路治療UC。Caspase 家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件，其激活或超常表達均引起細胞凋亡。有研究表明[24]，青黛可以通過調節粘膜炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 和凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的表達，減輕DSS 誘導的結腸黏膜損傷程度，減輕上皮細胞變性/壞死。青黛還可以顯著降低DSS 誘導的巨噬細胞浸潤和TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 表達，同時顯著抑制LPS 誘導的TNF-α、IL-6 和COX-2 的表達，抑制IKaB-α 降解和NF-κB p65 核易位[25]。

本研究結果表明，中藥青黛的有效活性成分為雙靛藍（bisindigotin）、靛苷（indican）、10h-吲哚-[3,2-b]-喹啉（10h-indolo,[3,2-b],quinoline）、異靛藍（Isoindigo）、靛藍（Indigo）、6-(3-氧吲哚啉-2-亞基）吲哚并[2,1-b]喹唑啉-12-酮（6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one）及靛玉紅（indirubin）。通過成分-靶點-通路網絡的構建與分析，有效成分靛玉紅在與靶點、通路的連接度、介度及緊密度中均具有突出優勢，其可能為青黛治療潰瘍性結腸炎的關鍵成分。靛玉紅作為青黛的有效成分，已被證實其具有抗腫瘤和神經保護作用[26，27]。體外研究表明[28-30]，靛玉紅對脂多糖誘導的炎癥細胞具有一定的體外抗炎作用，其作用機制可能為下調IL-6/TNF-α 的表達。另研究表明[31]，靛玉紅可以通過降低TGF-β1 水平，上調INF mRNA 表達，達到抑制炎癥的效果，從而改善三硝基苯磺酸誘導的潰瘍性結腸炎大鼠的癥狀、結腸病理狀態。且高劑量的靛玉紅通過降低TNF-α、IFN-γ 含量，增加緊密連接蛋白ZO-1 表達而發揮其改善腸上皮屏障功能，消除腸道炎癥[32]。

綜上所述，青黛治療UC 的主要活性成分為靛玉紅，主要通過調節RELA、TNF、IKBKB、CASP3、MAPK14、CASP8 等靶點，抑制細胞炎癥反應，改善腸道上皮細胞功能，從而達到治療UC 的目的。