ctDNA 啟動子區甲基化在食管鱗癌診斷中的應用價值

楊志珍，談艷芳

（1.成都中醫藥大學醫學技術學院，四川 成都 610000；2.德陽市人民醫院檢驗科，四川 德陽 618000）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的一個主要亞型，約占食管癌的90%，在全球癌癥相關死亡原因中排名第六[1-3]。ESCC 是由鱗狀上皮細胞分化的高度惡性上皮腫瘤，極具侵襲性，5 年存活率僅約30%[3]。液體活檢最初主要指循環腫瘤細胞的分析，現在擴展到分析腫瘤在體液（主要是血液）中釋放的腫瘤成分，其中就包括腫瘤循環DNA（circulating tumorDNA，ctDNA）[4，5]。游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于體液中的細胞外DNA，來源于正常細胞和凋亡、壞死的腫瘤細胞；而ctDNA 是其中的一部分，約占所有cfDNA 的0.01%～1%，其含量與腫瘤的類型、腫瘤負荷、疾病進展程度相關[6]，既攜帶腫瘤細胞的基本遺傳信息，又攜帶基因突變后的信息，包含點突變、重排、擴增甚至基因拷貝數變異[7]。ctDNA 可來源于壞死的腫瘤細胞、凋亡的腫瘤細胞、腫瘤細胞分泌的外泌體[8]。表觀遺傳學異常是ESCC 形成的重要原因，特別是DNA 甲基化異常與食管鱗癌的發生發展有著密切的關系。DNA 甲基化異常會導致基因的異常表達，使其成為食管鱗癌進展的重要調控因子。有研究報道[9]，相對血清，血漿中ctDNA 甲基化水平能更準確地反映機體ctDNA 甲基化的真實水平。多項研究表明[10-12]，ctDNA 甲基化是當前非侵入性診斷和監測腫瘤動力學的理想生物標志物。然而，ctDNA 甲基化在食管鱗癌發生發展中的研究報道較少。為了獲得關于ctDNA 甲基化的定量和定性信息，已經開發了廣泛的方法。高通量測序（或下一代測序）技術通過一次對數百萬個DNA 片段進行大規模的平行反應而顯著提高了測序能力[13]。酶促甲基化測序（EM-Seq）作為針對5-甲基胞嘧啶（5-mC）的抗體富集甲基化DNA 序列的大規模純化技術，已經成為比以往更快地鑒定甲基化CpG 富集序列的有利工具[14]。有研究表明[15，16]，啟動子區基因甲基化水平隨著腫瘤進展呈現逐漸升高的狀態。本研究利用EM-Seq 技術探討食管鱗癌中ctDNA 啟動子區高甲基化水平狀態，結合相關富集通路，篩選出前4位高甲基化水平基因，或可作為食管鱗癌診斷生物標志物，將為臨床上ESCC 的診斷帶來DNA 甲基化的新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2022 年8 月-2023 年1 月于德陽市人民醫院初診食管鱗癌患者和健康體檢者的外周血樣本各4 份，入選人員年齡48～70 歲，平均年齡（55.50±7.10）歲。所有入選患者確診依據《食管癌診療指南（2022 年版）》[17]、《食管癌TNM分期（第8 版）》[18]和病理診斷。將初次診斷為食管鱗癌且未接受任何治療及發生淋巴及遠處轉移患者作為食管鱗癌診斷組（2 男2 女，代號S1、S2、S3、S4)，將體檢各項指標正常且無任何器質性病變的體檢者作為健康對照組（2 男2 女，代號J1、J2、J3、J4）。立即對收集到外周血樣本進行血漿分離，2000 g離心10 min，分離得到血漿5 ml，轉移到凍存管，-80 ℃儲存，用于后續ctDNA 分離。本研究已獲得德陽市人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的檢測與測序 采用High Pure Viral 核酸試劑盒從存儲的血漿中抽提ctDNA。用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 降解程度以及是否有RNA 污染。用Nanodrop 檢測DNA 的純度（OD260/280 比值），用Qubit 對DNA 濃度進行精確定量，將大于3 ng 且沒有過度基因組DNA 污染的ctDNA 用于文庫構建。使用methylation-insensitive restriction enzyme，MspI 對DNA 樣品進行酶切處理，然后進行末端修復、加A 尾，并連接上所有胞嘧啶均經過甲基化修飾的測序接頭，切膠選擇插入片段長度在150～300 bp 范圍的DNA 片段。隨后進行Bisulfite 處理（采用EZ DNA Methylation Gold Kit，Zymo Research）。經過處理后，未發生甲基化的C 變成U（PCR 擴增后變為T），而甲基化的C 保持不變，最后進行PCR擴增，得到最終的DNA 文庫。使用Qubit3.0 進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μl，進行EM-Seq 測序。文庫構建流程圖見圖1。

圖1 文庫構建流程圖

1.2.2 測序結果評估及數據處理 使用Illumina HiSeq 2500 測序儀構建Cluster 生成和第一向測序引物雜交。將帶著Cluster 的flow cell 上機測序，選擇Paired-end 程序，進行雙端高通量測序，使用Illumina 公司提供的數據收集軟件進行測序過程的控制并實時數據分析。使用FastQC 對測序序列質量進行評估，評估原理：應用測序質量Q值進行評估，Q值與測序錯誤E 值之間關系為：Q=-10log10E。評價標準是各樣本獲得約20 G 的測序數據，測序讀長150 bp，單堿基質量＞20 的比例≥90%。為了保證數據質量，首先，對下機的raw reads 利用fastqc 進行質控，隨后cutadapt 過濾低質量數據，得到clean reads。對raw reads 截去低質量reads，得到的高質量Reads 或堿基，稱為clean data。

1.2.3 基因比對及甲基化水平獲取分析 使用bwameth.py[19]（bwa-mem2 version 0.2.5）將樣本clean data 和參考基因組hg38（人）進行比對。隨后采用MethylDackel 軟件進行CpG 甲基化位點檢測。計算其甲基化水平，公式為：ML=mC/（mC+umC）。其中ML 為甲基化水平，mC 和umC 分別代表甲基化C和未甲基化C 的個數。使用20 Kbp/bin 分序列環境計算各個bin 內甲基化水平。通過MethylDackel 工具提取每個樣本甲基化情況，利用DSS R 包篩選閾值為Cutoff 10%和P＜0.05 進行組間差異甲基化區域分析。使用ChIPseeker 軟件對其進行功能區域注釋，當差異甲基化區域（differentially methylated region，DMR）與特定基因功能元件有重疊時，將相應的基因挑選出來，稱為DMR 相關基因。對Promoter 上基因集行GO、KEGG、Reactome 富集分析。甲基化分析流程圖見圖2。

圖2 甲基化分析流程圖

2 結果

2.1 甲基化水平分析圖表

2.1.1 各位點甲基化水平 對于鑒定出的甲基化位點，計算其甲基化水平，統計各個序列環境（CG、CHG、CHH，H 代表A 或者T）下C 位點的甲基化水平，見表1。

表1 各序列C 位點的甲基化水平

2.1.2 各樣本甲基化水平的關系 對各樣本間使用20 Kbp/bin 分序列環境計算各個bin 內甲基化水平后做Pearson 相關性分析，顯示相關系數約在1左右，表明樣本之間甲基化模式的相似度較高，見圖3。

圖3 樣本甲基化相關性分析圖

2.1.3 甲基化主成分分析 對各樣本間進行甲基化主成分分析（PCA），橫坐標表示第一主成分的分量，縱坐標表示第二主成分的分量。圖中橢圓表示樣本聚集中心，圖中點與點之間的距離反應樣本間相似性或者差異性。圖中可見健康對照組與食管鱗癌診斷組數據擬合性較高，同時相同分組間樣本差異較小體現了數據的穩定性，見圖4 。

圖4 樣本間甲基化情況PCA 分析結果圖

2.2 差異甲基化基因篩選及富集通路分析 通過兩組間差異甲基化水平比較分析，最終得到差異甲基化區基因共9354 個，其中有1136 個位于Promoter 上。Promoter 區診斷組甲基化水平高于健康對照組甲基化水平的基因有553 個。結合GO、KEGG、Reactome 功能富集與食管鱗癌相關的排名前4 位基因分別為AXIN1、EPS15、CACTIN、E2F1，基因所在染色體位置見表2，基因相關富集通路見表3。

表2 基因所在染色體位置

表3 基因相關富集通路

3 討論

ctDNA 甲基化檢測在ESCC 檢測中前景廣闊。本研究使用了高通量EM-Seq 對4 對ESCC 樣本和健康樣本的全基因組ctDNA 甲基化水平進行檢測。EM-Seq 鑒定出的DMR 幾乎跨越了整個基因組，具有足夠的深度和高分辨率，且DMR 的數量遠遠大于傳統方法檢測到的數量，表明該方法代表了用于ctDNA 甲基化組研究的有效方法[20]。本研究中，通過EM-Seq 共鑒定了9354 個差異表達基因，其中位于啟動子區診斷組甲基化水平高于健康對照組甲基化水平的基因有553 個。通路分析突出了許多與ESCC 癌變密切相關的通路，如DNA 損傷修復、Wnt 信號通路、EGFR 信號通路和NF-kB 信號通路，為理解ESCC 發病的分子機制提供了新的線索。

鑒于ctDNA 甲基化在啟動子區的影響，結合富集分析和通路分析，DMR 在與DNA 損傷修復、Wnt信號通路、EGFR 信號通路和NF-kB 信號通路和許多生物學通路相關的基因中被鑒定出來，這些基因與癌變密切相關。因此，本研究選擇了診斷組甲基化水平高于健康對照組甲基化水平前4 位基因進行進一步研究：AXIN1、EPS15、CACTIN、E2F1。AXIN1 是一種多結構域的支架蛋白，與多種疾病的發生和發展有關，如細胞增殖、分化、凋亡和癌變等，AXIN1通過Wnt 信號通路促使腫瘤進展在胃癌中尚有報道[21]。AXIN1 可能通過Wnt 信號通路促使了食管鱗癌的發生。EPS15 是表皮生長因子受體（EGFR）的一種蛋白酪氨酸激酶底物，參與EGFR 的內吞和分泌，通過調節細胞內轉運的多功能銜接蛋白下調生長因子信號的傳導，對一些腫瘤患者的發生等產生影響[22]。EPS15 在部分腫瘤細胞及組織中表達異常，與腫瘤的形成與發展可能相關[23]。CACTIN是剪接體復合物C 的組分，參與細胞遷移、調控固有免疫應答反應，有助于調節NF-KB 靶基因的轉錄活化，在胃癌細胞中尚有研究[24，25]。E2F1 為轉錄因子家族的重要成員，在細胞周期進展、DNA 復制、DNA 修復、細胞分化、增殖與凋亡等細胞過程中起調控作用，E2F1 可促腫瘤發生或促凋亡，是許多人類癌癥中突變的主要腫瘤抑制因子[26]。本研究中E2F1 可能通過DNA 的損傷修復調節食管鱗癌進展。

綜上所述，全基因組ctDNA 啟動子區的食管鱗癌基因AXIN1、EPS15、CACTIN 和E2F1 高甲基化水平可能參與了食管鱗癌的發病機制，可為篩選ESCC 診斷生物標志物作參考。雖然本研究探討了食管鱗癌基因AXIN1、EPS15、CACTIN 和E2F1 高甲基化在食管鱗癌的診斷中的應用價值，但還需要擴大樣本進行大規模實驗來進一步驗證其作為診斷標志物的具體應用價值，以及更多的細胞試驗進一步探索相關通路在食管鱗癌發生發展中扮演的角色。