酒煎瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病多靶點作用機制的交互網絡分析

劉明陽，張洋，高麗，董振飛，曾以德

山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

冠心?。–HD）是由冠狀動脈粥樣硬化引發管腔狹窄或閉塞所導致的器質性心臟疾病[1]?！吨袊难芙】蹬c疾病報告》2020[2]顯示，中國心血管病患病率處于持續上升階段，截至2020 年，CHD 患者數量可能超1 139 萬?！端貑枴づK氣法時論》記載：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛?！薄额愖C治裁·胸痹》記載：“胸痹，胸中陽微不運，久則陰乘陽位，而為痹結也?！焙笫莱ⅰ瓣栁㈥幭摇笨醋鰿HD 的病機，胸中陽氣衰微日久，寒邪、水飲、痰濁、血瘀等邪實上乘，痹阻胸陽，不通則痛?！督饏T要略·胸痹心痛短氣病脈證治》記載：“胸痹不得臥，心痛徹背者，瓜蔞薤白半夏湯主之?！贬槍μ禎耩鰷?、陽氣不振的胸痹，可用具有通陽行氣、化痰散結功效的酒煎瓜蔞薤白半夏湯進行治療。研究表明，瓜蔞薤白半夏湯治療CHD 痰瘀互結證取得了良好療效[3]。楊衛明[4]對56 例CHD 患者使用瓜蔞薤白半夏湯治療，臨床療效優于常規治療方案。酒在本方中體現出了散痹通陽、載藥上行等作用。本研究遵循《金匱要略》中的方法，使用瓜蔞、薤白、清半夏、米酒同煮，通過臨床觀察證實酒煎療效更優。中藥方劑的藥物成分多不明確，作用機制往往不清楚，限制了中醫藥的發展，也難以體現中藥復方多靶點、多通路的作用特點[5]。網絡藥理學可以闡述中藥復方多成分、多靶點的作用機制，有效彌補既往研究中單靶點、低選擇性的不足[6]。但是在研究方法中仍存在一些技術性缺陷，嚴重影響網絡藥理學虛擬篩選的準確性[7]。近年來，質譜分析技術發展迅速，其可更客觀地分析中藥復方煎劑中的化學成分[8]。本研究采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜儀（UPLC-Q-TOF/MS）分析酒煎瓜蔞薤白半夏湯的化學成分，運用網絡藥理學研究方法和分子對接手段，對該方治療CHD 的作用機制進行分析，為深入探究酒煎瓜蔞薤白半夏湯治療CHD的藥理作用及治療機制提供借鑒和參考。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑1260 型高效液相色譜儀和6230 型液相質譜聯用儀（美國Agilent 公司），HALO 90A C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7μm，美國AMT 公司），FA1604N 型0.1 mg 電子天平秤（上海精密科學儀器有限公司）， Centrifuge 5420 微量離心機（德國Eppendorf 公司）， 明澈D24 UV 純水儀（Merck Millipore），YM-080S 超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）。甲醇、乙腈、甲酸（上海麥克林生化科技股份有限公司），純度均為LC-MS 級。

1.2 中藥飲片瓜蔞、薤白、清半夏飲片均由河北康益強藥業有限公司生產，所有藥材均由山東中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室梁曉東副教授進行鑒定和評估。

2 研究方法

2.1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯制備精確稱取瓜蔞24 g、清半夏12 g、薤白9 g 及米酒700 mL。上述材料置于煎藥砂鍋中浸泡1 h 后煎煮1 h，倒出藥液，紗布過濾，再次加入米酒700 mL，重復以上操作。合并2 次濾液并濃縮至250 mL，制備成酒煎瓜蔞薤白半夏湯標準煎液[3]。

2.2 質譜供試液制備取酒煎瓜蔞薤白半夏湯標準煎液1 mL，放入真空冷凍干燥機中，冷阱盤管溫度設置為-80 ℃，真空度1 Pa 以下。48 h 后取出凍干樣品，精密加入100% 甲醇1 mL，超聲40 min，12 000 r/min 離心12 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得酒煎瓜蔞薤白半夏湯質譜供試液。

2.3 液質聯用成分分析①色譜條件。HALO 90A C18 色譜柱，流動相-0.1% 甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B）梯度洗脫（0～10 min，2%～10%B；10～20 min，10%～20%B；20～25 min，20%～45%B；25～30 min，45%～95% B；30～35min，95%～100% B），流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長為265 nm、254 nm、310 nm、325 nm，進樣量2 μL。②質譜條件。采用電噴霧離子源（ESI），離子源電壓3.2 kV，毛細管加熱溫度為350 ℃，霧化氣壓35 psig，碎裂電壓175 V，離子源溫度350 ℃，干燥氣流量8 L/min，質譜掃描范圍m/z50～1 500，鞘氣、輔助氣均為氮氣。按照以上條件進行設置，對正、負離子模式分別檢測，獲取總離子流圖。

2.4 酒煎瓜蔞薤白半夏湯化學成分鑒定通過查詢中國知網（CNKI）、PubMed 數據庫組建瓜蔞、薤白、清半夏的化學成分數據庫，通過中醫藥綜合數據庫（TCMID）、 有機小分子生物活性數據庫（PubChem）、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索中藥相關化學成分信息，通過正離子模式下[M+H]+、[M+Na]+及負離子模式下[M-H]-、[M+HCOO]-加合分子離子的精確理論質荷比，對色譜峰各成分進行精確指認。

2.5 酒煎瓜蔞薤白半夏湯化學成分篩選與分子結構獲取通過PubChem 數據庫對酒煎瓜蔞薤白半夏湯組成藥物的化學成分進行類藥性識別，篩選出結構明確、有藥理作用的成分作為本方的活性成分。通過PubChem 數據庫檢索活性成分對應的分子結構，將分子結構下載并保存為SDF 格式。

2.6 酒煎瓜蔞薤白半夏湯作用靶點篩選將“2.5”中得到的SDF 格式文件導入Swiss 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），研究物種選擇“Homo sapiens”，檢索出活性成分的作用靶點，去重后即為酒煎瓜蔞薤白半夏湯的作用靶點。

2.7 疾病相關靶點篩選以“coronary heart disease”為關鍵詞在Gene Cards 數據庫（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/）中進行檢索，Score≥10 作為篩選的條件。將結果取交集后獲得CHD 的相關靶點。

2.8 藥物-疾病作用靶點篩選在韋恩圖繪制工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/#/）中分別錄入酒煎瓜蔞薤白半夏湯和CHD 的作用靶點，繪制韋恩圖，取交集后的共同靶點即為酒煎瓜蔞薤白半夏湯治療CHD 的作用靶點。

2.9 藥物-活性成分-靶點網絡模型構建及分析將中藥的活性成分及獲取的潛在基因作用靶點分別導入Cytoscape 3.8.2 軟件，構建中藥-活性成分-靶點互作網絡，使用Network Analyzer 功能對主要活性成分進行分析，節點的大小代表度值（degree）的高低。

2.10 蛋白質-蛋白質互作（PPI）網絡建立及功能富集分析將作用靶點上傳至Metascape 在線分析網站（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），建立PPI 網絡及基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，并繪制氣泡圖進行可視化。將GO 富集分析中的生物過程、細胞成分、分子功能的相關靶點錄入OmicStudio 網站（https：//www.omicstudio.cn/tool）進行Upset 分析并繪圖，篩選酒煎瓜蔞薤白半夏湯調控CHD 的主要方式與核心靶點。

2.11 分子對接使用TCMSP 數據庫下載核心活性成分的3D 結構，保存為SDF 格式，使用OpenBabel軟件將文件格式轉換為mol2。 在PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）中檢索基因靶點，物種篩選條件為“Homo sapiens”，將核心靶點的3D 結構保存為PDB 格式，使用PyMOL viewer 軟件打開并去除水分子及配體。使用AutoDockTools 軟件對靶點的3D結構進行加氫鍵處理，設置grid box 覆蓋全部結構，運行Autogrid 程序進行第一次對接運算，使用Genentic Algorithm 算法進行運算后，運行AutoDock程序進行第二次對接運算。統計結合能，若結合能≤-5 kJ/mol 即可認為對接成功，將篩選出的結合位點保存為PDBQT 格式文件后，使用PyMOL viewer 軟件進行可視化處理。

3 研究結果

3.1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯化學成分分析供試液正負離子模式的總離子流色譜圖（TIC）見圖1。在正、負離子模式下從酒煎瓜蔞薤白半夏湯中共分析鑒定出76 個化學成分，包含正離子模式下鑒定出的59 個化學成分及負離子模式下鑒定出的17 個化學成分。

圖1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯UPLC-Q-TOF/MS 分析的TIC

3.2 藥物-疾病共同作用靶點酒煎瓜蔞薤白半夏湯組成藥物中瓜蔞作用靶點603 個，薤白作用靶點140 個，清半夏作用靶點623 個，去重后得到作用靶點751 個。CHD 靶點取交集，共得到靶點1 249 個。繪制韋恩圖（圖2），酒煎瓜蔞薤白半夏湯與CHD 的靶點取交集后獲得潛在作用靶點190 個。

圖2 藥物-疾病作用靶點韋恩圖

3.3 中藥-活性成分-靶點網絡構建將瓜蔞、薤白、清半夏的活性成分及作用靶點輸入Cytoscape3.8.2軟件后繪制網絡圖，190 個潛在作用靶點與所對應的52 個活性成分參與網絡圖繪制，見圖3。潛在作用靶點相關聯的活性成分中，10 個成分能與20 個以上的靶點相連接，推測這10 個成分是酒煎瓜蔞薤白半夏湯發揮CHD 治療作用的主要活性成分，見表1。

表1 酒煎瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分信息表

圖3 中藥-活性成分-靶點網絡圖

3.4 PPI 網絡及功能富集分析酒煎瓜蔞薤白半夏湯的PPI 結果顯示，其中94 個核心靶點均有相互作用，300 條邊構成了各蛋白之間的互作網絡，見圖4。其中白細胞介素（IL）-1β、 磷酸肌醇3 激酶α（PIK3CA）、雌激素受體（ESR）2 等靶蛋白關聯度排名較高。GO 富集分析顯示，生物過程結果主要涉及激素反應、對炎癥反應的調節作用、細胞遷移的正向調控等；細胞組成結果主要集中于膜筏、膜側等；分子功能結果主要涉及絲氨酸水解酶活性、脂質結合、血紅素結合等。KEGG 功能富集分析結果主要涉及脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、cGMP-PKG 通路、鈣信號通路、PPAR 信號通路，見圖5。Upset 分析顯示，激素反應與脂質結合的相關靶點存在高度重合，12 個共同靶點作為關鍵靶點，分別為雄激素受體（AR）、ESR1、ESR2、核受體亞家族1H3（NR1H3）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、過氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARD）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、血小板活化因子受體（PTAFR）、維生素D 受體（VDR）、維甲酸X 受體α（RXRA）、核受體亞家族3C1（NR3C1）、核受體亞家族3C2（NR3C2），見圖6。

圖4 PPI 網絡圖

圖5 GO 與KEGG 富集分析示意圖

圖6 激素反應與主要細胞成分及分子功能靶點交互關系

3.5 分子對接對“3.4”篩選出的12 個關鍵靶點獲取PDB ID 和靶點結構，再分別與有效成分進行對接。結合能≤-5 kJ/mol 表示有較好的結合活性，有效成分中環（亮氨酸-酪氨酸）、美迪紫檀素、肉葉蕓香堿顯示結合能力較好，與關鍵靶點進行了11 次成功對接，見表2。分子對接的可視化結果見圖7。

表2 關鍵靶點與有效成分分子對接信息表

圖7 分子對接示意圖

4 討論

本研究將751 個酒煎瓜蔞薤白半夏湯作用靶點與1 249 個CHD 靶點取交集，獲得藥物-疾病潛在作用靶點190 個。結果顯示，52 個活性成分與潛在作用靶點有對應關系，通過中藥-活性成分-靶點網絡分析發現，美迪紫檀素、肉葉蕓香堿、環（亮氨酸-酪氨酸)、亞油酸、石榴酸為酒煎瓜蔞薤白半夏湯影響CHD 疾病靶點的主要活性成分。其中，美迪紫檀素是一種具有生物活性的紫檀香酚，通常被應用于關節炎、骨質疏松等疾病的治療[9]。炎癥反應在CHD發病全程都起到重要的作用，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 等促炎因子的上升被證實與CHD發病相關[10]。有研究發現，美迪紫檀素可通過下調各種促炎細胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-17A，上調抗炎細胞因子IL-10，發揮調節炎癥細胞活性的作用[11]。肉葉蕓香堿是一種具有抗癌和抗炎作用的天然生物堿。有研究指出，肉葉蕓香堿通過增加一氧化氮（NO）的釋放舒張血管，抑制腎上腺素受體功能與鈣通道激活所導致的血管收縮[12]。而NO 和鈣通道抑制劑被認為對CHD 有治療作用[13]。環（亮氨酸-酪氨酸）是一種具有生物活性的環狀二肽，有抑制血小板聚集的作用，能通過激活PI3K/Akt 通路產生抗炎作用，有效治療CHD[14]。亞油酸是一種不飽和脂肪酸，增加亞油酸的攝入可以降低CHD 等心血管疾病導致的病死率[15]。亞油酸也具有抗氧化應激與抗炎的作用，能夠調控血清中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，降低血清中MMP-9 水平有利于CHD 疾病轉歸[16]。有研究發現，石榴酸可通過激活PPARG 調控CHD 的發展[17-18]。因此，酒煎瓜蔞薤白半夏湯可能通過美迪紫檀素、肉葉蕓香堿、環（亮氨酸-酪氨酸）、亞油酸、石榴酸等活性成分影響CHD 的疾病進程。

為深入挖掘酒煎瓜蔞薤白半夏湯調控CHD 的潛在作用機制，本研究進行了GO、KEGG 富集分析。有研究顯示，cGMP-PKG 通路異?？梢鸲喾N心血管疾病[19]。通過激活cGMP-PKG 通路并上調LDLR基因表達，清除過多冠狀動脈內皮細胞的低密度脂蛋白（LDL）可緩解內皮損傷[20]。鈣通道拮抗劑可抑制血管平滑肌中的鈣通道引發的血管收縮，通過擴張血管調控CHD[21]。

在本研究中，Upset 分析結果顯示，激素調控與脂質結合存在關聯，其中AR、ESR2、PPARA 等12 個靶點被認為是核心靶點。通過分子對接對12 個核心靶點與酒煎瓜蔞薤白半夏湯主要活性成分進行分析，結果顯示其中6 個核心靶點與以上3 個活性成分成功對接，包括PPARA、RXRA、AR、PPARG、PPARD、ESR2。其中，PPARG 與RXRA 屬于核受體超家族，是動脈粥樣硬化發病機制中的關鍵參與者[22]。相關研究證明，PPARG 與RXRA 在CHD 患者的巨噬細胞和平滑肌細胞中表達水平均顯示出下調趨勢，相關基因的低表達不利于CHD 患者的愈后[23]。PPARA、PPARG、PPARD 是脂蛋白代謝、能量平衡、炎癥反應的主要調節因子，可獨立或通過相互作用導致機體脂代謝異常，提高CHD 的發病風險[24]。雄激素也被證實對CHD 有調控作用，能夠降低CHD易感基因ADTRP 的表達，在心血管疾病中起保護作用[25]。ESR2 可與雌激素進行高親和力的結合，雌激素已被證明可以通過其受體ESR2 下調HUVEC 中糖蛋白（GP130）的表達，而GP130 是IL-6 轉信號通路中的重要信號轉導因子，在動脈粥樣硬化的慢性炎癥中起關鍵作用[26]。雌激素也可通過其G 蛋白耦聯受體GPER 和SR-BI 抑制LDL 轉胞吞作用，可對CHD 起到預防和早期治療作用[27]。本研究中，美迪紫檀素、肉葉蕓香堿、環（亮氨酸-酪氨酸）均與以上靶點具有良好的結合能力，驗證了這3 種成分可能通過影響激素反應調節脂質結合，通過酒煎瓜蔞薤白半夏湯調控CHD 對多個信號通路發揮作用。

綜上，本研究運用UPLC-Q-TOF/MS 技術對酒煎瓜蔞薤白半夏湯的活性成分進行檢測，運用網絡藥理學與分子對接技術預測酒煎瓜蔞薤白半夏湯可能通過激素反應、調節脂質結合的方式干預CHD，為后續復方藥物的基礎研究和CHD 的臨床治療提供數據支持和理論保障。