特發性肺纖維化和炎癥性腸病共同核心基因特征及其生物學機制的鑒定

婁嬌嬌,王浩冉,黃鳳祥,王煥勤,康燕,王起龍,馬開,喬瑞萍,苗麗君

(鄭州大學第一附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科,河南 鄭州 450052)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、致死性間質性肺疾病,中位生存期為3～5 a[1]。IPF的診斷需要在合適的臨床條件下通過高分辨率CT(high-resolution computed tomography,HRCT)或組織學檢查發現典型的間質性肺炎,且缺乏明確的病因[2]。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種描述多種胃腸道炎癥性疾病的廣義術語,主要類型是克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)[3]。IBD在肺部的腸外表現包括上氣道疾病伴狹窄、大氣道疾病伴炎癥、支氣管擴張、炎癥性小氣道疾病、肺實質疾病、血管疾病、間質性肺疾病、肉芽腫性肺疾病和嗜酸性肺炎[4-6]。

有研究表明IBD與IPF相關,IBD患者發生IPF的風險更高[7-8]。盡管近年來IBD與IPF的相關性受到相當多的關注,但相關研究仍較少,需要進一步探索。本研究的目的是通過生物信息學分析確定與IPF和IBD相關的核心基因。對核心基因進行了富集分析,并進一步分析了與這些基因相關的轉錄因子(transcription factors,TFs)及微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs),旨在探索IPF和IBD相似的遺傳特征和潛在生物學機制,為進一步研究IPF和IBD共同發病機制提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 資料下載

通過公共開放的基因表達綜合數據庫(gene expression omnibus,GEO)(http://h-p.www.ncbi.nlm.nih.gov.zzulib.vpn358.com/gds/)篩選了與IPF和IBD相關的轉錄組測序數據集,其中IPF的基因表達譜芯片數據集為GSE53845和GSE110147,IBD基因表達譜芯片數據集為GSE59071和GSE75214。使用GSE110147和GSE75214篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),使用GSE53845和GSE59071進行樞紐基因表達驗證。

1.2 差異表達基因篩選

首先,根據對應平臺中對數據集的注釋文檔,使用R軟件(4.2.1)“merge”包將獲得的4個數據集中的探針與基因符號進行匹配。然后,利用R中的“limma”包對4個數據集進行背景校準、歸一化和log2轉換。當多個探針對應同一基因時,計算平均值以確定其表達量。對于GSE110147和GSE75214,使用R中的“limma包”通過設置條件截斷標準|log2FC|>1和P<0.05來篩選DEGs。使用R軟件制作熱圖和火山圖來可視化這些DEGs。將IPF和IBD的DEGs取交集,得到共同的DEGs,通過構建維恩圖顯示重疊的DEGs。

1.3 差異基因的功能富集分析

研究通過使用“clusterProfiler”包和“GOplot”包對DEGs進行基因本體論(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析明確共同的DEGs的潛在生物學功能。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建及核心基因的鑒定

STRING是一個利用實驗數據和計算預測方法預測蛋白質相互作用的數據庫。此研究使用STRING(http://string-db.org.zzulib.vpn358.com/)構建了常見DEGs的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。將置信度評分設置為>0.4,隱藏網絡中斷開的節點。利用Cytoscape(3.9.1)的CytoHubba和MCODE功能PPI網絡復合體中發現關鍵基因。MCODE默認設置;在CytoHubba中從12種算法中隨機選取5種算法計算前15個關鍵基因并且通過在線維恩圖工具(http://h-p.bioinformatics.psb.ugent.be.zzulib.vpn358.com/webtools/Venn/)將5種算法的運行的結果取交集確定核心基因。

1.5 核心基因表達的驗證

使用IPF數據集GSE53845和IBD數據集GSE59071進一步驗證這些核心基因在兩種疾病中的表達水平,差異表達水平的比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。通過R軟件“ggpubr”包獲得的小提琴圖譜顯示了不同組間核心基因的表達水平。對核心基因進行GO富集分析和KEGG分析。

1.6 TFs-核心基因相互作用構建及TFs-miRNAs-核心基因網絡預測

TFs是基因表達調控中的關鍵分子,可以與特定的DNA序列結合。JASPAR(http://h-p.jaspar.genereg.net.zzulib.vpn358.com)是一個開放訪問的TFs數據庫,TFs結合圖譜存儲6個分類群的多個物種的TFs結合位點頻率矩陣。使用Networkanalyst工具(version 3.0, http://www.networkanalyst.ca.zzulib.vpn358.com/)評估JASPAR數據庫中TFs基因與IPF和IBD共同的核心基因的交互作用。miRNAs可通過與靶mRNA結合來調控靶基因的表達。了解TFs與miRNAs之間的調控轉錄網絡將有助于研究不同生理和疾病條件下基因表達的機制。使用NetworkAnalyst 3.0軟件分析TFs-miRNAs共調控網絡,并用Cytoscape軟件對結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 IPF和IBD中共同的DEGs

將GSE110147數據集中的22例IPF樣本與11例正常對照進行比較,得出3 370個DEGs。將GSE752141數據集中的172例IBD樣本與22例正常對照進行比較,篩選出了460個DEGs。通過火山圖和熱圖對2個數據集的DEGs進行可視化(圖1)。此外,利用維恩圖對GSE110147和GSE752141之間的共同DEGs進行分析。結果顯示,在這2個數據集中,有90個基因的表達發生了顯著變化,其中上調基因67個,下調基因23個。

A為GSE110147 DEGs的火山圖;B為GSE752141 DEGs的火山圖;C為GSE110147 DEGs的熱圖;D為GSE752141 DEGs的熱圖。

2.2 IPF和IBD中共同的DEGs的GO和KEGG富集分析

使用R軟件中的“cluster profiler”包對這些共同的DEGs進行GO分析和KEGG通路富集,進一步探索潛在的生物信息。分析結果表明,在生物過程(biological process,BP)方面,這些基因主要與生長、細胞外基質組織、細胞外結構組織的負調控相關。在細胞成分(cellular component,CC)方面,基因主要與內質網管腔、含膠原的細胞外基質相關。最后,在分子功能(molecular function,MF)方面,這些基因主要與細胞外基質結構成分、內肽酶活性相關(圖2A、2B)。此外,KEGG分析顯示,DEGs主要富集于黏著斑、人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt信號通路、ECM-受體相互作用、礦物質吸收(圖2C、2D)。

A為常見DGEs的GO富集分析條形圖;B為常見DGEs的KEGG富集分析柱狀圖;C為常見DGEs的GO富集分析氣泡圖;D為常見DGEs的KEGG富集分析氣泡圖。

2.3 PPI網絡構建與核心基因鑒定

為了進一步探索共同DEGs編碼的蛋白質之間的潛在相互作用,并識別核心基因,此研究利用STRING數據庫對DEGs進行了PPI網絡分析(圖3A)。使用Cytoscape 3.9.1軟件進行網絡分析和可視化。CytoHubba插件通過5種算法得到7個基因(SPP1、COL1A1、POSTN、MMP1、MMP7、COL3A1、COL6A3)(圖3B)。然后,應用MCODE插件進行模塊分析(過濾標準:degree cut-off=2;node score cut-off=0.2;k-core=2;max depth=100),在網絡中得到4個模塊,如圖3C～G所示。將CytoHubba獲得的基因與MCODE獲得的基因取交集,得到6個樞紐基因:SPP1、COL1A1、POSTN、MMP7、COL3A1、COL6A3。

A為STRING構建的常用DEGs的PPI網絡;B為通過5種算法鑒定的7個候選基因;C～F為顯著性基因模塊及模塊基因。

2.4 核心基因的驗證

使用另外2個數據集,IPF的GSE53845和IBD的GSE59071分析核心基因的表達水平對核心基因表達水平的置信度進行驗證。結果顯示,在GSE53845中,與健康組相比,IPF組的所有核心基因均顯著上調(圖4A)。同樣,在GSE59071中,與健康組相比,IBD組的所有核心基因均顯著上調(圖4B)。

A為GSE110147數據集中IPF組與對照組的核心基因表達;B為GSE75214數據集中IBD組與對照組的核心基因表達;*P<0.05; **P<0.01;***P<0.001;ns為P>0.05。

2.5 核心基因的GO和KEGG富集分析

GO富集分析顯示,樞紐基因主要集中在細胞外基質組織、細胞外結構組織、內質網管腔、含膠原的細胞外基質、細胞外基質結構成分。KEGG富集分析顯示,樞紐基因主要集中于ECM-受體相互作用、黏著斑、人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt信號通路(圖5)。

A為核心差異基因GO富集分析的條形圖、氣泡圖和圓圖;B為核心差異基因KEGG富集分析的條形圖、氣泡圖和圓圖。

2.6 核心基因-TFs和核心基因-miRNAs相互作用網絡

對于核心基因,通過NetworkAnalyst平臺構建了包含25個交互作用、32個TFs和6個核心基因的TFs調控網絡(圖6A)。TFs-miRNAs調控網絡揭示了miRNAs和TFs之間的關系以及與核心基因的相互作用。通過NetworkAnalyst構建TFs-miRNAs調控網絡,通過Cytoscape的CytoHubba插件的MCC算法得到85個miRNAs和34個TFs(圖6B)。

A為TFs-核心基因網絡圖;B為TFs-miRNAs調控網絡網絡圖。

3 討論

IPF是一種以成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化和細胞外基質過度沉積為特征的慢性進行性纖維化肺疾病[9]。IBD被越來越多的認為是一種復雜的疾病,可由多種原因引起或加重,在一般人群中的發病率呈上升趨勢[10]。IPF與慢性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、EB病毒感染、IBD、Whipple病相關[11]。然而,目前很少有研究從基因水平探討IPF和IBD的共同發病機制,因此本研究旨在探討IPF與IBD之間的關系。研究使用來自IPF(GSE110147)和IBD(GSE752141)的樣本數據集獲得了90個共同的DEGs?；贑ytoscape的MCODE插件和CytoHubba插件,在PPI網絡中篩選出6個重疊的DEGs作為核心基因,包括SPP1、COL1A1、POSTN、MMP7、COL3A1、COL6A3。這6個基因在IPF和IBD患者中均表達上調,提示這些基因可能在IPF和IBD的發病機制中發揮重要作用。GO富集分析結果顯示,樞紐基因主要富集于細胞外基質組織、細胞外結構組織、內質網管腔、含膠原的細胞外基質、細胞外基質結構成分。KEGG富集分析顯示,核心基因主要集中在ECM-受體相互作用、黏著斑、人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt信號通路。其中,ECM-受體相互作用和黏著斑已被證實與IPF的調控密切相關,PI3K-Akt通路通過其促炎作用和活化T細胞參與IBD的發病[12-14]。

分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1,SPP1)又稱骨橋蛋白(osteopontin,OPN)樣蛋白,是一種多功能蛋白,表達于活化的巨噬細胞、T細胞、破骨細胞、肝細胞、平滑肌、內皮細胞和上皮細胞,可介導細胞黏附、趨化、信號轉導和組織修復等多種生物學功能[15-17]。SPP1/OPN是IPF的標志物,在人類IPF中表達上調,對人類IPF起促進作用[18-19]。既往研究表明,SPP1/OPN在IBD患者腸上皮細胞和炎癥腸組織中浸潤的免疫細胞中表達增加[20-21]。IPF患者肺組織中OPN與MMP7共定位,OPN誘導MMP7的表達和活性,而OPN被MMP7切割和激活[19,22]。MMP7可以特異性切割核心蛋白聚糖,從而從復合物中釋放轉化生長因子-β[23]。IBD中MMP-7的異常升高與黏膜糜爛、結構組織改變和炎癥浸潤有關,MMP-7的過度表達有助于IBD的腸屏障損傷[24-25]。

與非IBD人群相比,IBD患者黏膜轉化生長因子TGF-β水平升高[26-27]。COL1A1和COL3A1是細胞外基質相關基因,在IPF發病機制中發揮重要作用。IPF的特征是促纖維化細胞因子TGF-β1的上調,TGF-β1與包括膠原(主要是Ⅰ型和Ⅲ型)在內的ECM蛋白的產生增強相關[27]。COL3A1編碼Ⅲ型膠原蛋白α1鏈,COL1A1編碼Ⅰ型膠原蛋白α1[28]。COL1A1在IBD患者的炎癥組織中表達增加[29]。由POSTN基因編碼的骨膜蛋白主要通過PI3K/Akt和FAK途徑與蛋白受體相互作用,導致組織重塑、纖維化、炎癥等多種病理過程[30]。骨膜蛋白在IPF患者中表達增加,定位于活性纖維化區域[31]。TGF-β和IL-13可促進纖維化肺實質中骨膜蛋白的表達[32]。既往研究表明,骨膜蛋白激活NF-κB信號通路介導腸道炎癥,提示骨膜蛋白是IBD的潛在治療靶點[33]。

TFs在基因表達調控中發揮重要作用。在TFs-基因互作網絡中,SPP1、MMP7和COL6A3與其他TFs基因的相互作用率較高。SPP1受10個TFs基因調控,MMP7和COL6A3受9個TFs基因調控。調控因子中,HINFP、NFYA、POU2F2、YY1、FOXL1和FOXC1是TFs-基因相互作用網絡中程度最高的調控因子。HINFP、POU2F2、YY1、FOXL1和FOXC1均靶向SPP1。TFs和miRNAs均可調控靶基因的表達,且相互調控,在多種生物過程和疾病的分化中發揮重要作用[34]。通過TFs-miRNAs共調控網絡,了解到核心基因、TFs和miRNAs之間的關系。在已鑒定的TFs中,JUN的級別最高,為4級。JUN蛋白包含c-Jun、JunB和JunD,其中c-Jun是最有效的轉錄激活因子,一項研究表明,IPF中異常的致病性成纖維細胞需要c-JUN來快速增殖[35-36]。在IBD患者中,嚴重受損組織中c-Jun基因表達水平高于外觀正常組織[37]。在miRNAs中,hsa-miR-301b, hsa-miR-301a, hsa-miR-29c, hsa-miR-29b和hsa-miR-29a的表達度最高,程度為3,且均靶向COL6A3。有研究表明,COL6A3是TGF-β/Smad信號通路的靶點,可能是IPF的潛在生物標志物[38-39]。在IBD中,COL6A3編碼的COL6α3鏈在CD和UC患者的腸組織中升高[40]。

4 結論

通過先進的生物信息學方法,建立了IPF和IBD的PPI網絡,并篩選了SPP1、COL1A1、POSTN、MMP7、COL3A1、COL6A3等樞紐候選基因。同時,通過生物信息學分析,分析了分子調控網絡中的信號通路。本研究發現了IPF和IBD的共同靶點和功能通路,并通過可視化網絡圖更清晰地表達了兩者的相互作用。這些結果表明IPF與IBD之間存在相似之處和潛在的關系,可作為未來研究的理論基礎,并為診斷和治療提供新的潛在靶點。然而,此研究也存在一些局限性。首先,目前的研究只涉及6個核心基因。其次,TFs-基因和TFs-miRNAs-基因相互作用網絡僅基于公共數據庫的預測,缺乏對IPF和IBD中核心基因、TFs和miRNAs調控的分子機制的詳細研究。因此,這些樞紐基因和miRNAs在IPF和IBD發生中的分子機制有待進一步研究。