秦川牛宰后成熟期間BSG對MAPK信號通路及細胞凋亡的影響

蘇曉鳳，李亞蕾，羅瑞明

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏 銀川 750021）

動物剛被屠宰放血后，線粒體仍有一定活性，但隨著氧和營養物質供應的終止，細胞內氧化和抗氧化平衡體系被打破，活性氧大量累積，必然造成肌細胞的損傷、凋亡[1]?；A免疫球蛋白（basigin，BSG）是一種線粒體損傷蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，參與許多生理過程。研究表明，BSG可以通過激活細胞漿內絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路增強激活基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達[2]。在細胞膜上，BSG是促進細胞單羧酸轉運蛋白表達的協同分子。而單羧酸轉運蛋白負責將胞內糖酵解過程生成的乳酸快速轉運到胞外，從而保持糖酵解的持續進行以及維持胞內環境的穩定。由于單羧酸轉運蛋白的表達增加，細胞外的微環境中乳酸含量明顯增高，進而刺激了透明質酸的合成。而透明質酸的增加也會激活MAPK信號通路和PI-3K/AKT信號通路等，進而在缺血缺氧狀態及治療腫瘤疾病中充分發揮作用[3]。

BSG蛋白通過幾種不同的信號通路發揮作用，這些信號通路往往具有細胞特異性，其中包括MAPK信號轉導通路，RAF蛋白、RAS蛋白、ERK蛋白都是該通路中的關鍵因子。Boulos等[4]研究發現，BSG通過MAPK途徑發揮作用，激活細胞外信號調節激酶ERK1/2信號。BSG激活了子宮成纖維細胞中的ERK1/2信號通路，致使MMPs的相對表達量增加；使用siRNA敲除BSG表達可顯著降低ERK信號傳導[5]。衣霉素作為N-乙酰葡萄糖胺轉移酶抑制劑，可通過作用于BSG的N端結構使蛋白質去糖基化。通過抑制細胞內蛋白質的折疊使其生物學活性降低，從而誘導細胞凋亡。

盡管BSG基因在一些實體腫瘤中調控細胞生長和凋亡的作用已受到人們關注，但其在宰后貯藏過程肌細胞凋亡中的作用鮮見研究。因此本研究以秦川牛背上的最長肌為研究對象，采用4D-非標記定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）組學方法分析在4 ℃條件下不同貯藏期秦川牛肉蛋白質水平的變化，結合京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析明確BSG所參與的通路，另外通過BSG抑制劑衣霉素作用于秦川牛背最長肌，評估衣霉素對MAPK信號通路及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用發育良好、體態健康的24 月齡秦川公牛。對樣品采集所用到的刀具、鑷子以及其他工具進行高壓滅菌。按照商業化屠宰法對秦川黃牛進行宰殺，取其背最長肌，將每頭牛的背最長肌平均分成3 份，總共9 個肉樣，每個肉樣切分成約120 g。將其用聚乙烯膜密封，并在4 ℃條件下冷藏不同時間。

BCA蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍R-250、衣霉素 上海碧云天生物技術有限公司；ARAF兔克隆抗體北京索萊寶科技有限公司；ERK1兔克隆抗體、KRAS＋HRAS＋NRAS兔克隆抗體、MEK1/2兔隆抗體、GAPDH鼠克隆抗體、生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（H＋L）美國Abclonal公司。

1.2 儀器與設備

-80 ℃冰箱、MK3型酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；MiniVac Alpha冷凍離心機 美國Scan Speed公司；高速冷凍研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；5200型化學發光凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將樣品分成空白組和衣霉素組。對衣霉素組注射濃度為20 μmol/L的衣霉素溶液，同時對空白組注射等劑量的生理鹽水。用鋁箔包裹后放入4 ℃條件下的冰箱中冷藏。貯藏0、2、4、6、8 d后，將空白組和衣霉素組的樣品取出置于液氮2 h，取出將其放入-80 ℃冰箱中進行保存，作為測定MAPK通路關鍵蛋白質含量與細胞凋亡率的樣品。

1.3.2 4D-LFQ蛋白質組學技術檢測蛋白質含量

參照張杏亞等[6]的方法提取蛋白質、篩選空白組0、4、8 d的BSG并測定其相對表達量。參照羅輝等[7]的方法進行數據庫搜索、生物信息學分析、篩選差異蛋白質。并利用DAVID 6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對BSG及相關差異蛋白作KEGG分析。

1.3.3 Western Blotting法檢測MAPK通路關鍵蛋白質的含量

1.3.3.1 總蛋白提取

取出制備好的組織樣品放入2 mL研磨管中，向每管中倒入勻漿液（樣品與裂解液質量比1∶10）和3 mm鋼珠，于高速冷凍研磨儀內勻漿，其中溫度設置為-20 ℃，時間設置為60 s，重復研磨4 次，使組織碾碎。將研磨好的樣品取出來，4 ℃的冰箱里裂解30 min，在12 000 r/min條件下離心10 min，離心結束后將上清液倒出，移到新的離心管內，貯存于-20 ℃。

1.3.3.2 樣品測定

使用BCA蛋白定量試劑盒測定所提取的牛背最長肌總蛋白濃度。取出2 μL待測蛋白樣品，添加裂解液至16 μL，取2 μL稀釋后的蛋白溶液于孔中，并補充裂解液至20 μL，再加入200 μL BCA工作液混合，在37 ℃放置30 min，以0號孔為對照，測定樣品在562 nm波長處的OD值；繪制標準曲線，將OD值代入標準曲線方程得到樣品的蛋白質質量（μg），并計算蛋白質量濃度。

各樣品組取50 μL，以體積比4∶1添加5×Loading buffer，于熱循環儀中95 ℃、15 min混勻，-80 ℃保存。待積層膠凝固后，用清水洗凈待測樣品組的積層膠，進行電泳。上樣量30 μL（5 μg/μL），電壓調至100 V，電泳約0.5 h，待指示條帶接觸到分離膠界面后，再將電壓調至180 V，繼續電泳，約90 min后，待指示條帶到達膠的底部，電泳結束。在100 V、200 mA條件下電泳，轉膜1～2 h。將PVDF膜取出，置于孵育盒內，在室溫條件下振蕩封閉2 h。去除封閉液，用含吐溫-20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）略微清洗，將其擦干并剪切出所需的PVDF薄膜。

加入相應的一抗于密封盒內，于4 ℃進行一夜的孵育培養；用TBST將PVDF膜洗滌5 min，共洗滌3 次。加入相應的二抗，置于搖床在室溫下培育2～3 h。將PVDF膜用TBST清洗3 次，每次10 min左右。

將PVDF膜平鋪在曝光板上，滴加顯影液，反應1 min，在化學發光凝膠成像儀下進行顯影，并依據信號的強弱，對曝光程度以及曝光時間進行調整。采用天能GIS機箱控制軟件V2.0對條帶進行曝光掃描，分別測定牛背最長肌ARAF、ERK1、KRAS＋HRAS＋NRAS、MEK1/2蛋白質的相對表達量。

1.3.4 秦川牛肉貯藏過程中caspase-3活力的測定

取200 mg的冷凍肉樣，在冷凍條件下，加入0.5 mL 100 mol/L Hepes（質量分數0.1% NP-40、質量分數10%蔗糖、10 mol/L mDTT，pH 7.5）裂解液破碎勻漿，在-20 ℃條件下反復凍融3 次，再18 000×g離心30 min，取其上清液，在4 ℃條件下保存備用。反應液則由20 μL裂解物的上清液、0.2 mL反應緩沖液（質量分數10%蔗糖、質量分數0.1% CHAPS、100 mmol/L Hepes，pH 7.5）以及5 μL重建的熒光底物組成。caspase-3作用的底物為Ac-DEVD-AMC。將反應溶液放入酶標儀96 孔板中，37 ℃孵育1 h，激發波長為360 nm，發射波長為460 nm，測其熒光強度。酶活性以1 min時1 mg肉樣品的相對熒光強度表示。

1.4 數據處理

運用SPSS 28統計軟件，通過ANOVA單因素方差分析法、Duncan多重比較對所得數據進行統計處理，明確數據之間的差異顯著性（P＜0.05）。并采用Origin 2021軟件對所得數據作圖。結果以表示。

2 結果與分析

2.1 蛋白質組學分析

2.1.1 BSG的篩選及表達量的變化

利用4D-LFQ組學方法對宰后牛肉蛋白質組的表達變化進行了研究和分析，并利用MaxQuant軟件對獲得的蛋白質進行質譜檢索，共得1 149 個蛋白質，從中篩選出BSG，其表達變化見表1。BSG表達量呈現先升后降的趨勢。在0～4 d，BSG表達量呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。宰后0 d的BSG表達量為0.824，宰后4 d的BSG表達量為1.146。此時，隨著成熟時間的延長，牛肌細胞的線粒體損傷水平也逐漸提升，肉嫩度得到改善。宰后8 d的BSG表達量為0.971，與第4天相比，BSG表達量降低；此時隨著肉質的進一步成熟，牛的肌細胞線粒體損傷水平也降低，使得嫩度下降。結果表明，BSG作為一種線粒體損傷蛋白，其表達量與細胞損傷程度成正比，對肌肉結構蛋白降解程度起到正向調控作用。

表1 秦川牛宰后貯藏期間BSG表達量的變化Table 1 Change in BSG concentration of Qinchuan cattle muscle during storage

2.1.2 差異蛋白質的篩選

設置差異倍數為1.2且P＜0.05，共篩選鑒定出120 個差異豐富的蛋白質。其中4 d與0 d鑒定出38 個差異表達蛋白，8 d與0 d鑒定出73 個差異表達蛋白，8 d與4 d鑒定出42 個差異表達蛋白質。通過UniProt軟件對所篩差異蛋白進行檢索，利用功能特性篩出與BSG相關的差異蛋白，將此類蛋白質與BSG表達量作相關性分析，結果如表2所示。這些蛋白質與BSG的表達均顯著相關。

表2 秦川牛背最長肌貯藏0、4、8 d與BSG相關差異蛋白對比Table 2 Comparison of BSG-related differentially expressed proteins in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle stored for 0,4,and 8 days

2.1.3 KEGG分析

對BSG及其差異蛋白質進行KEGG分析，結果如表3所示。顯著注釋于氧化磷酸化通路、鈣信號通路、MAPK信號通路。其中，在呼吸鏈電子傳遞復合物產生質子梯度的情況下線粒體ATP合酶復合體亞基δ（ATP5F1D）使ADP生成ATP。NADH脫氫酶1α亞復合物亞基6（NDUFA6）是線粒體膜呼吸鏈NADH脫氫酶復合物I的輔助亞基，一般不參加催化作用，復合物I在將電子從NADH轉移到呼吸鏈過程中起一定效果。ATP5F1A、ATP5F1B則位于線粒體內膜上，是氧化磷酸化結構蛋白的核心[8]。NDUFA6主要是參與線粒體呼吸鏈復合體I的組裝和氧化還原過程。肌漿/內質網鈣ATP酶3（ATP2A3）是一種鎂依賴性酶，催化ATP的水解與鈣的轉運。線粒體內膜的氧化磷酸化是ATP的主要來源[9]。以上結果表明，BSG參與了秦川牛肉宰后貯藏期間能量物質代謝與線粒體損傷，并對MAPK信號通路調節起到重要作用[10]。

表3 與BSG表達相關差異蛋白KEGG富集分析Table 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins related to BSG expression

2.2 秦川牛背最長肌MAPK通路關鍵蛋白質表達情況

2.2.1 秦川牛背最長肌ARAF蛋白表達情況

采用蛋白質免疫印跡檢測法比較秦川牛宰后貯藏過程中空白組和衣霉素組ARAF蛋白的表達水平，結果見圖1。隨貯藏時間的延長，空白組與衣霉素組的ARAF蛋白相對表達量總體呈現先上升后下降的趨勢。在貯藏0～4 d時，空白組與衣霉素組的ARAF蛋白表達水平顯著升高。在第4天時，兩組肉樣的ARAF的蛋白表達量達到最高。在貯藏4～8 d時，空白組與衣霉素組的ARAF表達水平呈逐漸下降趨勢。另外，在貯藏第0、2、4、6、8天時，衣霉素組的ARAF蛋白相對量均明顯降低（P＜0.05）。說明在用衣霉素抑制BSG后，ARAF蛋白表達明顯減少。

圖1 秦川牛背最長肌ARAF蛋白表達情況Fig.1 Expression of ARAF protein in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

2.2.2 秦川牛背最長肌ERK1蛋白表達情況

如圖2所示，在貯藏期0～4 d時，空白組與衣霉素組ERK1蛋白的表達水平顯著升高。而在貯藏期4～8 d，空白組ERK1蛋白的相對表達量呈先下降后升高的趨勢，在第8天，ERK1蛋白的相對表達量達到最大值。宰后秦川牛肉在貯藏第0、2、4、6、8天時，衣霉素組ERK1的表達水平相較于空白組均明顯下降。說明在使用衣霉素抑制BSG后，ERK1蛋白表達明顯減少[11]。

圖2 秦川牛背最長肌ERK1蛋白表達情況Fig.2 ERK1 protein expression in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

2.2.3 秦川牛背最長肌KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白表達情況

RAS是一種GTP結合蛋白，具有激活MAPK信號通路的作用[12]。其主要包括KRAS、HRAS及NRAS 3 種亞型。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，空白組與衣霉素組的KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白的相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢。在0～4 d時，空白組與衣霉素組的KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白質的表達量明顯升高。在第4天時，兩組的蛋白水平達到最高。在貯藏期4～8 d時，空白組與衣霉素組的蛋白表達水平呈逐漸下降趨勢。另外，在貯藏期間衣霉素組的KRAS＋HRAS＋NRAS相對表達量相較于空白組均明顯下降。說明在使用衣霉素抑制BSG后，KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白表達明顯減少。

圖3 秦川牛背最長肌KRAS＋HRAS＋NRAS蛋白表達情況Fig.3 Expression of KRAS+HRAS+NRAS proteins in longissimus dorsi of Qinchuan cattle

2.3 秦川牛肉貯藏過程中caspase-3活力的變化情況

細胞凋亡是一種通過激活依賴能量的細胞內死亡程序而導致多基因協調控制細胞自發、有序的死亡方式[13]。細胞一般在缺氧缺血狀態時會誘發其凋亡，這與畜禽屠宰后肌細胞所處狀態類似[14]。caspase-3蛋白的表達水平和細胞凋亡水平密切相關，其在細胞凋亡過程中起著關鍵作用[15-18]。凋亡因子Cyt-c的釋放最終影響caspase-3的活性，激活線粒體凋亡級聯反應[19-20]。如圖4所示，隨著貯藏時間的延長，空白組與衣霉素組的caspase-3活力均呈先上升后下降的趨勢。衣霉素組的caspase-3活力相較于空白組均明顯上升，表明在使用衣霉素抑制BSG后，caspase-3活力明顯增加。由此說明通過沉默BSG基因的表達后，細胞的凋亡率顯著增高。Intasai等[21]通過封閉單核細胞系U937的BSG蛋白質表達后，細胞凋亡增加，說明BSG參與部分細胞凋亡路徑的調節，其凋亡機制與激活caspase相關，與本實驗所得結果一致。

圖4 秦川牛宰后caspase-3活力變化Fig.4 Change of caspase-3 activity in Qinchuan cattle muscle after slaughter

3 討論

BSG是一種高度糖基化的跨膜蛋白，BSG通過MAPK途徑發揮作用，可以激活細胞外信號調節激酶ERK1/2信號。衣霉素則可通過作用于蛋白質的N端結構使蛋白質去糖基化。通過抑制細胞內蛋白質的折疊使其生物學活性受到抑制，從而誘導細胞發生凋亡[22-23]。動物宰后肌細胞所處的缺氧缺血環境、肌肉pH值的變化、肌細胞內外空間的變化都表明宰后肌細胞發生凋亡過程的理論可能性，也有相關研究表明宰后肌細胞的凋亡現象確實存在[24-25]。動物死后肉的嫩化是一個涉及多種蛋白水解酶的復雜生物化學過程，凋亡引起的細胞死亡是此過程的一種新機制。細胞凋亡是肌細胞損傷機制中的關鍵環節，它可以通過激活信號通路啟動細胞內死亡蛋白系統，從而導致細胞發生程序化死亡[26]。MAPK家族是一類重要的細胞內信息傳遞系統，當細胞處于損傷狀態時，p38 MAPK應急信號途徑被快速啟動，進而激活c-Jun氨基未端激酶信號通路，調控ERK信號通路水平，從而介導細胞凋亡等一系列的生理過程[27]。在細胞損傷中ERK也起著較為重要的作用。

在衣霉素組中，ARAF、ERK1、KRAS＋HRAS＋NRAS的相對表達量均顯著下調，這與于甜樂[28]的研究結果一致，由此表明，這3 種蛋白質相對水平的下降，阻礙了MAPK家族信號通路系統的激活，使信息傳遞到細胞核內的過程受阻，多種轉錄因子不表達或表達較少，最終導致細胞凋亡。本實驗結果證實，在宰后肌細胞損傷過程中，BSG通過失活MAPK信號通路引發未折疊蛋白反應，從而致使細胞凋亡。在抑制BSG的表達后，相比于空白組，衣霉素組的caspase-3的相對表達量明顯上升，證明細胞凋亡是細胞損傷的重要環節。Baba等[29]發現BSG誘導的細胞凋亡與糖酵解代謝的不協調有關，Kuang Yehong等[30]發現抑制耐藥性腫瘤細胞的BSG表達可以引起腫瘤細胞的凋亡，這與X連鎖凋亡抑制蛋白密切相關。BSG抑制劑通過失活MAPK信號通路使BSG蛋白下調，從而阻斷肌細胞的能量來源，誘導肌細胞凋亡。因此，BSG可能通過阻止肌細胞的能量供應誘導活性氧生成，使線粒體外膜受損，導致Cyt-C釋放，從而啟動caspase家族信號通路，最終導致細胞凋亡。

4 結論

利用4D-LFQ組學技術發現宰后隨貯藏時間的延長，秦川牛肉中BSG含量先上升后下降，BSG及其差異蛋白質顯著注釋于氧化磷酸化通路、鈣信號通路、MAPK信號通路，說明BSG通過MAPK途徑發揮作用。通過向秦川牛肉的背最長肌中注射BSG抑制劑的方法，有效干擾了BSG蛋白質的表達。另外采用蛋白質免疫印跡法測定秦川牛肉在貯藏過程中MAPK通路相關蛋白質ARAF、ERK1以及KRAS＋HRAS＋NRAS的表達水平，發現衣霉素組的MAPK通路關鍵蛋白質的相對表達量均顯著下調，說明BSG抑制劑使MAPK信號通路失活。這為研究BSG對MAPK信號通路影響奠定了良好的基礎。另外，在抑制BSG表達后，相比于空白組，衣霉素組的caspase-3的活力明顯上升，說明細胞凋亡是細胞損傷的重要環節，BSG參與宰后肌細胞凋亡路徑的調節，其凋亡機制與激活caspase相關。衣霉素通過作用于BSG的N端結構使蛋白質發生去糖基化作用。通過細胞內蛋白質的未折疊反應使其生物活性受到抑制，從而誘導細胞發生凋亡。即BSG可能通過阻斷肌細胞的能量來源，誘導活性氧生成，使得線粒體外膜受損，導致Cyt-C釋放，從而激活caspase家族級聯反應，最終促進細胞凋亡。