兩種生育酚酯衍生物對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

陳煒莉，貝 翎，楊 揚，王璧瑩，李家旭，闞緒甜，李文治，杜 冰,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.無限極（中國）有限公司研發中心，廣東 廣州 510623）

衰老是以細胞、組織、器官功能進行性喪失為特征的自然生命過程，隨著衰老程度的加劇，機體細胞壽命機制的有效性降低，使得衰老成為許多疾病的主要風險因素，包括心腦血管疾病、糖尿病、高血壓等[1]。當前，科學界提出關于衰老機制的理論有自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說、遺傳程序學說等，其中自由基學說是目前研究和接受最廣泛的學說[1-2]。自由基學說是指細胞有氧代謝時，自由基水平升高或抗氧化劑缺乏導致機體抗氧化能力降低，細胞毒性增強，并最終導致細胞膜、氨基酸鏈和DNA的分子結構不可逆轉地受損，從而使機體老化[3]。因此，隨著世界人口老齡化加快，抗氧化與抗衰老相關研究已成為當前的研究熱點之一。

研究表明，過量的D-半乳糖會在體內積聚，在半乳糖氧化酶的作用下，可產生己醛糖和過氧化氫，促進氧自由基和超氧陰離子的產生，破壞大分子和細胞功能[4]；由于D-半乳糖誘導的小鼠衰老模型具有與正常衰老小鼠相似的癥狀，被廣泛用于衰老機制的研究和抗衰老藥物的篩選[5]。氧化應激和炎癥是衰老的主要特征，許多研究表明，核因子-E2-相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）信號通路是迄今發現的最強大的抗氧化應激途徑，在正常生理條件下，Nrf2以非活性形式存在于細胞中，而在氧化應激條件下，激活的Nrf2從細胞質進入細胞核，通過抗氧化元件反應（antioxidant response element，ARE）誘導特定基因的表達，從而調節II相抗氧化酶，如醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase，NQO1）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等基因的表達，減輕氧化應激及炎癥引發的機體損傷[4,6]。

長期以來，人們都用維生素來抵抗自由基的破壞，VE（生育酚）作為一種脂溶性維生素，具有抗氧化功能，可以保護細胞免受氧化損傷[7-8]。劉思彤等[9]的研究表明大豆異黃酮與VE對衰老模型小鼠肝組織病變都有減輕作用，且VE抗氧化能力比大豆異黃酮更強。Rattanawiwatpong等[10]研究發現，含VC、VE及樹莓葉細胞培養提取物的血清能改善大部分皮膚老化現象（如皺紋、彈性低等）。VE可以被修飾成酯的形式，生育酚醋酸酯是一種比游離的VE更穩定的抗氧化性化合物，便于VE制品的貯存、運輸等，是目前生產中常用的VE酯化衍生物之一[7,11-12]。在生育酚醋酸酯的衍生物中，D-α-生育酚醋酸酯屬于天然形式，DL-α-生育酚醋酸酯屬于合成形式。Yasin等[13]研究表明，在肉雞中投喂適量α-生育酚醋酸酯能顯著增加肌肉氧化穩定性和減少脂肪沉積，從而達到增強雞肉氧化穩定性的目的。

因此，本研究將探究兩種生育酚醋酸酯的體外抗氧化作用，并基于衰老模型，對比兩者體內抗氧化及抗衰老作用，以期為尋找抗衰老物質提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性SPF級C57BL/6小鼠購自南方醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2021-0041。

D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯由無極限（中國）有限公司提供；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、天冬氨酸氨基轉移酶（astaxanthin，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

萬分之一天平 上海舍巖儀器有限公司；ANKE TDL-5-A型離心機 上海安亭分析儀器有限責任公司；Labserv K3酶標儀、PIKOREAL96熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；H1650R臺式冷凍離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BioPrep-24生物樣品均質儀 杭州奧盛儀器有限公司；DYY-6C電泳儀北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外抗氧化活性測定

1.3.1.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定

參照楊斯惠等[14]的方法并略作改動，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，取2.0 mL不同質量濃度的樣液于離心管中，分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液，充分搖勻，暗反應30 min，以無水乙醇為參比溶液調零，在517 nm波長處用酶標儀測定吸光度，每個樣品重復3 次。DPPH自由基清除能力按公式（1）計算：

式中：A2為樣品的吸光度；A1為用無水乙醇替代DPPH溶液的對照組吸光度；A0用無水乙醇代替生育酚酯衍生物樣品溶液的空白組吸光度。

1.3.1.2 羥自由基清除能力測定

參照王鈺等[15]的方法，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在510 nm波長處用酶標儀測其吸光度，每個樣品重復3 次。

1.3.1.3 2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定

參照蔣海艷等[16]的方法，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在734 nm波長處用酶標儀測定其吸光度，每個樣品重復3 次。

1.3.1.4 Fe2＋螯合能力測定

參照王肖行等[17]的方法，將D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用無水乙醇稀釋成質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在562 nm波長處用酶標儀測定其吸光度，每個樣品重復3 次。

1.3.1.5 總還原能力測定

參考王兵亞等[18]的方法并做改動。將樣品用無水乙醇稀釋成質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，取2.5 mL不同質量濃度的樣品溶液于試管中，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和質量分數為5%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，搖勻后于50 ℃下水浴20 min，再加入質量分數為10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分搖勻后以4 000 r/min離心15 min，取上清液2.5 mL，加入等體積的蒸餾水和質量分數為0.1%的FeCl3溶液，搖勻后靜置10 min，在700 nm波長處用酶標儀測其吸光度，每個樣品重復3 次?？傔€原能力按公式（2）計算：

式中：R為總還原能力；A1為樣品溶液吸光度；A0為用無水乙醇替代樣品稀釋液作為空白對照測其吸光度。

1.3.2 衰老模型抗氧化及抗衰老作用分析

1.3.2.1 衰老模型建立及干預

參考Lei Shuwen等[19]的方法，72 只SPF級雄性小鼠經7 d適應性喂養后，隨機分成6 組，每組12 只，分別為正常對照組（N C 組）、衰老模型組（S L M組）、DL-α-生育酚醋酸酯組（VEH組）、D-α-生育酚醋酸酯低劑量組（VECL組）、D-α-生育酚醋酸酯中劑量組（VECM組）、D-α-生育酚醋酸酯高劑量組（VECH組）。其中，除了NC組在頸背皮下注射0.9%生理鹽水（0.1 mL/10 gmb）外，其余各組每日皮下注射300 mg/kgmb的D-半乳糖（0.1 mL/10 gmb）進行造模，同時VEH、VECL、VECM、VECH組每日經口給予生育酚酯衍生物的灌胃劑量分別為10、10、50、100 mg/kgmb，根據體質量計算給藥體積（0.1 mL/10 gmb），持續42 d。

1.3.2.2 樣品收集

實驗結束后，小鼠禁食12 h，摘出眼球，用離心管收集血液，將采集的血于37 ℃孵育1 h后置于4 ℃冰箱過夜，4 000 r/min離心15 min后，取上清液即為血清。采血后，立即將小鼠頸椎脫臼處死，快速取出肝臟，并用預冷的生理鹽水洗去血液，濾紙吸干表面水分后凍存待用。

1.3.2.3 抗氧化指標測定

按照相應試劑盒說明書分別測定血清中GSH-Px活力、T-AOC及MDA生成量。

1.3.2.4 血清炎癥因子測定

按照相應試劑盒說明書分別測定IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.3.2.5 肝功能指標測定

根據相應試劑盒說明書分別測定肝功能指標血清AST、ALT水平。

1.3.2.6 Nrf2通路的mRNA表達水平分析

參考周意等[20]的方法，取0.02 g肝臟組織，利用TRIzol法提取肝臟組織總RNA，以肝臟組織總mRNA為模板，將RNA逆轉錄成cDNA，后采用SYRB熒光定量PCR試劑盒檢測Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對表達量，PCR引物由北京擎科有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.2.7 Nrf2通路的蛋白表達水平分析

取0.025 g肝臟組織放入預冷緩沖液清洗，加入300 μL的RIPA裂解液，冰上裂解10 min后，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為提取的全蛋白。取120 μL蛋白上清液，加入30 μL 5×loading buffer混勻，沸水浴5 min，放入冰盒中速冷備用；根據蛋白定量結果，上樣20 μL蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳分離，轉至NC膜上，封閉。加入稀釋后的Nrf2（1∶1 000）、NQO-1（1∶5 000）、HO-1（1∶2 000）和β-actin（1∶5 000）抗體，室溫放置60 min，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min。加入稀釋后的二抗（1∶5 000），室溫孵育90 min，顯影，在凝膠成像系統成像。

1.4 數據統計分析

利用GraphPad Prism 9軟件進行數據處理及繪圖，采用單因素方差分析，P＜0.05，差異顯著，結果用表示。

2 結果與分析

2.1 兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力常作為評價和尋找新的抗氧化物質的指標之一[21]。由圖1A可知，當質量濃度大于0.3 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物與VC的DPPH自由基清除能力接近。

圖1 兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化能力Fig.1 In vitro antioxidant capacity of two tocopherol ester derivatives

2.1.2 羥自由基清除能力

羥自由基為氧化能力極強的活性氧，羥自由基清除能力越大，表明抗氧化能力越強[22]。如圖1B所示，質量濃度在0.1～0.3 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物的羥自由基清除能力大于相同質量濃度的VC。當質量濃度為0.5 mg/mL時，羥自由基清除能力依次為VC＞DL-α-生育酚醋酸酯＞D-α-生育酚醋酸酯。

2.1.3 ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS陽離子自由基清除能力可以用于評價極性和非極性樣品的抗氧化性[23]。如圖1C所示，當質量濃度為0.1～0.3 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物的ABTS陽離子自由基清除能力高于相同質量濃度的VC，但當質量濃度為0.4～0.5 mg/mL時，三者清除能力接近。

2.1.4 Fe2＋螯合能力

抗氧化物螯合金屬離子被公認為清除羥自由基的最佳途徑，Fe2＋能誘導超氧陰離子生成對人體有害的羥自由基[24]。在0.1～0.5 mg/mL的質量濃度范圍內，兩種生育酚酯衍生物的Fe2＋螯合能力顯著高于VC；D-α-生育酚醋酸酯在0.2 mg/mL時Fe2＋螯合能力最強，為95.98%；DL-α-生育酚醋酸酯在0.3 mg/mL時Fe2＋螯合能力最強，為88.78%。

2.1.5 總還原能力

抗氧化化合物利用本身還原作用給電子，從而清除自由基，總還原能力越強說明該物質抗氧化能力越強[17]。由圖1E可知，質量濃度為0.1～0.5 mg/mL時，兩種生育酚酯衍生物還原能力高于相同質量濃度下VC的還原能力，且隨著質量濃度的提高，三者還原能力增加，呈現出一定的線性增長關系。

5 種體外抗氧化能力指標分析結果說明兩種生育酚酯衍生物有相似的抗氧化能力，在0.1～0.3 mg/mL質量濃度范圍內，二者的羥自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、Fe2＋螯合能力和總還原能力均優于VC。

2.2 兩種生育酚酯衍生物的對衰老模型小鼠體內抗氧化指標的影響

2.2.1 體內抗氧化指標

許多研究結果顯示，D-半乳糖的注射誘導可加快小鼠衰老的速度，導致氧化應激并產生MDA，MDA水平可反映體內脂質過氧化的程度[25-26]；GSH-Px是機體重要的抗氧化酶，通過清除體內氧代謝生成的產物和維持谷胱甘肽活性從而維持細胞膜結構及其功能[27]；T-AOC是評價動物體內抗氧化酶和非酶系統水平的綜合指標，可反映生物體的自由基代謝能力，T-AOC低表明機體抗氧化系統不活躍，導致脂質過氧化產物和自由基豐富[25]。由圖2可知，SLM組小鼠的MDA含量顯著高于NC組（P＜0.000 1），而GSH-Px活力和T-AOC顯著低于NC組（P＜0.000 1，P＜0.001）。添加兩種生育酚酯衍生物都能顯著降低MDA含量，VEH組、VECL組、VECM組、VECH組依次降低63.85%、60.02%、64.16%、71.12%（P＜0.000 1）。添加兩種生育酚酯衍生物顯著提高了GSH-Px活力和T-AOC水平，VEH組、VECL組、VECM組、VECH組的GSH-Px活力分別升高78.33%、80.03%、88.86%、68.11%（P＜0.05，P＜0.000 1），T-AOC水平分別升高63.42%、45.45%、81.82%、118.18%（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。Min等[28]研究發現補充VE可顯著降低氧化應激大鼠血清中MDA含量，增加GSH-Px基因的表達從而提高氧化應激公雞的抗氧化能力和免疫性能，這與本研究結果相似。綜上，兩種生育酚酯衍生物具有良好的抗氧化能力，對小鼠體內氧化應激損傷具有一定的改善作用。

圖2 兩種生育酚酯衍生物對小鼠體內抗氧化指標的影響Fig.2 Effects of two tocopherol ester derivatives on antioxidant indexes of mice

2.2.2 血清炎癥因子

氧化應激的發生一般伴有炎癥反應，氧化應激增強會刺激炎癥因子的表達[29]。血清中促炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α能促進炎癥反應進行，其含量越低說明機體免疫功能越強[30]。如圖3所示，SLM組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量比NC組顯著提高（P＜0.000 1）。隨著D-α-生育酚醋酸酯劑量的增加，小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著降低，VECL組和VECH組小鼠的IL-6含量分別降低3.28%和9.88%，IL-1β含量分別降低1.71%和7.18%，TNF-α含量分別降低了13.88%和20.22%。VEH組的IL-1β和TNF-α含量比SLM組顯著降低（P＜0.05），表現出比VECL組更好的抗炎效果。Barros等[31]研究發現含有維生素E醋酸酯的活性制劑對白色念球菌具有抗炎活性，與本研究結果相似。綜上，兩種生育酚酯衍生物能夠降低由D-半乳糖誘導的衰老模型的炎癥因子增加，從而達到抗衰老的目的，且相同劑量下DL-α-生育酚醋酸酯效果比D-α-生育酚醋酸酯好。

圖3 兩種生育酚酯衍生物對小鼠血清炎癥因子的影響Fig.3 Effects of two tocopherol ester derivatives on serum levels of inflammatory cytokines in mice

2.2.3 肝功能指標AST、ALT

AST、ALT活性是目前臨床上常用的反映肝功能受損程度的生化指標，在肝細胞受損時，可引起細胞膜的通透性改變，血清ALT水平增加，當線粒體進一步受到影響時，AST含量升高[32]。從圖4可知，SLM組小鼠的AST和ALT活力較NC組顯著增加，分別增加18.95%、40.32%（P＜0.000 1），而經過兩種生育酚酯衍生物干預，小鼠的AST、ALT活力有所降低。VEH組小鼠血清中AST活力顯著低于VECL組（P＜0.05），VEH組小鼠血清中AST和ALT含量比SLM組分別降低了7.20%、27.50%，VECL組則分別降低了5.81%、21.74%；經過D-α-生育酚醋酸酯干預小鼠的AST、ALT活力隨著服用劑量增加而降低。Shah等[33]研究發現，在雄性鵪鶉日糧中添加松葉和維生素E醋酸酯能夠降低鵪鶉血清中AST含量，與本研究結果相似。綜上，兩種生育酚酯衍生物能減輕肝功能受損程度。

圖4 兩種生育酚酯衍生物對小鼠AST、ALT的影響Fig.4 Effects of two tocopherol ester derivatives on liver AST and ALT activities in mice

2.2.4 Nrf2通路相關蛋白及其mRNA相對表達量

II相抗氧化酶NQO1和HO-1是Nrf2調控的下游靶蛋白，其中NQO1能催化醌類物質及其衍生物還原，從而降低其氧化毒性，HO-1能夠與膽紅素、一氧化碳等一起發揮抗氧化作用，當Nrf2作為關鍵轉錄因子移位到細胞核中與ARE區域結合時，導致II相抗氧化酶表達增強[34-36]。Nrf2通路中相關蛋白及其mRNA相對表達量的結果如圖5所示，圖6為相關蛋白的Western blot圖。與NC組相比，SLM組的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對表達量顯著下降，mRNA相對表達量分別降低了88.74%、87.76%和89.53%（P＜0.000 1），蛋白相對表達量分別下降了92.42%、94.19%和95.77%（P＜0.001，P＜0.000 1）。與SLM組相比，各組干預下相關蛋白及其mRNA相對表達量不同程度上升。對于Nrf2、NQO1、HO-1mRNA而言，相比SLM組，VEH組Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相對表達量分別增加了514.08%、461.78%、515.32%（P＜0.000 1），VECH組則分別增加288.82%、282.39%、311.44%（P＜0.000 1）。對于Nrf2、NQO1、HO-1蛋白而言，相比SLM組，VEH組的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白相對表達量分別增加了620.00%、988.89%、1 200.00%，而VECH組分別增加346.67%、533.33%、887.5%。給藥劑量為10 mg/kgmb的DL-α-生育酚醋酸酯組Nrf2通路相關蛋白及其mRNA相對表達量都高于給藥劑量為100 mg/kgmb的D-α-生育酚醋酸酯組。綜上，兩種生育酚酯衍生物可通過上調衰老小鼠Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對表達量，提高其體內抗氧化能力，抵抗氧化應激，從而具有抗衰老作用，且DL-α-生育酚醋酸酯效果優于D-α-生育酚醋酸酯。

圖5 Nrf2通路中mRNA和蛋白相對表達量Fig.5 Relative mRNA and protein expression in the Nrf2 signaling pathway

圖6 Nrf2、NQO1、HO-1的Western blot組圖Fig.6 Western blot patterns of Nrf2,NQO1 and HO-1

3 結論

本研究通過測定兩種生育酚酯衍生物的體外抗氧化能力，并采用D-半乳糖致小鼠衰老后，用兩種生育酚酯衍生物進行干預。結果表明，兩種生育酚酯衍生物具有較好的體外、體內抗氧化效果，能調節衰老小鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量的升高，能使衰老小鼠的AST、ALT活力有所降低，有利于肝功能的修復；與衰老模型組相比，兩種生育酚酯衍生物干預后，小鼠NQO1、HO-1與Nrf2的mRNA和蛋白相對表達量增強，說明生育酚酯衍生物通過上調NQO1、HO-1、Nrf2的表達水平發揮其抗氧化作用，且DL-α-生育酚醋酸酯效果優于D-α-生育酚醋酸酯。綜上所述，兩種生育酚酯衍生物具有較強的抗氧化能力，并能通過提升Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相對表達量緩解衰老。