膜分離對福建產不同茶類提取物化學組成和抗氧化活性的影響

林清霞，王麗麗，宋振碩，蔡淑嫻，劉仲華,*，陳 林,*

（1.福建省農業科學院茶葉研究所，福建 福州 350013；2.湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128）

福建是中國著名的產茶大省，主產茶類有綠茶、白茶、烏龍茶（閩南烏龍、閩北烏龍）和紅茶[1]。茶葉富含多酚、氨基酸、咖啡堿（caffeine，CAF）等代謝產物[2]，不同茶類的代謝產物存在較大差異，并因其內含組成不同賦予其不同的活性功能[3]。膜分離是20世紀60年代迅速發展起來的技術[4]，它依據不同的截留分子質量，可實現茶葉不同組分的分離、純化和濃縮，并且無相變發生、無有機溶劑污染、能耗低、易實現規?；a，在提取分離茶葉的功效成分方面具有廣闊的應用前景，是當今分離學科中最重要的手段之一[5]。膜分離技術包括微濾、超濾、納濾、反滲透等，其中超濾技術已開展應用于茶葉活性物質的分離富集。研究表明，膜分離技術已用于分離富集茶多酚（tea polyphenols，TPs）[6]、CAF[7]、茶多糖[8]、茶氨酸[9]、茶皂素[10]等茶葉功能成分以及茶飲料產業[11]，在茶葉精深加工方面具有廣闊的發展應用前景。超濾技術目前用于茶葉功效成分的分離和富集大多聚焦于單一茶類、單級膜分離靶標產品的澄清、得率、純度研究，不同茶類在多級膜分離過程中其功效成分及抗氧化活性變化尚缺乏系統性的研究[12-13]。因此，為了闡明不同茶類的生化成分及其體外抗氧化活性在不同膜分離過程的變化情況，本實驗結合前期課題組研究基礎，以綠茶、白茶、烏龍茶（閩南烏龍、閩北烏龍）和紅茶4 種茶為原料，通過多級膜分離制備不同分子質量區間的茶粉樣品，探究各茶粉的紫外光譜特征、主要生化成分變化情況及體外抗氧化活性變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同類別茶葉樣本共計15 個，綠茶3 個、白茶3 個、閩南烏龍茶3 個、閩北烏龍茶3 個、紅茶3 個。

福林-酚、茚三酮（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；兒茶素類及沒食子酸標準品（純度＞98%）美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97%）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）（純度均＞98%）合肥博美生物科技有限責任公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

HWS-28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；膜分離系統（BONA-GM-19型反滲透膜小型試驗機、超濾膜元件（聚醚砜樹脂材質，長度30 cm，直徑5 cm，過濾面積0.4 m2，選用截留分子質量20、10、3.5 kDa））山東博納生物科技集團有限公司；B-290型噴霧干燥機 瑞士Büchi公司；Varioskan LUX多功能酶標儀 美國Thermo Scientific公司；1260型高效液相色譜系統（配備G1311CVL四元泵、G1329B標準自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315DVL二極管陣列檢測器）美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

茶樣按料液比1∶25（g/mL）加入沸水，100 ℃浸提20 min，10 min振搖1 次，趁熱抽濾，浸提2 次，合并過濾液備用[14]。15 個樣品均進行相同操作，每個茶樣重復3 次工藝流程。即取500 mL過濾液直接噴霧干燥獲得茶葉粗提物，剩余的過濾液通過反滲透實驗分離機進行膜分離，將茶葉粗提物分為5 個不同部分。膜分離過程：首先經過20 kDa超濾膜在0.1 MPa壓力條件下截留分離，收集截留液作為＞20 kDa茶葉提取物；透過液再次由10 kDa超濾膜分離，收集截留液作為10～20 kDa茶葉提取物；透過液再次經3.5 kDa超濾膜分離，收集截留液作為3.5～10 kDa茶葉提取物，收集透過液作為＜3.5 kDa茶葉提取物，分別經噴霧干燥后，制得各部分的膜分離茶粉。樣品制作工藝流程如圖1所示，其中閩北烏龍茶和紅茶經20 kDa超濾膜分離后，大部分內含物質被截留，20 kDa透過液部分的內含物質濃度太低，最終閩北烏龍茶收集到4 個部分的茶粉，紅茶收集到3 個部分的茶粉。

1.3.2 光譜獲取

將質量濃度為200 μg/mL的茶粉水溶液加到96 孔板中，每孔加樣量200 μL，采用酶標儀掃描200～450 nm波長范圍的光譜，以超純水作參比。

1.3.3 茶粉主要生化成分檢測

TPs含量參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[15]中的福林-酚比色法測定；游離氨基酸（free amino acids，FAAs）含量參照GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》[16]中的茚三酮比色法測定；CAF、沒食子酸（gallic acid，GA）及兒茶素組分含量參照文獻[17]中的方法測定。

1.3.4 茶粉體外抗氧化活性測定

分別精密稱取100 mg茶粉，用超純水定容至10 mL作為母液備用，用超純水將母液稀釋至20 μg/mL測定。分別取2 mL上述溶液于試管中，按文獻[18]方法加入0.3 mmol/L DPPH自由基溶液2 mL，測定各茶粉的DPPH自由基清除能力。

用超純水將10 mg/mL的茶粉母液稀釋至200 μg/mL，以Trolox系列梯度濃度繪制標準曲線，鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）以茶粉中Trolox物質的量計（單位為mmol/g）[18]。

T-AOC采用試劑盒檢測，10 mg/mL的母液用超純水稀釋至200 μg/mL測定。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 不同茶粉的紫外光譜表征

茶葉中多種水溶性成分均有特定的紫外吸收光譜，如多酚及其氧化產物、茶氨酸、茶多糖、嘌呤堿等[19-22]。從圖2可以看出，各茶粉樣品的紫外吸收光譜變化較為相似，在210 nm和274 nm波長處均有2 個較為明顯的吸收峰。圖2A～E分別為各茶類不同膜分離茶粉在同一質量濃度的紫外吸收光譜。不同膜分離部分在274 nm波長處的吸光度各有差異，不同茶類變化幅度不一致，這是因為茶粉中的成分配比不同，影響其在274 nm波長處的紫外吸光度。閩北烏龍在274 nm波長處的紫外吸光度變化幅度最大，紅茶變化最小。這可能是由于膜分離過程各茶粉樣品化學成分較為相近，但各化學成分間的配比發生改變。圖2F為不同質量濃度（50、100、150、200、250 μg/mL）茶粉（閩南烏龍茶）水溶液的紫外吸收光譜，茶粉水溶液濃度與274 nm波長處的吸光度間存在良好線性關系。圖2G為各茶類不同膜分離茶粉的紫外吸收光譜，不同茶類的膜分離樣品其紫外光譜可以實現較好的區分，可采用紫外光譜鑒別不同來源的茶葉。

圖2 不同茶粉樣品的紫外光譜Fig.2 UV absorption spectra of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.2 不同茶粉的主要生化成分含量

2.2.1 不同茶粉的TPs、FAAs、CAF含量

TPs、FAAs、CAF是茶葉的主要呈味物質，TPs還是茶葉發揮抗氧化作用的主要活性成分，因此，考察三者的含量對評價茶葉的品質具有重要意義[23]。由圖3A～C可以看出，不同茶類的TPs、FAAs、CAF含量均有差異；綠茶的TPs含量顯著高于其他茶類，白茶、閩南烏龍、閩北烏龍差異不顯著，紅茶TPs含量最低；白茶FAAs含量顯著高于其他茶類，綠茶和紅茶FAAs含量差異不顯著，僅次于白茶，閩北烏龍FAAs總量最低，閩南烏龍次之；閩南烏龍CAF含量顯著低于其他茶類。各茶類樣品的TPs含量分布均較為集中，白茶和紅茶的FAAs含量分布較為離散，綠茶、白茶、閩南烏龍的CAF含量分布較為集中，而閩北烏龍和紅茶的CAF含量分布離散。從圖3D～F可看出，第3部分茶粉的TPs、FAAs、CAF含量均顯著高于第1部分和第2部分；第3部分的TPs含量顯著高于第4、5、6部分，而FAAs和CAF含量無顯著差異。這說明各類茶的TPs、FAAs、CAF在20 kDa超濾膜透過液部分富集，后續進一步的膜分離對各類茶粉的FAAs和CAF無富集效果，且多酚含量略有降低。從整體看，不同膜分離部分TPs含量分布最為集中，而FAAs含量分布最為離散，即膜分離對各茶粉的FAAs含量影響較大；從局部看，第1部分和第2部分的TPs、FAAs、CAF含量分布均較為集中，而第3部分各成分分布均較為離散，即20 kDa超濾膜對各成分的分布情況影響較大。綜上所述，茶類和膜分離過程均對各成分含量有影響，經20 kDa超濾膜分離后再經其他孔徑超濾膜分離，其TPs、FAAs、CAF含量均無顯著差異，各茶類經20 kDa膜進行單級分離即可。

圖3 不同茶粉樣的主要化學成分含量Fig.3 Contents of major chemical components in membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.2.2 不同茶粉的兒茶素組分和GA含量

兒茶素類是T P s 的主體成分，占多酚類總量的60%～80%，它主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素（epicatechin，EC）[3]。由圖4A可以看出，不同茶類的GA以及各兒茶素含量均有差異?？傮w來看，茶葉中的EGC和EGCG含量高于EC和ECG含量，其中，EGC含量最高的是閩南烏龍茶，EGCG和ECG含量最高是綠茶，綠茶和閩南烏龍的EC含量相近，均處于較高水平。紅茶中的EGC、EGCG、EC、ECG含量均處于較低水平。閩北烏龍茶和紅茶中的GA含量最高，白茶和綠茶中的GA含量相近，閩南烏龍茶中的GA含量最低。由圖4B～F可以看出，除紅茶外，其他茶類各超濾膜分離部分的EGC、EGCG、EC、ECG含量變化趨勢基本一致，均是第3部分含量高于第1、2部分；第3部分含量高于第4、5、6部分或第3、4、5、6部分差異不大；各部分的點分布均較為離散，EGC和EGCG的含量變化幅度最大。閩北烏龍茶和紅茶的GA含量較高，且均是第3部分的GA含量高于第1、2部分；其他茶類的GA含量均比較低。由圖4G可知，閩南烏龍中兒茶素總量（total catechin，TC）/TPs占比最高，綠茶、白茶次之，紅茶最低，這與文獻[24]報道不完全一致，這可能是由于TC/TPs占比在膜分離過程中發生改變，并且不同茶類的變化行為有所差異。由圖4H可知，第3部分的TC/TPs占比高于前2 個部分，第4、5、6部分的TC/TPs占比均處于較高值，這說明膜分離可以提高TC/TPs占比。

圖4 不同茶粉樣的GA和兒茶素組分含量Fig.4 GA and catechin contents in membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.3 不同茶粉的體外抗氧化活性分析

茶葉具有多種保健功效，尤以抗氧化活性成為眾多學者關注的焦點[25]，金亮等[26]研究表明抗炎、抗衰老等功效均與抗氧化活性有很大的相關性。由圖5A1、B1、C1可知，DPPH自由基清除能力、FRAP、T-AOC這3 種抗氧化能力的變化趨勢基本一致，綠茶的抗氧化活性顯著高于其他茶類，閩南烏龍茶、閩北烏龍茶和紅茶的抗氧化活性依次降低，而白茶的DPPH自由基清除能力和T-AOC低于閩南烏龍，這與前人研究結果[27]不完全一致，這主要是由于茶葉抗氧化活性高低與茶葉中的活性成分含量及其配比密切相關[28]，膜分離過程各生化成分的含量發生改變，各成分間的配比也發生改變，并且膜分離過程中不同茶類生化成分含量變化幅度各不相同。從圖5A2、B2、C2可知，第3部分的DPPH自由基清除能力、FRAP及T-AOC顯著高于第2部分，而第3、4、5、6部分無顯著差異，即20 kDa膜分離可顯著提高茶粉的抗氧化活性；與單級膜分離相比，多級膜分離不會進一步提高茶粉的抗氧化活性。第3部分的點分布最為離散，結合圖5A1、B1、C1可知，這幾類茶中，紅茶經20 kDa超濾膜分離后，其抗氧化活性變化幅度最大。紅茶20 kDa超濾膜截留液部分抗氧化活性最高，其余茶類20 kDa超濾膜透過液部分抗氧化活性最高。

圖5 不同茶粉的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

由圖6可知，綠茶、白茶、閩南烏龍茶不同膜分離部分茶粉的DPPH自由基清除能力、FRAP、T-AOC這3 種抗氧化活性的變化趨勢基本一致，第3部分的抗氧化活性顯著高于第2部分，第4、5、6部分的抗氧化活性顯著低于第3部分，閩北烏龍茶第3部分的抗氧化活性顯著高于第2部分和第4部分。即綠茶、白茶、閩南烏龍茶、閩南烏龍茶在20 kDa超濾膜透過液部分抗氧化活性最高。紅茶的第2部分抗氧化活性顯著高于第3部分，即紅茶的20 kDa截留液部分抗氧化活性最高。

圖6 各茶類不同膜分離部分的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

2.4 相關性分析

由表1可知，274 nm波長處的吸光度與茶葉中多種成分呈極顯著相關。相關性分析顯示，274 nm波長處的吸光度與FAAs、CAF、GA、ECG含量均呈極顯著正相關，與EGC含量呈極顯著負相關，與EC含量呈顯著負相關。課題組前期采用偏最小二乘回歸模型建立了一種茶葉中咖啡因含量的紫外吸收光譜檢測方法[29]，實現了茶葉中咖啡因含量的高通量、快速檢測。后期可通過合理的數據處理方法進行回歸建模，建立茶葉多組分與紫外吸收光譜的關系。

表1 茶葉中主要化學成分與紫外吸光度的關系Table 1 Correlation coefficients between chemical components and UV absorbance of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

由表2可知，DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC與TPs、EGC、EGCG、EC、ECG含量均呈極顯著正相關，這說明在茶葉抗氧化成分中，TPs及其衍生產物是影響抗氧化活性的重要因素，這與文獻[30]報道結果一致。GA含量與DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC均呈現顯著負相關，這與文獻[31]報道結果不一致，這主要是在抗氧化活性方面，TPs在量效上占據主導地位，總酚含量對抗氧化活性有決定性作用，其他成分含量的變化不能主導抗氧化活性的改變。如綠茶中的多酚含量高，GA含量低；紅茶中多酚含量低，GA含量高；然而綠茶的抗氧化能力顯著高于紅茶；則最終顯示GA與DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC呈顯著負相關性，實際上GA本身具有抗氧化活性。

表2 茶葉中主要化學成分與抗氧化能力的關系Table 2 Correlation coefficients between chemical composition and antioxidant activity of membrane ultrafiltration fractions from tea aqueous extracts

3 結論

膜分離過程會影響茶葉的理化性質，不同茶類在膜分離過程中其理化性質變化行為不完全一致。以不同膜分離茶粉為基準，不同茶類的TPs含量排序為綠茶＞閩南烏龍茶＞白茶＞閩北烏龍茶＞紅茶；不同茶類的FAAs含量排序為白茶＞紅茶＞綠茶＞閩南烏龍茶＞閩北烏龍茶；不同茶類的CAF含量排序為紅茶＞閩北烏龍茶＞白茶＞綠茶＞閩南烏龍茶。DPPH自由基清除率、FRAP、T-AOC的變化趨勢基本一致，與TPs、EGC、EGCG、EC、ECG含量均呈極顯著正相關。不同茶類的GA以及各兒茶素含量均有差異，茶葉經膜分離后各部分的兒茶素組分和GA含量的點分布均較為離散，尤以EGC和EGCG的含量變化幅度最大，膜分離可以提高TC/TPs占比。該研究結果在茶葉精深加工中的推廣具有重要參考價值，尤其是在具體料液體系，特定的目標物、膜的篩選等方面提供重要理論支撐。各茶粉樣品水溶液均有特定的紫外吸收光譜，今后可以重點開展以下幾個方面的深入研究：系統考察ECG、EGC、EC、Arg、His、Asp、Glu、GA、CAF、茶氨酸等單一組分、多組分以及茶葉提取物復雜組分的紫外吸收光譜特征，進一步闡明茶葉組分與紫外吸收光譜的關系。