食品中季銨鹽類消毒劑檢測方法建立及北京市市售食品及膳食樣品中含量分析

謝 昀，周偉娥，許秀麗，張 晶，張 峰,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100176；2.國家市場監管重點實驗室（食品質量與安全），北京 100176；3.北京市疾病預防控制中心，北京 100013）

季銨鹽是一類陽離子表面活性劑，可通過破壞菌體外膜使內容物外滲引起微生物死亡，作為消毒劑使用歷史悠久[1]。季銨鹽性質穩定、使用方便，因此被廣泛應用于食品加工[2]、醫療[3]、公共衛生[4]等領域。近年來，為限制新型冠狀病毒的傳播，季銨鹽類消毒劑使用量進一步增大[5]。2020年，美國環境保護署列出的430 種可以殺滅新型冠狀病毒的消毒劑產品中，有216 種含有季銨鹽活性成分。同年，我國衛健委印發的《公共場所新型冠狀病毒感染的肺炎衛生防護指南》中把季銨鹽類列為日常衛生防疫消毒可用的消毒劑。此外，疫情期間食品外包裝表面新冠病毒核酸陽性屢見報導[6]，而我國原衛生部印發的《食品用消毒劑原料（成份）名單（2009版）》規定部分季銨鹽類可用于消毒食品接觸容器和工具，這使得季銨鹽類消毒劑在食品及相關產品鏈中廣泛應用。

隨著研究的逐步深入，人們發現季銨鹽類化合物可以引起哮喘、皮膚過敏性反應和視力減退等病癥[7]。食品生產、加工、貯存、銷售等過程中的多次消毒會導致季銨鹽類消毒劑在包材或容器等表面殘留[8]，繼而通過接觸遷移污染食品，帶來潛在食品安全風險。2013年，歐洲食品安全局對17 個成員國5 472 份食品樣本中的苯扎氯銨（benzalkonium chloride，BAC）和二癸基二甲基氯化銨（didecyl dimethyl ammonium chloride，DDAC）進行了調查，發現304 份樣品中的殘留超過歐盟最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）[9]。2015年，德國一檢測機構在我國境內的嬰兒奶粉中檢出季銨鹽[10]。歐洲食品安全局對于食品中季銨鹽類消毒劑設置的MRL不斷嚴格。2012年，(EC)No 396/2005法規規定，BAC和DDAC的MRL為0.5 mg/kg。2014年，(EC)No 1119/2014法規將MRL降低至0.1 mg/kg。預計未來歐盟和美國將進一步加強食品中季銨鹽檢測[11-12]。而我國尚未對食品中季銨鹽進行限量規定或開展正式的風險監測。因此，為解決我國食品中季銨鹽類消毒劑污染水平不清、風險不明的問題，研究建立準確、靈敏的檢測方法并開展污染水平調查具有極其重要的意義。

目前，季銨鹽類消毒劑檢測方法主要有離子色譜法[13]、氣相色譜-質譜聯用法[14]、高效液相色譜法[15]與高效液相色譜-串聯質譜法[2]，研究對象主要為環境水樣[16]、土壤[17]和沉積物[18]等。在食品檢測領域，最多報道過7 種化合物的同時檢測[19]，二辛基二甲基氯化銨（dioctyldimethylammonium chloride，DODMAC）和辛基癸基二甲基氯化銨（decyldimethyloctylammonium chloride，DDMOAC）等國內常用消毒劑檢測方法鮮見報道。同時，存在方法適用基質單一的問題，例如只適用于奶粉[20-21]、冰淇淋[22]或冷凍肉[19]等。本研究在已有方法的基礎上，擴大基質適用范圍，覆蓋高脂、高有機酸、高色素等樣品，目標物種類覆蓋單長鏈、雙長鏈和多長鏈季銨鹽。并根據目標物性質和結構優化色譜與質譜條件，結合不同食品基質特性改進提取與凈化方法，采用基質匹配外標法定量，建立了改良QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）法前處理樣品，超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）同時定量測定蔬菜、水果、水產中9 種季銨鹽的分析方法。與現有方法相比，本方法簡便快捷、靈敏度高、選擇性強、基質效應（matrix effect，ME）弱，適用基質和目標物種類覆蓋更全面，適用于批量食品中季銨鹽類化合物測定，為開展我國食品季銨鹽殘留風險監測提供技術支持。通過對北京市市售食品及膳食樣品中季銨鹽含量的檢測，旨在為制定我國食品中季銨鹽化合物殘留限量標準提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸（質譜純）北京百靈威科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（primary-secondary amine，PSA）（40 μm）安捷倫科技（中國）有限公司；無水硫酸鎂（分析純）國藥集團化學試劑北京有限公司；石墨化碳黑吸附劑（graphitized carbon black，GCB）（120～400 目）天津博納艾杰爾科技有限公司；實驗室用水由Millipore純水儀制備。

DODMAC、DDMOAC、十六烷基二甲基芐基氯化銨（C16-BAC）、十四烷基二甲基芐基氯化銨（C14-BAC）、十二烷基二甲基芐基氯化銨（C12-BAC）、十二烷基-二甲基-2-苯氧基-乙基溴化銨（domiphen bromide，DB）、DDAC（均為標準品）德國Dr.Ehrenstorfer公司；四丁基硫酸氫銨（tetrabutylammonium hydrogen sulfate，TAHS）、十二烷基三甲基溴化銨（dodecyltrimethylammonium bromide，DTAB）（均為標準品，純度≥99.0%）天津阿爾塔科技有限公司。

1.1.2 樣品來源

北京市市售樣本來源為市場隨機采樣，共計69 例樣品，其中蔬菜30 例、水果27 例、水產12 例。采樣種類具有代表性，蔬菜覆蓋葉菜類、果菜類、花菜類、根菜類、莖菜類，水果覆蓋柑橘類、仁果類、核果類、漿果類，水產覆蓋淡水魚、海魚、蝦。采集場所包括超市、農貿市場及流動攤等。

北京市膳食樣本來源為第6次全國總膳食研究北京市樣品，包括蔬菜13 例、水果8 例、水產4 例，共計25 例。通過對北京居民的膳食習慣調查及消費量數據進行聚類，依據聚類結果進行采樣，并將采集得到的同一食物樣品按相同比例混合，依據北京市飲食習慣加工烹調后，制得混合的膳食樣品[23]。

1.2 儀器與設備

一次性注射器（1 mL）美國Welch公司；0.22 μm尼龍濾膜（有機系）安捷倫科技（中國）有限公司；聚丙烯離心管（2 mL和50 mL）美國康寧公司；Milli-R04純水儀 德國Millipore公司；ML104/02分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；HSC-12B針式氮吹儀 天津恒奧科技有限公司；旋渦混合儀德國IKA 公司；Xevo TQ-XS 三重四極桿液相色譜-質譜聯用儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Waters公司；Eclipse XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將食品樣本勻漿，稱取2.0 g（準確至0.01 g）置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙腈渦旋振蕩，再加入2 g無水MgSO4渦旋混合1 min，超聲提取15 min，4 ℃、10 000 r/min離心5 min。取上清液于另一50 mL聚丙烯離心管中，加入400 mg PSA和5 mg GCB，渦旋混勻1 min，4 ℃、10 000 r/min離心5 min。準確移取10 mL上清液置于玻璃氮吹管中，于30 ℃水浴中氮吹干，加入0.5 mL甲醇，渦旋復溶，過0.22 μm尼龍濾膜，上機待測。

1.3.2 標準溶液配制

分別準確稱取9 種季銨鹽標準品各10.0 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1 g/L的標準儲備液。-20 ℃避光保存，備用。準確吸取9 種標準儲備液0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/mL混合標準儲備液。按照1.3.1節方法獲得空白基質溶液，將混合標準儲備液用空白基質溶液逐級稀釋成質量濃度為200、100、50、20、10、5、2 μg/L的系列基質匹配標準工作液，臨用現配。

1.3.3 液相色譜-質譜分析

液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm），流動相A為甲醇，B為0.1%甲酸＋2 mmol/L乙酸銨溶液，流動相梯度條件見表1。流速0.25 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積2 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子掃描模式，多反應監測；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：900 L/h（＋）；錐孔氣流量：150 L/h；毛細管電壓：3 000 V；駐留時間：20 ms。9 種季銨鹽質譜檢測參數見表2。

表2 9 種季銨鹽化合物監測離子對參考質譜條件及保留時間Table 2 Mass spectrometric parameters and retention times of nine QACs

1.3.4 ME計算

按照式（1）計算ME：

式中：A為純溶劑標準曲線斜率；B為空白基質匹配標準曲線斜率。

1.3.5 每日攝入量（estimated daily intake，EDI）估算

按照式（2）計算EDI：

式中：c為某種化合物在被檢樣品中的平均含量/（μg/kg）；F為居民日均消費量/kg；mb為人群平均體質量/kg。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

2.1.1 色譜柱的選擇

考察了Eclipse XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）3 種色譜柱對9 種季銨鹽分離效果的影響。發現9 種目標物在Eclipse XDB-C18柱和ACQUITY UPLC HSS T3柱上峰形不佳，出現較嚴重的拖尾，而在ACQUITY UPLC BEH C18柱上各物質峰形、響應、分離度良好（圖1）。因此，選擇ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱用于9 種季銨鹽分析。

圖1 不同色譜柱分離9 種季銨鹽類化合物的總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of nine QACs separated on three columns

2.1.2 流動相的選擇

首先，考察了以甲醇作為有機相，不同酸堿度水相對色譜分離的影響。結果表明，采用純水時，除TAHS外其余目標物峰形不佳，峰較寬。在水相中添加2 mmol/L乙酸銨溶液后峰形有所改善。采用0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸＋2 mmol/L乙酸銨溶液時目標物峰形最好，且二者相比后者響應更佳（圖2）。因此，最終選擇0.1%甲酸＋2 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液作為流動相。

圖2 不同流動相對9 種季銨鹽類化合物的總離子流圖Fig.2 TIC chromatograms of nine QACs using different mobile phases

2.1.3 柱溫的選擇

考察了40、35、30 ℃柱溫對目標物響應的影響。結果表明，柱溫30 ℃時目標物響應與室溫相比有所提高，此后，隨溫度上升響應不斷下降（圖3）。這可能是由于隨溫度的升高柱效先升高后降低，在30 ℃時對目標物得到最大柱效[24]。因此，將最終將柱溫設置為30 ℃。

圖3 不同溫度對9 種季銨鹽類化合物的總離子流圖Fig.3 TIC chromatograms of nine QACs separated at different column temperatures

以優化后的色譜條件分析目標物，9 種季銨鹽的提取離子流及總離子流色譜圖如圖4所示。

圖4 最優色譜條件下提取9 種季銨鹽類化合物的離子流色譜圖及總離子流圖Fig.4 Extracted ion current chromatograms and TIC chromatograms of nine QACs under optimal chromatographic conditions

2.2 質譜條件優化

將50 ng/mL季銨鹽混合標準溶液注入質譜儀中，根據目標化合物的相對分子質量，設定合適的質譜掃描范圍，對母離子正離子模式下的全掃描質譜進行分析，各物質的銨根離子峰響應值最高。接著，對各目標化合物依次進行子離子掃描，從而得到主要的子離子碎片，并對響應值高的子離子碎片進行碰撞能優化，確定最終的反應監測離子對、錐孔電壓、碰撞能量以及相應參數（表2）。

2.3 前處理方法優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

由于目標物在不同溶劑中溶解度不同，因此選擇合適的提取溶劑是保證提取效率的關鍵因素之一。以蘋果、白菜、魚為代表，考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇4 種提取溶劑對水果、蔬菜、水產3 種不同基質中目標物提取效果的影響。結果表明，蔬菜中，乙腈和甲醇對目標物的提取效率相當。水果和水產中，乙腈對9 種目標物的提取效率遠大于其他溶劑（圖5）。綜合考慮，選擇乙腈作為所有基質的提取溶劑。

圖5 不同提取溶劑對3 種不同基質中9 種季銨鹽類化合物回收率的影響（n＝3）Fig.5 Effects of extraction solvents on the recoveries of nine QACs (n=3)

提取溶劑的體積對提取效率也有重要影響，體積過小會導致目標物提取不完全，但體積過大會導致溶劑浪費增加成本?？疾炝巳恿繛? g時，5、10、15、20 mL乙腈對提取效果的影響，結果表明15 mL乙腈能基本完全提取水果和水產中的目標物。但對于蔬菜，使用20 mL乙腈對提取效率有明顯提升（圖6）。因此，提取溶劑體積確定為20 mL。

圖6 不同提取溶劑體積對3 種不同基質中9 種季銨鹽類化合物回收率的影響（n＝3）Fig.6 Effects of extraction solvent volume on the recoveries of nine QACs from three food matrices (n=3)

2.3.2 凈化條件

水果、蔬菜、水產基質中含有大量的有機酸、色素、脂質等物質，會造成ME，對目標物分析產生影響，因此需對提取液凈化。季銨鹽在有機溶劑中以陽離子形式存在，目前標準及文獻中多采用陽離子交換固相萃取柱對其進行凈化[14,22,25-26]。因此，本研究首先考察了強陽離子交換固相萃取柱（SCX）、弱陽離子交換固相萃取柱（WCX）、混合型陽離子交換固相萃取柱（MCX）和通用的親水親脂平衡固相萃取柱（HLB）的凈化效果。結果表明，對于3 種基質而言，與其他3 種固相萃取柱相比，使用WCX柱時目標化合物回收率略高，但依然無法達到50%，需進一步優化洗脫液pH值、流速及緩沖液離子強度等條件，操作繁瑣。QuEChERS法利用基質分散固相萃取的原理，使吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到凈化的目的，具有快速、簡便的優點。因此，之后考察了以PSA和GCB為吸附劑時QuEChERS法對食品基質的凈化效果，并與固相萃取柱的凈化結果進行比較。結果表明，QuEChERS法能夠大大減少目標物的損失，同時凈化效果滿足要求，初步選擇QuEChERS法對樣品進行凈化。

根據文獻報道，QuEChERS法中使用的GCB吸附劑在去除雜質的同時，也會對季銨鹽產生吸附，從而影響目標物的回收率[27]。因此，進一步考察了5、10、20、40 mg GCB對目標物回收率的影響。結果表明（圖7），GCB用量增加會導致回收率急劇下降。對大部分目標物而言，5 mg GCB能夠有效去除基質中色素等物質干擾，且對回收率影響較小。PSA和無水MgSO4的用量對目標物回收率影響較小，綜合考慮后確定凈化環節無水MgSO4、PSA和GCB的用量分別為2 g、400 mg和5 mg。

圖7 GCB用量對3 種不同基質中9 種季銨鹽類化合物回收率的影響（n＝3）Fig.7 Effect of GCB dosage on the recoveries of nine QACs from three food matrices (n=3)

2.4 方法學評價

2.4.1 ME考察

ME是ESI源容易出現的問題，嚴重的ME會影響定量方法的靈敏度和準確性，因此需要對方法的ME進行評價[28]。通過比較基質配制標準曲線斜率與純溶劑標準曲線斜率判定ME。若ME值低于-20%表現為基質抑制效應，ME值介于-20%～20%之間表現為弱ME，ME值高于20%表現為基質增強效應[29]。由表3可知，C12-BAC在蔬菜、水果、水產中以及DTAB在水產中存在基質增強效應。消除ME的方法主要為基質匹配標準溶液法和同位素內標法，考慮到各化合物之間性質各異，同位素內標無法完全對應，且價格高昂，選擇基質匹配外標曲線對樣品中的分析物進行定量分析[30]。

表3 9 種季銨鹽類化合物在蔬菜、水果、水產中的METable 3 Matrix effects of nine QACs in fruits,vegetables and aquatic products

2.4.2 線性范圍、檢出限及定量限

制備系列基質匹配混合標準溶液，以定量離子峰面積為縱坐標（y），以對應質量濃度為橫坐標（x），建立基質匹配標準曲線。在空白基質中采取低水平添加，以3 倍和10 倍信噪比對應的質量濃度作為各方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。結果表明，9 種季銨鹽化合物在2～200 μg/L范圍內線性關系良好，決定系數（R2）＞0.99（表4）。蔬菜和水果中9 種季銨鹽LOD為0.2～1.0 μg/kg，LOQ為1.0～5.0 μg/kg；水產中9 種季銨鹽LOD為0.5～5.0 μg/kg，LOQ為1.0～10 μg/kg。

表4 9 種季銨鹽類化合物的線性方程、決定系數、檢出限及定量限Table 4 Calibration curve equations,R2,LODs and LOQs for nine QACs

2.4.3 回收率及精密度

在3 種空白基質中進行9 種季銨鹽混合標準溶液的加標回收實驗，加標水平為目標物LOQ的1、2 倍和10 倍，每個質量濃度平行測定6 次，計算回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。結果顯示，9 種季銨鹽在蔬菜、水果、水產中的回收率為65.24%～118.63%，RSD為0.19%～6.77%（表5），表明該方法具有良好的回收率及精密度。

2.5 北京市市售樣品中季銨鹽含量分析

市售樣本檢測能夠反映食品中季銨鹽殘留污染情況。采用本研究建立的方法對北京市市售樣本進行測定，結果發現，69 份市售樣品中檢出季銨鹽陽性樣品21 份，總檢出率為30.43%。在李子樣品中檢出C12-BAC，含量為8.84～11.56 μg/kg。在黃瓜、圓白菜、西葫蘆、香蕉、車厘子、白菜、圣女果樣品中檢出DODMAC，含量為1.01～3.31 μg/kg，其中含量最高的樣品為白菜，含量為3.16～3.31 μg/kg（表6）。歐盟食品安全局對食品中BAC和DDAC的殘留量進行監測，數據顯示BAC（以C12-BAC～C16-BAC之和計算）在水果樣品中最高含量可達14.4 mg/kg，DDAC在動物產品中含量可達3.64 mg/kg[5]，而北京市食品中BAC檢出含量遠小于歐盟報告，同時未檢出DDAC。這或許表明BAC和DDAC在我國食品中的殘留情況好于歐盟。此外，在多個北京市食品樣品中檢出DODMAC，目前國際上尚未對該化合物提出限量或開展監測。DODMAC在歐洲商業消毒劑配方中較少使用[31]，但為我國使用較多的季銨鹽消毒劑成分[32]，因此該化合物殘留問題值得引起重視。同時，該結果能夠為制定季銨鹽限量標準提供參考。

表6 市售樣品中季銨鹽類化合物陽性檢出結果Table 6 Contents of QACs in commercial food samples in Beijing

2.6 北京市膳食樣品中季銨鹽含量分析

膳食研究是世界衛生組織推薦的用于研究和評估某一人群烹調加工過的、處于可食狀態的代表性膳食攝入的各種膳食化學成分的方法，是目前國際上公認的評價一個國家或地區大規模人群膳食中化學殘留物攝入量最為有效的方法[33]。采用本研究建立的方法對北京市蔬菜、水果、水產3 類膳食樣品進行測定，從而評估食品中季銨鹽殘留對北京市人群的健康風險。結果發現，25 份膳食樣品中檢出季銨鹽陽性樣品3 份，檢出率為12%，主要檢出物質為C14-BAC、C16-BAC、DODMAC、DDMOAC、DTAB和DB。其中，在茄子中檢出C14-BAC和DTAB，海帶中檢出C16-BAC、DODMAC和DDMOAC，梨中檢出DB（表7）。

表7 膳食樣品中季銨鹽類化合物陽性檢出結果Table 7 Contents,average daily intake and EDI of QACs in dietary samples in Beijing

使用EDI評估膳食樣品中季銨鹽殘留對人體的健康風險，其中，居民日均消費量來源于第六次總膳食研究北京市居民膳食消費量調查結果，茄子、海帶和梨的消費量分別為36.98、6.03 g和11.00 g，人群平均體質量按中國人均體質量63 kg計算[34]。季銨鹽殘留在不同樣品中的EDI見表7。與歐盟建議的BAC（以C12～C16BAC之和計算）ADI相比[35]，本研究所得EDI較小，同時其他季銨鹽殘留的EDI也處于較低的水平，說明北京人群季銨鹽膳食暴露風險低，在可接受范圍內。

3 結論

本研究建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS對蔬菜、水果、水產中9 種季銨鹽類消毒劑的檢測方法，填補了DDMOAC和DODMAC兩種化合物在食品檢測方法方面的空白。通過對提取方法、凈化條件、儀器方法等方面進行優化，最終選擇20 mL乙腈提取，2 g無水MgSO4除水，400 mg PSA、5 mg GCB凈化，基質匹配外標法定量。該方法操作簡便、靈敏度高、精密度良好，滿足食品中9 種季銨鹽類消毒劑定量分析要求。采用本方法對北京市市售樣品中季銨鹽含量進行分析，以調查殘留情況，結果發現北京市食品中季銨鹽殘留普遍低于歐盟報道，但在多個樣品中檢出DODMAC，這可能與我國消毒劑使用習慣相關，建議進一步進行風險監測并推動有關標準的建立。采用本方法對北京市膳食樣品中季銨鹽含量進行分析，以評估膳食攝入風險，結果發現北京人群季銨鹽膳食暴露風險低，在可接受范圍內。