基于衍生化3-氨基-2-惡唑烷酮的夾心酶聯免疫分析

張世偉，吳會玲，周迎春，王炳志，楊星星，杜業剛，湯 璐，馮榮虎,*，郭繼平,*

（1.深圳市計量質量檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.深圳市易瑞生物技術股份有限公司，廣東 深圳 518000）

免疫檢測以抗原抗體特異性反應為原理，具有時間短、成本低、操作簡單等優勢，被廣泛應用于食品安全、環境、臨床檢測中，主要有夾心法和競爭法兩種模式[1-2]。夾心法通過第一個抗體對體系內的抗原進行捕捉，再通過一個標記抗體形成抗體-待測分子-抗體的夾心復合物，正向輸出免疫識別信號。競爭法是目標分析物和人工抗原共同競爭結合抗體，隨著目標分析物濃度升高反向輸出免疫反應信號，由于競爭免疫檢測反應體系為競爭關系，目標分析物需要達到足夠的濃度才能抑制競爭物與抗體的結合，相較于夾心法，其靈敏度更低[3-5]。長期以來的觀點認為，小分子不能被兩個親和物同時親和，不能建立夾心免疫分析方法[6-7]。因此，夾心法一般用于檢測大分子，如蛋白、多肽，而競爭法主要用于檢測小分子[8-9]。

近年來，隨著他克莫司（804 Da）[10]、柚苷（580 Da）[11]、伊馬替尼（494 Da）[12]、四環素（460 Da）[13]等分子質量小于1 000 Da的小分子夾心酶聯免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）的建立，充分證明夾心ELISA適用于小分子，且能有效提高檢測靈敏度[14]。Qu Huihua等[15]建立了普納替尼（532 Da）的夾心ELISA，與同一抗體建立的競爭法相比，靈敏度提升了25 倍。因此，能否建立夾心免疫分析方法和分子質量并無直接關系，而是與表位之間的距離有關。Quinton等[16]認為兩個表位之間需要間隔5 ?即可建立夾心免疫分析方法。Bai Yuchen等[17]通過構建三聚氰胺和硝基苯胺偶聯物，建立了表位間隔距離僅為2.8 ?的夾心ELISA；同時該學者認為表位距離低于8.8 ?通常會引起明顯的抗體空間位阻，從而高概率地阻止夾心免疫分析。夾心ELISA雖然實現了對阿維菌素（887 Da）的檢測，但是檢出限（limit of detection，LOD）只有1 012.1 nmol/L，遠不及競爭ELISA。表位間隔距離多遠才能構建具有靈敏度優勢的夾心免疫分析方法，表位間隔距離多遠后不再對夾心復合物的形成效率產生影響，這個兩個問題仍然需要探索。

呋喃唑酮是一種經常被濫用的硝基呋喃類抗生素，其代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）的分子質量僅為102 Da。本研究從檢測方法的應用出發，將靈敏度不低于競爭法時的表位間隔距離定義為極限距離，而間隔距離對靈敏度無顯著影響時的距離為理想距離，并以AOZ衍生物為模型分子加以研究，以期為其他硝基呋喃類代謝物的高靈敏度檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AOZ抗體參考Cheng Chuchen等[18]的方法自制，LOD為20 pg/mL（競爭ELISA法）。ELISA反應檢測用試液配制見冷泉港實驗室手冊[19]。

3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）、抗生物素抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、親和素-HRP 美國Sigma公司；生物素亞砜、利地霉素 上海陶術生物科技有限公司；其他化學試劑購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

96 孔酶標板 美國康寧公司；Synergy H1酶標儀、405LS自動洗板機 美國BioTek公司；Allegra 64R高速離心機 美國貝克曼庫爾特公司；Milli-Q IQ 7003超純水機 美國Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 衍生物的合成

按圖1所示路線合成衍生試劑。將2.0 g 4-醛基-3-硝基苯甲酸甲酯用20 mL甲醇溶解后，加入5 mL 10%的NaOH溶液，60 ℃攪拌反應2 h，反應結束后，蒸干溶劑，加入稀鹽酸調為pH 3.0，用乙酸乙酯萃取，將有機相蒸干得到4-醛基-3-硝基苯甲酸1.5 g（化合物a）。

圖1 衍生試劑合成及衍生化反應路線Fig.1 Synthesis of derivatizing agent and pathway of derivatization reaction

稱取1.0 g化合物a，加入10 mL SOCl2，70 ℃攪拌反應3 h后蒸干溶劑，得到黃色油狀物（化合物b）。將3 mL的1,4-二氧六環緩慢滴加到20 mL含有5 g 1,6-己二醇和3 g三乙胺的1,4-二氧六環溶液中，室溫攪拌過夜，蒸干溶劑后使用硅膠柱層析純化得到淺黃色粉末（化合物c）。

稱取0.6 g化合物c、0.5 g生物素亞砜、0.2 g 4-二甲氨基吡啶、0.5 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，用10 mLN,N-二甲基甲酰胺溶解后，室溫攪拌反應過夜，蒸干溶解加水，用乙酸乙酯萃取后，再蒸干有機相經過柱層析純化得到淺黃色粉末，即衍生試劑BEN-Biotin。使用乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,7-庚二醇、1,8-辛二醇、1,9-壬二醇替代上述的1,6-己二醇合成不同長度連接臂的衍生劑。

1.3.2 AOZ-Biotin的合成

用10 mL甲醇溶解0.5 g衍生試劑BEN-Biotin，加入0.3 g AOZ，室溫攪拌過夜有大量沉淀析出，過濾出沉淀，沉淀用甲醇洗滌干燥后得到目標物，為淺黃色固體粉末。

1.3.3 生物素抗體親和位點的測定

在酶標板中包被生物素-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶聯物，每個孔100 μL，37 ℃孵育過夜，棄去包被液。在37 ℃使用質量分數為2% BSA的pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）封閉2 h后，洗板3 次。在酶標板中加入50 μL不同濃度的生物素、生物素亞砜或利地霉素，再加入50 μL HRP標記的抗生物素抗體，37 ℃孵育1 h后洗板3 次。加入TMB顯色液，37 ℃孵育15 min，加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應。使用酶標儀在450 nm波長處進行讀數。使用Origin 8.5軟件的四參數擬合得到擬合曲線，從而得到半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），并計算交叉反應率。

1.3.4 夾心ELISA

在酶標板中包被抗AOZ抗體，每個孔100 μL，37 ℃孵育過夜。棄去包被液。37 ℃使用2% BSA的pH 7.4 PBS封閉2 h后，洗板3 次。在酶標板中加入100 μL樣品液或AOZ-Biotin標準溶液，37 ℃孵育30 min后洗板3 次。加入100 μL HRP標記的抗生物素抗體或親和素，37 ℃孵育1 h后洗板3 次。加入TMB顯色液，37 ℃孵育15 min，加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應。使用酶標儀在450 nm波長處進行讀數。AOZ-Biotin標準溶液溶度換算成AOZ質量濃度（1 pg/mL AOZ-Biotin相當于0.17 pg/mL AOZ），并以此對數值為橫坐標，以ELISA吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 表位極限距離和理想距離測定

20 pg/mL的AOZ-Biotin按連接臂由短到長依次使用1.3.4節的方法進行測定。以空白＋3 倍標準偏差（n＝6）作為定性閾值。首個超過定性閾值AOZ-Biotin的表位間隔距離為極限間隔距離。當吸光度到達平臺區時的間隔距離為理想間隔距離。

1.3.6 樣品前處理

樣品衍生化前處理參考Vass等[20]所報道的方法并略作改進。稱取均質后的動物組織樣品2 g，加標樣品的劑量分別為30 ng/kg和100 ng/kg，加入4 mL甲醇、100 μL 1 mol/L鹽酸溶液和100 μL 10 mmol/L衍生試劑。37 ℃孵育16 h，期間每隔1 h使用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）對衍生產物的產率進行測定[21]。衍生后的樣品液離心取2 mL上清液，滴加飽和碳酸氫鈉溶液至不產生氣泡。使用0.01 mol/L pH 7.4 PBS定容至10 mL后待測。

1.4 數據處理與分析

本研究均為6 次平行測定并取其平均值。數據圖利用OriginPro 2018軟件繪制。ELISA標準曲線（圖5）為四參數擬合曲線。

2 結果與分析

2.1 衍生劑及衍生產物的鑒定

使用電噴霧電離-MS對衍生劑中間體（化合物C）、衍生劑（BEN-Biotin）和衍生產物（AOZ-Biotin）進行負離子模式掃描。由圖2可知這3 個化合物的分子離子峰分別為294.2[M-H]-、520.8[M-H]-、603.6[M-H]-，且響應值較大，證明目標化合物合成成功。

圖2 化合物C（a）、BEN-BIOTIN（b）及AOZ-BIOTIN（c）的質譜圖Fig.2 Mass spectra of compound C (a),BEN-BIOTIN (b) and AOZ-BIOTIN (c)

2.2 夾心模式下表位的極限距離和理想距離

小分子無法構建夾心免疫檢測方法的本質并非直接由分子質量導致，而多是因為表位間距小導致的空間位阻。如果兩個表位之間的距離足夠遠，該小分子也能被夾心結合。AOZ是禁用獸藥呋喃唑酮的代謝物，易與硝基苯甲醛發生高產率的胺醛縮合衍生反應[22-23]。因為其分子質量小，目前的免疫分析方法均基于該衍生反應檢測其衍生產物[24-25]。所制備的抗體對AOZ本身無交叉反應，只能識別其硝基苯甲醛衍生物，說明AOZ-Biotin中的區域A是抗體結合的主要區域（圖1）。AOZ-Biotin的另一端既能結合親和素也能結合抗生物素抗體。生物素-親和素主要結合區域為生物素的咪唑酮環（區域B）[26]。通過交叉反應實驗，生物素抗體能等同識別生物素和利地霉素（交叉反應率94%）而無法識別生物素亞砜（交叉反應率＜1%）。利地霉素與生物素具有相同的咪唑酮環，而生物素亞砜是生物素的氧化物產物（硫醚氧化為亞砜）。因此生物素抗體的識別區域既包含咪唑酮環也包含了噻唑環，即為區域C。

Quinton等[16]構建用不同長度飽和碳鏈連接HVA和HIS的模型分子，并使用HVA和HIS抗體進行雙親和，結果表明，兩個抗原表位只需要5 個碳原子的長度（約5 ?），即可形成夾心復合物。Bai Yuechen等[17]將此極限提高到2.8 ?。上述研究還證明兩個表位之間的距離越短，需要的親和反應時間越長，檢測靈敏度越差。增加待測物小分子的反應濃度和延長孵育時間均可提升這一極限，然而過低的靈敏度以及過長的孵育時間不利于該方法的實際應用。因此本實驗以捕捉抗體在競爭ELISA條件下能達到的檢測下限作為反應濃度，將二抗（或親和素）的孵育時間設定為1 h。

如圖3所示，當使用1,4-丙二醇作為連接臂時，吸光度超過定性閾值。此時，兩個表位之間的距離為12 ?（計算方法參考文獻[27]），此為雙抗夾心模式下的極限距離。當使用1,6-己二醇作為連接臂時，吸光度增加幅度趨于平緩。此時，兩個表位之間的距離為16 ?，為該模式下的理想距離。當使用1,4-丙二醇作為連接臂時，吸光度超過定性閾值。此時，兩個表位之間的距離為13 ?，為抗體-親和素夾心模式下的極限距離。當使用1,6-己二醇作為連接臂時，吸光度增加幅度趨于平緩。此時，兩個表位之間的距離為17 ?，為抗體-親和素夾心模式下的理想距離。說明雙抗夾心親和與抗體-親和素夾心親和在空間間隔上的要求幾乎相同。由于目前無法對小分子與抗體的結合域進行非常精確的判斷，因此得到的數據可能有5 ?以內的誤差。

圖3 不同連接臂AOZ-Biotin的夾心ELISA吸光度Fig.3 Absorbance of sandwich ELISA for AOZ-biotin using different spacer arms

2.3 AOZ夾心ELISA

由于硝基呋喃代謝物的分子質量過小，目前無論是色譜檢測還是免疫檢測均需要衍生劑進行衍生，因此衍生劑的衍生化效率對于硝基呋喃代謝物的檢測非常重要[28]。鄰硝基苯甲醛是一種高效的硝基呋喃代謝物衍生劑，被廣泛應用于硝基呋喃代謝物檢測中[29-30]。本實驗所使用的衍生劑BEN-Biotin的衍生化反應原理和鄰硝基苯甲醛相同，其醛基能夠很好地與硝基呋喃代謝物的氨基發生縮合反應。圖4為BEN-Biotin的衍生產率，反應1 h后衍生產率僅為40%，而AOZ衍生中常用的衍生劑鄰硝基苯甲醛可達到72%。但其反應12 h后衍生產率可達到89%，與鄰硝基苯甲醛較為接近。

圖4 AOZ-Biotin的衍生產率Fig.4 Derivatization efficiency of AOZ-biotin

如圖5所示，雙抗夾心和抗體-親和素夾心模式的IC50分別為22 pg/mL和12 pg/mL（以AOZ質量濃度計），LOD分別為1.8 pg/mL和0.8 pg/mL，線性范圍分別為2～200 pg/mL（R2＝0.991）和1～100 pg/mL（R2＝0.988），相較于使用相同抗體所建立的競爭ELISA，其靈敏度最高提升了25 倍。本實驗還考察了所建立方法對其他呋喃類藥物及其代謝物、代謝物的BEN-Biotin衍生物的交叉反應。如表1所示，該方法具有良好的特異性，與所測試結構類似物的交叉反應率均小于1%。

表1 與各結構類似物的交叉反應率Table 1 Cross-reactivity of the sandwich ELISA method with analogues

圖5 AOZ的夾心ELISA標準曲線（n＝6）Fig.5 Standard curves of sandwich ELISA for AOZ (n=6)

2.4 樣品檢測

將更為靈敏的抗體-生物素夾心ELISA應用于實際樣品檢測。魚肉和蝦肉樣品使用HPLC-MS/MS法確定為陰性樣品。在陰性樣品中添加AOZ分別至30 ng/kg和100 ng/kg。使用本研究建立的夾心ELISA對陰性樣品和添加樣品進行檢測，5 份陰性樣品未產生假陽性。樣品檢測結果如表2所示，回收率為73%～85%，平均相對標準偏差為9.0%。說明該方法能夠用于實際樣品的檢測。

表2 魚肉和蝦肉樣品的分析結果及回收率（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs for spiked fish and shrimp samples (n=6)

3 結論

本研究通過連接臂將鄰硝基苯甲醛和生物素偶聯，形成新的衍生試劑，構建了針對小分子化合物AOZ的兩種夾心免疫分析模式——雙抗夾心和抗體-親和素夾心模式。推算出在這兩種模式下表位之間的極限距離和理想距離，對現有的小分子夾心復合物形成規律進行了補充?；诳笰OZ抗體和親和素建立了AOZ夾心免疫分析方法。該方法衍生時間和衍生效率與現有的AOZ ELISA方法相同，在表位間隔17 ?時，夾心ELISA比競爭ELISA法靈敏度提升了25 倍。

該方法通過在小分子上人工嫁接第二表位并通過不通長度的連接臂連接，從而使小分子能同時被兩個物質親和（圖6）。本研究不僅從理論上總結抗原表位距離與夾心復合物之間的形成規律，而且所建立的AOZ夾心ELISA方法能應用于實際樣品檢測，具有靈敏度高、操作簡單的優點。所使用的衍生劑對硝基呋喃代謝物通用，能為其他硝基呋喃類代謝物的高靈敏度檢測提供參考。

圖6 基于衍生化反應的小分子夾心免疫分析方法示意圖Fig.6 Schematic diagram of sandwich ELISA detection of small molecules following derivatization reaction