基于UPLC-MS對七葉一枝花不同部位化學成分的比較分析

陳炬烽　熊長華　周建金　林燕華

【摘 要】 目的：比較分析重樓屬植物七葉一枝花的不同組織部位（葉片、莖稈、根莖、根）中化學成分的差異，科學合理開發藥用資源。方法：采用超高效液相和質譜聯用技術，結合代謝組學的方法，鑒定不同組織部位化學成分，檢測相對含量的大小，探討各類有機化合物的組成比例和分布規律。結果：七葉一枝花不同組織部位中共檢測出63種化合物，含9中甾體皂苷類，其余為萜類化合物和萜類，化合物成分在葉片、莖稈、根莖中的的相對含量和分布規律存明顯差異，采用主成分分析，能對不同組織器官進行直觀的鑒定區分。結論：液質聯用技術在中藥的質量分析和品質控制上具有較好的指導意義，結合代謝組學的分析方法，在樣品的分類鑒定上優勢明顯，數據結果也表明七葉一枝花在藥用資源的開發利用上具有較好的前景。

【關鍵詞】 七葉一枝花；超高效液相；液質聯用；化學分析；重樓皂苷

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）04-0018-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.04.zgmzmjyyzz202404005

Comparative Analysis of Chemical Constituents of Paris polphylla Smith var. chinensis Franch based on UPLC-MS

CHEN Jufeng1 XIAONG Changhua2 ZHOU Jianjin3 LIN Yanhua1*

Abstract：Objective Compare and analyze the differences of chemical components in different tissue parts （leaves， stems， rhizomes and roots） of Paris polphylla Smith var. chinensis Franch of Paris， in order to scientifically and reasonably develop medicinal resources.Methods The chemical components of different tissues and parts were identified by ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry combined with metabonomics， and the relative content was measured to explore the composition and distribution of various organic compounds.Results A total of 63 compounds were detected in different tissues and parts of Paris polphylla Smith var. chinensis Franch， including 9 steroid saponins， and the rest were terpenes and terpenes. The relative content and distribution of the compounds in leaves， stems， and rhizomes were significantly different. The principal component analysis can be used to visually identify and distinguish different tissues and organs.Conclusion The LC-MS technology has a good guiding significance in the quality analysis and quality control of traditional Chinese medicine. Combined with the analytical method of metabolomics， it has obvious advantages in the classification and identification of samples. The experimental results also show that the Paris polphylla Smith var. chinensis Franch has a good prospect in the development and utilization of medicinal resources.

Key words：Paris polphylla Smith var. chinensis Hara; Ultra High Performance Liquid Phase; LC-MS; Chemical Analysis; Paris Polyphylla Saponin

七葉一枝花Paris polyphylla Smith var. chinenisi （Franch）Hara是中藥重樓的基源植物之一，為多年生草本，藥用部位為根莖，其味苦，性微寒，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的功效［1］，是著名中成藥云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧等的主要組成成分，受到廣泛關注。

現已從重樓植物中分離鑒定出五十余種化合物，其中主要有效成分為甾體皂苷，約占總化合物數目的80％［2-3］，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物［4］，藥典中規定了重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ這三種成分的總含量不得少于0.60%，實際上重樓植物的其他組織部位同樣含有豐富的皂苷類化合物，并呈現豐富的藥理學活性［5］?，F有文獻主要是根據其中的藥典規定的幾種甾體皂苷進行比較分析［6］，并不能全面地反映化學成分的差異。為了合理的藥用資源開發，本文在液質聯用技術的基礎上，以皂苷類和萜類為目標物，對重樓植物的不同組織部位（葉、莖、根莖、根）的成分進行鑒定和定量分析，系統地比較了重樓植物不同組織部位各類成分的分布特征和相對含量差異，可以對七葉一枝花植物的不同組織器官進行質量評價，同時也為重樓屬植物的資源開發利用提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2022年8月，在福建省三明市寧化安遠鎮永躍村，采取7年生七葉一枝花的根莖、根、莖桿和葉片組織，每三株樣品作為一個生物學重復，重復3次。

1.2 儀器與試劑 日本島津UPLC液質聯用色譜儀（包括二元高壓泵），超高效液相色譜（UPLC;Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串聯質譜（MS/MS;Applied Biosystems 6500 QTRAP）。色譜柱：Agilent SB-C18，2.1 mm×100 mm， 1.8 μm。甲醇、乙腈、異丙醇為色譜純（德國默克），甲酸銨為分析純（上?；瘜W試劑廠），水為純化水。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備 將樣品放置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；在液氮環境下，采用研磨儀研磨成細粉（頻率30 Hz，研磨時間1.5 min），取約0.5 g，精密稱定，置離心管中，加70%甲醇2.0 mL，渦旋5 min，然后將充分溶解混勻的樣品連同離心管一起置冷凍離心機中離心（轉速10000 g，溫度：4 ℃，10 min），然后吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，保存于進樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.3.2 色譜條件及質譜條件的選擇 流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸），進行梯度洗脫（初始條件 B相比例為5%，9.00 min內B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；）。流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度550°C；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和氣簾氣（CUR）分別設置為50、60和25 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體（氮氣）設置為中等。通過進一步的去簇電壓（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy，CE）優化，完成了各個MRM離子對的DP和CE。

根據色譜中不同保留時間內的洗脫物，在每個時期監測一組特定的MRM離子對，同時監測正離子模式和負離子模式，得到樣品的MRM模式多峰圖，如圖1?；诒镜卮x數據庫（武漢邁維代謝公司自建的數據庫），對樣本的代謝物進行了質譜定性定量分析。圖中每個不同顏色的色譜峰代表檢測到的一個化合物。通過三重四級桿篩選出每個物質的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度（CPS），用MultiQuant軟件進行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積（Area）代表對應物質的相對含量，最后導出所有色譜峰面積積分數據保存。

2 結果

2.1 七葉一枝花不同組織部位中化合物成分分析 根據質譜分析的實驗結果，在七葉一枝花的不同的組織部位中，共鑒定了63種化合物成分，包含9種甾體類皂苷和54種萜類，詳細結果見表1。

2.2 七葉一枝花甾體皂苷類成分分析 甾體皂苷類具有顯著的藥理學活性，也是中藥重樓的藥用價值的物質基礎，七葉一枝花中的甾體皂苷主要是各種結構的重樓皂苷，從表1的結果可以看出，七葉一枝花中的甾體皂苷主要集中在根莖部位，其次是根、莖葉。具體含量數據統計如圖2所示。

根莖中含量最高的重樓皂苷H，在總提取物中占比25%以上，其次是重樓皂苷VI，占比12%以上；根、莖稈部位的甾體類成分組成和根莖類似，但相對含量逐漸變低。葉片中有很多重樓皂苷類成分未檢出（相對含量低于0.01%），主要的甾體皂苷成分為重樓皂苷B、重樓皂苷C或E（重樓皂苷E和重樓皂苷C是同分異構體，難以區分），葉片中的這兩類甾體皂苷，在根莖和根中含量極低。這也表明，根和莖中的甾體皂苷類，主要在根莖中代謝合成，并相互存在植物生長發育中的營養輸送關聯，而葉中的甾體皂苷類成分和根莖中的甾體皂苷，物質結構和類型不同，代謝途徑也不同，和根莖中的皂苷類關聯性較小。

2.3 七葉一枝花萜類化合物分析 從樣品的檢測結果看，七葉一枝花不同組織部位也檢測出大量的萜類化合物，包含單帖、倍半萜、二萜和三萜類等。此類化合物本身具有一定的藥理活性，在七葉一枝花中，也是合成重樓皂苷的前體化合物。

根莖中相對含量最高的是：7-O-coumaroyl-loganic acid（含香豆素結構的有機酸），相對含量占比10%以上，葉、莖中相對含量較高的主要有：14-hydro-15-ethoxyajugaptin（一種甾醇類化合物），相對含量在50%左右。其次，根中含量最高的是曼宋酮類，相對含量21%左右，以上這些成分均是和植物生理代謝相關的化合物，其中甾醇類是植物細胞膜結構的主要物質組成， 曼宋酮類化合物可以抑制土壤中微生物對植物的侵害，是根系里面保護作用的成分；同時，這類成分也具有一定的藥理活性，如曼宋酮類化合物具有抗菌、抗微生物、抗氧化、抗腫瘤及抗病毒等［7-8］，甾醇類調節心腦血管類功能等［9］。

其次，七葉一枝花的不同組織部位中，也檢出豐富的京尼平苷，尤其是葉中，相對含量達到4%。京尼平苷對消化系統、心血管系統和中樞神經系統疾病均有顯著療效，京尼平苷還有一定的抗炎和治療軟組織損傷的作用［10］。以上實驗結果，對葉片組織的開發應用提供了物質基礎。

七葉一枝花不同部位也檢出了熊果酸、齊墩果酸、松香酸等類似結構萜類化合物，此類成分的藥理活性也比較明顯，和皂苷類化合物共同組成了重樓植物的藥用價值的物理基礎。由于這些化合物的結構比較類似，物質解析結果的準確性存在一定的偏差，但能大致反映重樓七葉一枝花中包含大量此類結構化合物的信息。

2.4 七葉一枝花不同組織部位化學成分的主成分分析 基于數據庫分析的液質聯用技術，能較大范圍內篩查出待測目標物種的各類化合物成分，它不僅是代謝組學常用分析方法，也廣泛應用于目標物的基源鑒定和分類。其基本原理就是采用數學方法對大量的數據進行統計分析。其中主成分分析是常用的分析手段。

主成分分析 （principal component analysis， PCA） 是一種無監督模式識別的多維數據統計方法，PCA通過降維處理，在最大程度保留原始信息的基礎上，把所有的數據投影到幾個維度上，從而用低維信息來反映原始高維數據的特征。通過這種方式，來觀察數據的質量和分布，以及組間組內樣品的異同，進而尋找決定這種異同背后的因素。實驗中采用R軟件（www.r-project.org/）對數據進行處理，設置prcomp函數參數scale=True，表示對數據進行UV（unit variance scaling）處理，為了對七葉一枝花中的化合物成分進行整體的鑒定和分類，基礎數據來源于化合物組成和相對含量，也包含質控樣品（四類樣品的等比例混合物）的數據。建模分析結果PCA分析的得分圖如圖3所示。

通過上圖可以發現，七葉一枝花中莖的成分和根莖的成分相對較近，和根、葉的成分差異較大，這也基本反映了植物生理代謝化合物在植物體內的輸送過程。其次，同類型樣品之間，化合物組成和含量在主成分圖上的區域相對集中，也反映了植物代謝成分的相對穩定性和一致性。

根據以上分析方法建立的模型，可以對新的樣品進行類別判定，在同樣的方法學條件下，如果數據結果在得分圖上的距離較為接近可以判定為同一類樣品，這對于不同產地的七葉一枝花化合物成分的比較分析具有參考意義。

3 討論

根據以上的數據分析，確定七葉一枝花樣品中，除了含有豐富的三萜類化合物，還包含各種生物活性的有機酸類、皂苷類，這類成分在不同器官組織部位的含量分布差異明顯，通過統計學分析，可以快速地鑒別區分。其中藥理活性重樓皂苷，主要分布在根莖部位。其次，液質聯用的方法，結合代謝組學的統計算法，可以準確的分析檢測樣品中大量目標化合物信息，對于尋找新藥源、品質鑒定和資源開發有指導意義。

研究通過液質聯用技術對比分析七葉一枝花不同部位中藥中化合物成分，結合數據庫數據，鑒定出樣品中63種化學物質，初步確定了不同樣品中特征成分的差異和相對含量，為中藥資源的開發鑒定提供了參考。同時，根據液質聯用的分析方法結合數據統計學分析，對樣品中大量物質（離子對）信息進行綜合判斷，可以對樣品的類型、基源進行判定，或對近源的物種進行聚類，可以作為物質鑒定、產地判定的依據［11-13］。

藥典中的重樓藥材的含量測定方法中，前處理溶劑是乙醇，目標化合物是重樓皂苷類成分，實驗中的前處理方法是采用70%甲醇，極性更高，提取出來的成分更為豐富、復雜，但重樓皂苷類成分不一定能充分提取，例如實驗中也發現有部分重樓皂苷類未檢出（低于方法的檢測限），所以實驗中得到的重樓皂苷相對含量僅作為參考，不代表植物中的真實含量，但實驗中得到的總皂苷含量，基本能反應植物不同組織器官中化合物的分布規律，對資源的開發利用能提供有意義的參考。

從檢測的結果看，七葉一枝花的主要藥理活性成分集中在根莖部位，這也是重樓植物藥用部位的物質基礎，根系部位和莖桿組織的成分也較為豐富，但甾體類化合物（重樓皂苷類）的含量相對較低，藥理活性偏弱，其次也發現，在七葉一枝花的葉片組織中，化合物成分具有相對獨立性，不能代替根莖部位用藥，但其中存在特異性化合物，也具有藥用開發價值。

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（收稿日期：2023-05-12 編輯：劉 斌）

基金項目：福建省道地藥材生態種植及質量保障建設國家中醫藥管理局專項（國中醫藥規財函〔2021〕242號）;福建省星火項目 （2020S0020）；福建省科技特派員后補助項目?? （2021S2043）。

作者簡介：陳炬烽（1979—），男，漢族， 本科，助理研究員，研究方向為中醫藥研究。E-mail：40385531@qq.com

通信作者：林燕華（1987—），女，漢族，研究生，助理研究員，研究方向為中醫藥研究。E-mail：715169017@qq.com