白屈菜-元胡藥對逆轉乳腺癌阿霉素耐藥藥效物質研究

鄒 翔，張雪瑞，于佳慧，孫雨恒，張宇航，舒 淇，曲中原*

1.哈爾濱商業大學 藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076

2.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076

據美國癌癥協會最新統計，乳腺癌在女性癌癥發生率中居于首位[1]。臨床上，乳腺癌的治療常以手術為主，同時結合新輔助化療、內分泌治療和靶向治療[2]。蒽環類藥物如阿霉素通常與環磷酰胺和氟尿嘧啶等藥物聯合應用于新輔助化療方案，該方案對于III 期乳腺癌患者是一個有潛力的治療方案[3]。然而，部分腫瘤患者會對阿霉素產生耐藥性，極大地制約了癌癥治療效果，而其耐藥的主要機制包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）等跨膜蛋白介導的耐藥、藥物代謝酶的異常表達、DNA 損傷修復機制以及發生上皮細胞向間充質細胞轉化等[4]。因此，新型耐藥逆轉劑的篩選與研發仍是解決乳腺癌新輔助化療耐藥的主要問題。

白屈菜-元胡藥對（ChelidoniiHerba-Corydalis Rhizomadrug pair，CMCR）是中醫臨床用于治療腫瘤的藥對之一[5-6]。白屈菜是罌粟科植物白屈菜ChelidoniummajusL.的干燥全草，具有抗炎、鎮痛、止咳平喘的功效[7]。元胡又稱延胡索，為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，主要有活血化瘀、行氣止痛之功效[8]。近年來研究表明，白屈菜生物堿對多種癌細胞（如人非小細胞肺癌A549 細胞、人結腸癌HCT116、SW480 細胞、人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7 細胞）表現出細胞毒作用[9]，并能通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路來促使人乳腺癌阿霉素耐藥細胞（MCF-7/ADR）恢復對阿霉素的敏感性[10]。而元胡中生物堿可抑制人肝癌HepG2 細胞、HCT116 細胞、A549 細胞和人白血病HL60 細胞體外增殖[11]，并具有抑制乳腺癌細胞中P-gp 活性的能力，逆轉MCF-7/ADR 細胞對阿霉素的抗性[12]。此外，課題組前期研究也發現，CMCR 可通過下調雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表達水平和雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）mRNA 的表達水平，有效抑制ER 陽性乳腺癌細胞的增殖[5]。提示CMCR 具有良好的抗腫瘤作用和潛在的逆轉腫瘤細胞耐藥的作用，但其逆轉腫瘤化療耐藥的藥效尚需研究驗證，相應的藥效物質基礎研究也尚未系統開展。因此，本研究采用體外耐藥細胞模型對CMCR 各提取部位逆轉耐藥的藥效進行評價。同時，采用UPLC-Q-TOF-MS 技術分析不同配伍比例和不同提取部位下CMCR 的共有成分，篩選CMCR逆轉耐藥作用的藥效物質，進一步對CMCR 主要藥效物質組逆轉乳腺癌阿霉素耐藥的機制進行探究，為其在腫瘤化療耐藥方面的臨床應用提供指導，同時也為相關化療耐藥逆轉劑的研發提供科學依據。

1 材料

1.1 細胞

MCF-7/ADR 細胞由哈爾濱商業大學藥物工程技術研究中心提供。

1.2 藥材

白屈菜、元胡（醋）飲片均購自哈爾濱市匯仁藥材站，經哈爾濱商業大學藥學院曲中原教授分別鑒定為罌粟科植物白屈菜C.majusL.的干燥全草和罌粟科植物延胡索C.yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖。

1.3 藥品與試劑

對照品白屈菜堿、延胡索乙素、二氫血根堿、白屈菜紅堿（批號分別為 DST220428-079、DSTDY010101、DST220726-042、DST201109-040，質量分數≥98%）均購自成都德思特生物技術有限公司；阿霉素（批號N1111B，質量分數≥98%）、RPMI 1640 培養液購自大連美侖生物技術有限公司；羅丹明123（批號052621221101）、BCA 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；CCK-8 試劑盒（批號K101828133EF5E）購自美國APExBIO 公司；兔抗乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP）、肺耐藥蛋白（lung resistance protein，LRP）、P-gp 多克隆抗體（批號分別為 M05253192、G07143520、M05262395）均購自沈陽萬類生物科技有限公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號BJ08079044）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（批號3507442021）購自武漢ABclonal 生物公司；PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA eraser 試劑盒（批號RR047A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒（批號RR420A）均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；甲醇、乙腈、甲酸等其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.4 儀器

超高效液相色譜-G6500 系列四極桿-飛行時間質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；CO-150 型二氧化碳培養箱（美國NBS 公司）；iMark 型酶標儀［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；DYCZ-24DN 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ImageQuant LAS500 型分子生物成像儀（GE 通用電器醫療集團生命科學部）；Easy Cycler 96 型PCR 儀（德國Biometra 公司）；QuantStudioTM1 型實時熒光定量PCR 儀［英濰捷基（上海）貿易有限公司］。

2 方法

2.1 CMCR 各提取部位化學成分表征

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取白屈菜堿、延胡索乙素、二氫血根堿、白屈菜紅堿對照品各1.0 mg，分別加入甲醇進行超聲溶解，定容至5 mL 量瓶中，制成質量濃度均為0.2 mg/mL 的對照品溶液，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 按1∶1 比例稱取白屈菜、元胡粉末6、6 g，按2∶1 比例稱取白屈菜、元胡粉末8、4 g，分別加10 倍量95%、80%、70%、60%、50%乙醇超聲提取2 次，每次1 h；合并濾液，濃縮，得浸膏。加甲醇復溶，制成質量濃度為0.08 g/mL（以浸膏量計）的供試品溶液，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，備用。

2.1.3 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，20%B；4～17 min，20%～22% B；17～19 min，22%～100% B；19～24 min，100%～15% B；體積流量為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為0.2 μL；檢測波長為269 nm[13]。

2.1.4 質譜條件 電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正離子模式下的離子源電壓為4 500 V，離子源溫度為550 ℃。正離子模式下的碰撞能量為35 eV；霧化氣（gas1）壓力為379.225 kPa，輔助氣（gas2）壓力為34.475 kPa，氣簾氣（curtain gas）壓力為241.325 kPa。一級質譜母離子掃描范圍為m/z80～1 500；對信息依賴響應值超過100 cps的8 個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為m/z50～1 500[14]。

2.1.5 樣品檢測與數據處理 收集中國知網（CNKI）、PubMed 和ChemSpider 等數據庫中白屈菜和元胡的化學成分信息，建立數據庫。運用Agilent MassHunter Workstation 工作站軟件，以峰強度、保留時間（tR）和質譜數據對各色譜峰進行識別，計算測定化合物相對分子質量與理論值之間的誤差，篩選誤差小于1×10?5的化合物。根據化合物結構特征分析化合物裂解規律，與二級質譜圖進行對照，確定各化合物結構。關鍵化合物采用對照品或對照品譜圖對比進行進一步驗證。

2.2 CMCR 逆轉MCF-7/ADR 的耐藥作用

將對數生長期的MCF-7/ADR 細胞以3.5×104個/mL 接種至96 孔板，每孔100 μL，培養箱中過夜。設置對照組，不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）阿霉素組，不同質量濃度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 mg/mL）的CMCR 組，阿霉素（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）聯合CMCR 各提取部位組[各提取部位的20%抑制濃度（20% inhibitory concentration，IC20）]，每孔加入100 μL 藥液，對照組加入不含藥物的培養基，另設置不接種細胞的空白孔，每組設置6 個復孔。給藥72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，微量振蕩器上混勻3～5 min，采用酶標儀測定490 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率和耐藥逆轉倍數。

細胞增殖抑制率＝(A對照－A給藥)/(A對照－A空白)

耐藥逆轉倍數＝藥物IC50（不含逆轉劑）/藥物IC50（含逆轉劑）

2.3 共有成分峰面積與藥效指標相關性分析

2.3.1 Pearson 相關系數（Pearson correlation coefficient，PCC） 將均值化后的藥效物質的峰面積和藥效實驗中的逆轉耐藥倍數設為“變量”，采用SPSS 21.0 軟件中的雙變量相關分析法，計算PCC，各變量之間的系數絕對值越大，表明其線性相關性越強。據此，尋找與逆轉耐藥作用相關性較大的藥效物質。

2.3.2 灰色關聯度分析 （grey relational analysis，GRA） 以共有峰（峰面積）為子序列，以藥效實驗中的逆轉耐藥倍數為母序列，原始數據采用均值化法處理，利用DPS 數據分析系統進行分析，將子序列與相同母序列的關聯度，按從大小排序作為關聯序，可直接反映各子序列對母序列的“貢獻”程度，從而尋找與逆轉耐藥作用聯系較大的藥效物質。

2.3.3 偏最小二乘回歸（partial least squares，PLS）分析 將CMCR 不同提取部位共有成分峰面積和逆轉耐藥倍數的實驗結果導入SIMCA-P 14.1 軟件，將峰面積設為X變量，藥效指標設為Y變量，進行PLS 分析。

2.4 熒光顯微鏡檢測MCF-7/ADR 細胞內羅丹明123 的含量

取對數生長期的MCF-7/ADR 細胞，以2.5×105個/mL 接種于6 孔板中，2 mL/孔，于培養箱中培養24 h。設置對照組、阿霉素（6 μmol/L）組、低劑量白屈菜堿（3 μmol/L）-延胡索乙素（5 μmol/L）組、高劑量白屈菜堿（6 μmol/L）-延胡索乙素（10μmol/L）組、低劑量白屈菜堿（3 μmol/L）-延胡索乙素（5 μmol/L）聯合阿霉素（6 μmol/L）組和高劑量白屈菜堿（6 μmol/L）-延胡索乙素（10 μmol/L）聯合阿霉素（6 μmol/L）組，給予相應藥物后，繼續培養48 h，棄去上清液，PBS 清洗細胞2 次，加入5 μg/mL 羅丹明123，室溫避光孵育30 min。棄去上清液，用預冷的PBS 洗滌細胞2 次，熒光顯微鏡下觀察細胞內羅丹明123 含量（激發波長488 nm，發射波長525 nm）。使用Image J 軟件對熒光強度進行定量分析。

2.5 CCK-8 法確定白屈菜堿和延胡索乙素配伍比例及二者聯合用藥分析

將對數生長期的MCF-7/ADR 細胞以3.5×104個/mL 接種至96 孔板，每孔100 μL，于培養箱中培養24 h。白屈菜堿給藥組濃度為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，延胡索乙素給藥組濃度為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，按“2.2”項下方法檢測。將白屈菜堿和延胡索乙素的各組細胞增殖抑制率數據輸入Synergy Finder 網站進行聯合用藥分析，利用ZIP（零相互作用效力模型）系統地評估2 藥聯合應用引發的平均過量反應，預測可能出現的各種形式，ZIP 評分若＞10，說明2 藥聯合發生的反應超出了單藥作用時預期反應的10%，表明2 種藥物可能存在協同相互作用；ZIP 評分若為?10～10，表明2 種藥物的反應是加和相互作用；ZIP 評分若＜?10，表明2 種藥物可能存在拮抗相互作用[15]。

2.6 分子對接技術

從PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載白屈菜堿和延胡索乙素的2D 結構，利用Chemdraw 3D 轉為.mol2 格式。從RCSB 數據庫（https://www.rcsb.org/）獲得靶蛋白的晶體結構，使用AutoDockTools 1.5.6 將配體和受體文件轉換為pdbqt 格式，并通過去水及加氫處理來改進其結構。最后，在Discovery Studio 軟件（4.5.0 版本）中進行分子對接模擬。

2.7 Western blotting 測定MCF-7/ADR 細胞內耐藥相關蛋白的表達

取對數生長期的MCF-7/ADR 細胞，以2.5×105個/mL 接種于6 孔板中，2 mL/孔，于培養箱中培養24 h。按“2.4”項下方法進行分組和給藥，繼續培養48 h 后收集各組細胞，用RIPA 裂解緩沖液冰浴裂解，離心后收集蛋白。BCA 法進行蛋白定量，蛋白高溫變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，分別加入BCRP、LRP、P-gp、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜；1%TBST 洗膜后，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例為1 ∶1 500），室溫孵育2 h。利用ECL發光液顯色，采用凝膠成像儀曝光成像，應用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.8 qRT-PCR 檢測MCF-7/ADR 細胞內耐藥相關基因的表達

取對數生長期的MCF-7/ADR 細胞，以2.5×105個/mL 接種于6 孔板中，2 mL/孔，于培養箱中培養24 h。按“2.4”項下方法進行分組和給藥，培養48 h后，收集各組細胞，Trizol 法提取細胞總RNA，測定RNA 濃度及純度后按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應得到cDNA。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環。以GAPDH 為內參，采用 2?ΔΔCt法計算多藥耐藥蛋白 1（multidrug resistance 1，MDR1）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistant protein，ABCG2）、LRPmRNA 的相對表達量。引物序列：MDR1上游引物 5’-TTGCTGCTTACATTCAGGTTTCA-3’，下游引物5’-AGCCTATCTCCTGTCGCATTA-3’；ABCG2上游引物5’-ACGAACGGATTAACAGGGTCA-3’，下游引物5’-CTCCAGACACACCACGGAT-3’；LRP上游引物5’-AGCCAGCTATGCACCAACAC-3’，下游引物5’-CCTTGCAGGAGCGGTTATC-3’；GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 CMCR 不同提取部位化學成分鑒定結果

對CMCR 不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位（95%、80%、70%、60%、50%乙醇）化學成分進行解析鑒定，共獲得30 個共有成分（表1），包括異喹啉類生物堿、其他類生物堿、有機胺類等。

表1 UPLC-Q-TOF-MS 正離子模式下CMCR 不同配伍比例及提取部位的共有成分Table 1 Common components of CMCR in different compatibility ratio and extraction parts under positive ion mode of UPLC-Q-TOF-MS

3.2 CMCR 對MCF-7/ADR 細胞耐藥性的影響

CCK-8 實驗結果表明，阿霉素對MCF-7/ADR細胞的IC50為（23.58±1.03）μmol/L。如圖1 所示，CMCR 不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位作用于MCF/ADR 細胞72 h 后，抑制率最大的為CMCR（1∶1）95%乙醇提取部位組，其IC50為（450.57±24.18）μg/mL。如圖2 和表2 所示，CMCR不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位聯合阿霉素給藥后，阿霉素對MCF-7/ADR 細胞的IC50均有明顯下降，其中逆轉耐藥倍數最大的為阿霉素聯合CMCR（1∶1）95%乙醇提取部位組，逆轉耐藥倍數為11.08。結果表明，CMCR 能有效逆轉MCF-7/ADR 細胞對阿霉素的耐藥性，且在一定質量濃度范圍內，CMCR 的質量濃度與逆轉效果呈正相關。

圖1 CMCR 對MCF-7/ADR 細胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.1 Inhibitory effect of CMCR on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

圖2 CMCR 聯合阿霉素對MCF-7/ADR 細胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.2 Inhibitory effect of CMCR combined with adriamycin on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

表2 CMCR 逆轉MCF-7/ADR 細胞對阿霉素耐藥的作用Table 2 Reversing effect of CMCR on MCF-7/ADR cells to adriamycin

3.3 CMCR 化學成分與逆轉乳腺癌耐藥作用的相關性分析

CMCR 共有峰與逆轉耐藥倍數的PCC 見圖3-A，共有6 種有效成分的|PCC|＞0.80，影響值由大到小排序為G1＞G2＞G3＞G4＞G5＞G6。CMCR共有峰與逆轉耐藥藥效的GRA 結果如圖3-B 所示，有12 種有效成分灰色關聯度系數＞0.80，影響值由大到小排序為G1＞G2＞G6＞G3＞G12＞G8＞G7＞G10＞G15＞G9＞G16＞G13。對2 種分析方法的結果進行綜合分析可知，同時滿足|PCC|＞0.80 以及灰色關聯度系數＞0.80 的有效成分有5 種，分別為白屈菜堿（G1）、延胡索乙素（G2）、小檗堿（G3）、二氫血根堿（G6）、白屈菜紅堿（G10），初步確定該5 種化合物為CMCR 發揮逆轉MCF-7/ADR 細胞耐藥作用的潛在藥效物質。又由于白屈菜堿和延胡索乙素2種成分在GRA中關聯度最大，分別為0.900和0.897；同時，二者在Pearson 相關分析中也獲得了最大的相關系數，分別為0.910 和0.903，說明白屈菜堿和延胡索乙素與CMCR 逆轉耐藥的相關性最大。采用PLS 分析方法進行了再次驗證，得到了變量投影重要性（variable important projection，VIP）值，見圖4。一般認為|VIP|＞1 的X變量對于Y變量有顯著的影響，具有統計學意義。結果顯示，白屈菜堿和延胡索乙素的VIP 值排在前2 位，它們在逆轉耐藥藥效方面發揮了較大的貢獻。這個結論與前2 種相關性分析結果相印證。因此，進一步選擇白屈菜堿和延胡索乙素聯合配比應用，進行后續驗證實驗和機制研究。

圖3 CMCR 不同提取部位共有成分峰面積與逆轉耐藥作用相關性分析結果Fig.3 Correlation analysis between common component peak areas and resistance reversal efficacy of different extraction parts of CMCR

圖4 CMCR 不同提取部位共有成分峰面積與逆轉耐藥作用PLS 分析的VIP 圖Fig.4 VIP map of PLS analysis between common component peak areas and resistance reversal efficacy of different extraction parts of CMCR

3.4 白屈菜堿和延胡索乙素配伍比例的確定

為了進一步驗證潛在藥效物質，采用CCK-8 法測定白屈菜堿和延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞的增殖抑制作用，以確定二者最佳配伍比例。如圖5所示，白屈菜堿和延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞的IC20分別為（6.10±0.82）、（6.80±0.43）μmol/L，IC50分別為（17.80±0.86）、（38.95±1.38）μmol/L，表明白屈菜堿和延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞具有明顯的增殖抑制作用。由圖6 可知，白屈菜堿-延胡索乙素的ZIP 評分為5.158，表明2 種藥物的反應是加和相互作用。Synergy Finder 分析2 種藥物有效濃度范圍均在5～10 μmol/L，故延胡索乙素的低、高劑量設定為5、10 μmol/L?？紤]到課題組前期的白屈菜堿對MCF-7/ADR 細胞耐藥藥效學研究結果[10]，選用3、6 μmol/L 作為白屈菜堿的低、高劑量。綜上，后續實驗選用白屈菜堿和延胡索乙素2 種成分繼續探究CMCR 逆轉耐藥的相關機制。

圖5 白屈菜堿和延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.5 Inhibitory effects of chelidonine and tetrahydropalmatine on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

圖6 Synergy Finder 分析結果Fig.6 Synergy Finder analysis results

3.5 白屈菜堿-延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞內羅丹明123 含量的影響

羅丹明123 作為P-gp 的底物，通過P-gp 轉運而被排出細胞，易蓄積在P-gp 低表達的細胞中。熒光顯微鏡觀察白屈菜堿-延胡索乙素對MCF-7/ADR細胞內羅丹明123 含量的影響，可反映白屈菜堿-延胡索乙素對P-gp 表達的影響。如圖7 所示，對照組細胞內熒光強度最低；經阿霉素或不同濃度的白屈菜堿-延胡索乙素處理后的耐藥細胞，羅丹明123 在細胞質內的蓄積程度不斷增強，呈劑量相關性。與阿霉素組比較，白屈菜堿-延胡索乙素組聯合ADR組的熒光強度隨著藥物濃度的增加而顯著增強，表明白屈菜堿-延胡索乙素降低了P-gp對底物的外排，促進MCF-7/ADR 細胞內羅丹明123 的蓄積。

圖7 白屈菜堿-延胡索乙素聯合阿霉素對MCF-7/ADR 細胞內羅丹明123 蓄積的影響 (×400)Fig.7 Effect of chelidonine-tetrahydropalmatine combined with adriamycin on accumulation intensity of rhodamine 123(× 400)

3.6 白屈菜堿和延胡索乙素單體與BCRP、LRP、MDR1 蛋白分子對接結果分析

白屈菜堿與BCRP、LRP、MDR1 耐藥相關蛋白的對接得分分別為?35.56、?29.29、?30.96 kJ/mol，延胡索乙素與BCRP、LRP、MDR1 耐藥相關蛋白的對接得分分別為?29.71、?24.27、?25.52 kJ/mol，結果均小于?16.74 kJ/mol[29]，說明其具有潛在的結合活性以及低結合能量的穩定性。選取對接結合能量最低的構象用于對接結合模式分析，并使用Discovery Studio 4.5.0 軟件繪制3D 和2D 圖像（圖8）。

圖8 耐藥相關蛋白與活性化合物分子對接作用方式Fig.8 Docking mode of drug resistance related proteins and active compounds

3.7 白屈菜堿-延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞內耐藥相關蛋白和基因表達的影響

如圖9 所示，與對照組比較，不同濃度的白屈菜堿-延胡索乙素處理MCF-7/ADR 細胞后，P-gp、LRP、BCRP 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），MDR1、LRP和ABCG2mRNA 表達水平均顯著下調（P＜0.001），且高劑量組聯合阿霉素的作用最佳。表明白屈菜堿-延胡索乙素逆轉乳腺癌細胞阿霉素耐藥作用與下調P-gp、LRP、BCRP 蛋白及mRNA表達有關。

圖9 白屈菜堿-延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞耐藥相關蛋白和基因表達的影響 (±s, n = 3)Fig.9 Effect of chelidonine-tetrahydropalmatine on expressions of resistance-related proteins and genes in MCF-7/ADR cells (±s, n = 3)

4 討論

新輔助化療是乳腺癌的主要術前治療方法。在乳腺癌主要分型中，Luminal A 亞型患者占總體乳腺癌患者的70%，該亞型患者具有較低的病理分級和復發風險。然而，對于Luminal A 亞型患者進行新輔助化療后，觀察到病理完全緩解率低至10%，即病理學上完全消除腫瘤的比例較低[30-31]。阿霉素是一種用于新輔助化療的蒽環類藥物，聯合曲妥珠單抗、紫杉醇等藥物能顯著改善病理完全緩解率，但長期使用會使機體產生耐藥性和血液毒性[32]。近年來，中藥在乳腺癌治療方面得到廣泛應用，其既可以抑制乳腺癌的擴散和轉移，還能緩解西醫療法帶來的耐藥性，是腫瘤化療輔助治療的重要手段[33]。白屈菜-元胡藥對是中醫臨床治療乳腺癌的常用藥對之一，白屈菜苦辛、微溫，入肝、肺、胃；延胡索辛苦而溫，入肝、脾、心，二者聯用既能治血瘀疼痛，又能治氣滯疼痛，故而中醫常將白屈菜和元胡合用于肝郁氣滯型乳腺癌的早期治療[6]。本課題組前期研究以及文獻報道表明，白屈菜和元胡中的有效成分可通過下調乳腺癌耐藥細胞中P-gp 等耐藥相關蛋白的表達逆轉MCF-7/ADR 細胞對阿霉素的抗性[5,34-35]，但是CMCR 逆轉乳腺癌阿霉素耐藥的作用及藥效物質尚未得到系統闡明。

為此，本研究在采用UPLC-Q-TOF-MS 闡明CMCR 不同提取部位化學成分全貌及逆轉耐藥藥效的基礎上，運用2 種化學計量學方法考察30 個共有峰峰面積與CMCR 不同提取部位逆轉耐藥藥效的相關性，篩選確定白屈菜堿、延胡索乙素、小檗堿、二氫血根堿、白屈菜紅堿為CMCR 逆轉乳腺癌阿霉素耐藥作用的潛在藥效物質。近些年文獻研究表明，白屈菜堿可逆轉非小細胞肺癌吉非替尼耐藥，其機制為作用于表皮生長因子受體，激活磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-dependent/activated protein kinase，AMPK）信號通路，進而抑制線粒體的氧化磷酸化，誘導細胞凋亡[36]；延胡索乙素可以通過在ERα 上積累泛素鏈來促進ERα 降解，增強ERα 乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性[37]；小檗堿可激活AMPK 并降低其下游蛋白缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的含量，進而抑制P-gp 表達，增強阿霉素對乳腺癌耐藥細胞的敏感性[38]；二氫血根堿通過下調mut-p53 蛋白誘導G0/G1期和G2/M 期阻滯，通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路誘導細胞凋亡，進而抑制胰腺癌PANC-1 和SW1990細胞增殖作用[39]；白屈菜紅堿可有效抑制蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）的磷酸化，降低MDR1的轉錄水平，抑制P-gp 對化療藥物的轉運功能，進一步發揮逆轉耐藥作用[40]。以上研究結果提示CMCR 具有潛在逆轉乳腺癌阿霉素耐藥的作用，進一步采用PLS 分析得出白屈菜堿和延胡索乙素對MCF-7/ADR 細胞的逆轉耐藥作用的影響值最大，且它們又分別歸屬于2 種中藥的有效成分之一，故而將白屈菜堿聯合延胡索乙素作為CMCR 發揮逆轉耐藥作用的配伍成分進行了實驗驗證和機制探討。抑制膜轉運體的表達是中藥逆轉阿霉素耐藥的機制之一[41-42]。本研究采用熒光顯微鏡觀察發現，白屈菜堿-延胡索乙素可顯著增加MCF-7/ADR 細胞中P-gp 底物羅丹明123 的蓄積量。而Western blotting 和qRT-PCR 結果也表明，白屈菜堿-延胡索乙素可降低P-gp 等耐藥蛋白的表達，說明白屈菜堿-延胡索乙素組分可能是通過下調P-gp 的轉錄和表達進而減少阿霉素的外排，增加細胞內阿霉素濃度，最終發揮逆轉耐藥作用，但其分子機制尚待進一步深入研究。

本研究基于液質聯用技術，采用體外耐藥細胞模型闡明了CMCR 逆轉耐藥作用藥效物質，且其藥效物質組白屈菜堿-延胡索乙素能夠通過下調MCF-7/ADR 細胞P-gp、BCRP 和LRP 蛋白的轉錄和翻譯，抑制外排蛋白活性，增加細胞內阿霉素含量蓄積，進而發揮抗腫瘤作用。本研究為應對乳腺癌患者對阿霉素產生的耐藥性問題提供了新的研究思路和方法，并為進一步研究和開發CMCR 奠定了基礎。但CMCR 逆轉乳腺癌阿霉素耐藥性的確切機制還需進一步開展研究加以闡釋，是否存在其他通路參與逆轉耐藥也是下一步實驗開展的方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突