柴胡不同極性部位對肝癌SMMC-7721 細胞的影響及機制研究

王威宇 ，陳一笑 ，白帥東 ，馮建有 ，秦雪梅 ，高曉霞 *

1.山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006

2.山西大學 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006

3.地產中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室，山西 太原 030006

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，為前5 種最致命癌癥中唯一一種發病率每年增加的癌癥[1]。具有前期不易診斷、晚期致死率高等特點，嚴重威脅到患者的生命。而長時間使用腫瘤消融技術和化療治療不僅隨著時間增加會產生耐藥性，而且給患者增加了經濟負擔，而中醫藥在治療肝癌方面的功效日漸突出，其針對肝癌伴發病狀的改善、癌痛的減輕或減緩、癌癥患者生存期的延長等方面發揮著重大作用[2-4]。

柴胡是傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，具有疏散退熱、疏肝解郁的功效[5]。柴胡對肝纖維化，肝癌等肝臟性疾病療效顯著，以柴胡為君藥的柴胡類方防治肝癌成為臨床報道及研究的焦點[6]。張雯雯等[7]將小柴胡湯聯合肝動脈化療栓塞治療原發性肝癌療效顯著，顯著提高了患者生活質量；王克窮運用大柴胡湯于治療原發性肝癌[8]，取得了滿意的療效?，F代藥理學研究表明，柴胡注射液對人肝癌SMMC-7721 細胞有阻滯及促凋亡的作用[9]；小柴胡湯含藥血清誘導人肝癌HepG2 細胞凋亡和自噬[10]。柴胡有效成分柴胡皂苷能夠發揮抗肝癌作用，柴胡皂苷b2能夠通過調控絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4（serine/threonine-protein kinase 4，STK4）/白細胞介素-1 受體相關激酶1（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路抑制原發性肝癌[11]；柴胡皂苷D 對HepG2 細胞增殖和裸鼠肝癌形成具有抑制作用[12]。但柴胡其他有效成分如柴胡多炔、揮發油類等抗肝癌作用尚未研究。柴胡不同極性部位的化學成分不同，如課題組前期發現柴胡低極性部位含有多種多炔類成分[13]，因此探究柴胡不同極性部位的抗肝癌藥效和作用機制的研究尤為重要。

本研究以SMMC-7721 細胞及人正常肝細胞LO-2 為對象，明確柴胡不同極性部位抗肝癌藥效強弱，采用分子生物學與代謝組學的方法探究柴胡不同極性部位的抗肝癌作用與機制，從而在分子層面及代謝方面對柴胡抗肝癌機制有更深入的認識，為臨床肝癌治療提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞

SMMC-7721 和LO-2 細胞均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥材

北柴胡（批號1805215131）購自安國市吉騰達藥材有限公司，經山西大學秦雪梅教授鑒定為傘形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

DMEM 高糖培養基（批號E709FA0003）購自上海生物工程股份有限公司；0.25%胰酶（批號13F09A67）購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（批號20170621）購自天杭生物科技股份有限公司；MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；分析級石油醚、醋酸乙酯購自北京化工試劑；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購自北京北大藥業有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號PAB180007）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；SYBR Green PCR 試劑盒（批號KM4101）購自美國Kapa Biosystem 公司；逆轉錄試劑盒（批號639505）購自日本Takara公司；兔抗人神經元PAS 結構域蛋白2（neuronal pas domain protein 2，NPAS2）抗體（批號H00004862-D01）、細胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，CDC25A）抗體（批號PAB0425）購自Abnova公司；基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）抗體（批號HPA001238）購自美國Sigma-Aldrich 公司；B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號AB112）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號AG1208）購自Beyotime 公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號ab49822）購自英國Abcam 公司；組織金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）抗體（批號orb1248799）、細胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）抗體（批號orb804756）購自英國Biorbyt 公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇（批號分別為10009218、10006818、80109218）購自國藥集團有限公司；乙腈、甲酸（質譜級）購自Thermo Fisher Scientific 公司；β-actin 抗體（批號AC038）購自武漢愛博泰克公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗（批號A1054）購自美國Boster 公司。

1.4 儀器

Infinite M200 Pro 型酶標儀（瑞士Tecan 公司）；Neofuge 1600R/1600 型低溫離心機（力康集團）；D180 型細胞培養箱（瑞沃德生命科技有限公司）；NovoCyte 型流式細胞分析儀（ACEA 公司）；EPS300r 型電泳儀、5200 型化學發光分析儀（上海天能科技有限公司）；Q Exactive UPLC-MS 型超高效液相色譜與質譜聯用儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 柴胡不同極性部位及給藥溶液的制備

2.1.1 柴胡不同極性部位的制備 柴胡不同極性部位的制備詳見課題組前期報道[14]，以95%乙醇提取柴胡（1 kg），后采用石油醚萃取得到低極性部位（LPB）；石油醚萃取后剩余部位加入醋酸乙酯超聲萃取，得中極性部位（MPB）；醋酸乙酯萃取后，剩余部位與藥渣2 次水提物合并，得到高極性部位（HPB）。濃縮減壓干燥（60 ℃），分別得到LPB 64 g、MPB 33 g、HPB 168 g。LPB 含柴胡多炔RB2、RB4等代表性活性成分；MPB 含蘆丁、腺苷等成分；HPB含柴胡皂苷A、柴胡皂苷元G 等20 種皂苷成分。

2.1.2 給藥溶液的制備

（1）LPB 的制備：稱取約15 mg LPB 置于1.5 mL EP 管，加入150 μL DMSO，渦旋、超聲、離心，得到150 μL 質量濃度為0.1 mg/μL 的儲備液；取10 μL 儲備液加入到10 mL DMEM 高糖培養基中制得100 μg/mL 的工作液，依次稀釋工作液得到質量濃度分別為5、15、25、35、45、65 μg/mL（折合成生藥量分別為0.078、0.234、0.390、0.546、0.703、1.015 mg/mL）的給藥溶液。

（2）MPB 的制備：同LPB 的制備方法，得到質量濃度分別為2、4、6、8、14、16 μg/mL（折合成生藥量分別為0.061、0.121、0.181、0.242、0.424、0.485 mg/mL）的溶液。

（3）HPB 的制備：配制得到質量濃度為1 000 μg/mL（折合成生藥量為5.952 mg/mL）的給藥溶液。

2.2 細胞培養

SMMC-7721 和LO-2 細胞用含10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 μg/L 鏈霉素的DMEM 培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.3 MTT 法檢測SMMC-7221 和LO-2 細胞增殖

SMMC-7221 和LO-2 細胞分別以1×105個/mL接種于96 孔板中，100 μL/孔，培養24 h 待細胞貼壁后，設置對照組，LPB 組（生藥量0.078、0.234、0.390、0.546、0.703、1.015 mg/mL），MPB 組（生藥量0.061、0.121、0.181、0.242、0.424、0.485 mg/mL）和HPB 組（生藥量5.952 mg/mL），每組設3 個復孔。各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h。每孔加入100 μL 含10% MTT的培養基，培養4 h后棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩搖勻，采用酶標儀在490 nm 處測定吸光度（A）值，計算細胞存活率[9]。

2.4 流式細胞儀檢測SMMC-7721 細胞周期及凋亡

SMMC-7221 細胞以1×105個/mL 接種于6 孔板中，設置對照組，LPB（生藥量0.234、0.390、0.546 mg/mL）組和MPB（生藥量0.121、0.181、0.242 mg/mL）組，檢測細胞周期；設置對照組、LPB（生藥量0.390 mg/mL）組和MPB（生藥量0.181 mg/mL）組，檢測細胞凋亡。對照組僅加入培養基，其余各組加入相應藥物，培養24 h，收集細胞，按照文獻方法處理[15-16]，上機檢測細胞周期與凋亡。

2.5 劃痕實驗檢測SMMC-7721 細胞遷移

SMMC-7221 細胞以1×105個/mL 接種于6 孔板中，培養12 h 后，于孔中央用200 μL 槍頭垂直“一”字劃痕，用預冷的PBS 緩沖液洗滌以清除細胞碎片。設置對照組、LPB（生藥量0.390 mg/mL）組和MPB（生藥量0.181 mg/mL）組，對照組加入培養基，給藥組加入藥物，分別于0、12、24、36 h觀察劃痕傷口愈合情況并拍照，用Photoshop CS4 軟件“多邊形套索工具”計算劃痕面積[9]。

2.6 qRT-PCR 和Western blotting 檢測相關基因和蛋白表達

SMMC-7721 細胞以1×105個/mL 接種于6 孔板中，設置對照組、LPB（生藥量0.390 mg/mL）和MPB（生藥量0.181 mg/mL）組，對照組加入培養基，給藥組加入藥物，培養24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA 并合成cDNA，進行qRTPCR 分析，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

收集細胞，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細胞，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min 離心5 min，收集上清。BCA 法進行蛋白定量，蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1 h，用ECL 顯影，掃描條帶[9]。

2.7 代謝組學研究

2.7.1 分組及給藥處理 取8 mL SMMC-7221 細胞培養液置于培養皿中培養24 h，棄去培養液，分別加入8 mL LPB（生藥量0.390 mg/mL）和MPB（生藥量0.181 mg/mL）繼續培養24 h，以不加入藥物的SMMC-7221 細胞作為模型組，不加入藥物的LO-2 作為正常組，每組平行6 個樣本。刮取細胞，加入預冷PBS 離心清洗2 遍，超聲破碎細胞，乙腈沉淀蛋白，低溫13 000 r/min 離心15 min，取上清液轉移到干凈EP 管，于真空冷凍離心干燥機干燥。以200 μL 初始流動相（0.1%甲酸水溶液-乙腈9 1∶）復溶，低溫13 000 r/min 離心15 min，上清液進UPLC-MS 分析[17]。另各取正常組、模型組、LPB 組、MPB 組細胞樣本液20 μL 混合，作為質控樣本。

2.7.2 液相條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，2% B；4～5 min，2%～3% B；5～8 min，3%～15%B；8～13 min，15%～35% B；13～17 min，35%～55% B；17～23 min，55%～70% B；23～26 min，70%～80% B；26～28 min，80%～85% B；28～36 min，85%～95% B；36～38 min，95% B；38～40 min，95%～2% B；40～41 min，2% B；體積流量0.2 mL/min；進樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.7.3 質譜條件 采用ESI 離子化方式，噴霧電壓為正極3.5 kV，負極?2.5 kV；毛細管溫度320 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 arb；輔助氣體積流量10 arb；掃描模式為Full Scan/dd-MS2，采集范圍m/z100～1 500，正、負離子切換采集模式。分辨率采用MS Full Scan 35 000 FWHM，MS/MS 17 500 FWHM，碰撞能量為12.5、25、37.5 eV[18]。

2.7.4 數據處理 原始LC-MS/MS 數據raw 文件導入Compound Discoverer 3.0 軟件，使用SIMCA 14.1進行分析，結合變量投影重要性（variable importance in the project，VIP）＞1 和獨立樣本t檢驗P＜0.05篩選共線性最大的差異變量。差異代謝物鑒定指認主要通過相關文獻報道、HMDB 及NCBI 數據庫；接著將已鑒定的差異代謝物借助京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）在線數據庫及相關文獻報道富集到相關代謝通路。

2.8 統計學分析

SPSS statistics 16.0、Graphpad Prism 7.0、Excel 2016 等軟件處理，結果以±s表示。兩組數據間差異性比較采用SPSS 16.0 軟件進行t檢驗，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。

3 結果

3.1 柴胡不同極性部位對SMMC-7221 和LO-2 細胞增殖的影響

如圖1 所示，LPB 的質量濃度為0.078～1.015 mg/mL 時，顯著抑制SMMC-7721 和LO-2 細胞存活率（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性，其中對SMMC-7221 細胞的抑制作用更強；MPB 的質量濃度為0.060～0.484 mg/mL 時，顯著抑制SMMC-7721 和LO-2 細胞存活率（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關性，其中對SMMC-7221 細胞的抑制作用更強。HPB 的質量濃度為5.592 mg/mL 時，干預肝癌細胞24 h 后，肝癌細胞的存活率仍大于75%，藥效相較于LPB 和MPB 弱，故后續實驗未對該部位進行機制研究。

圖1 柴胡不同極性部位對SMMC-7221 和LO-2 細胞增殖的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of different polarity fractions of Bupleuri Radix on proliferation of SMMC-7221 and LO-2 cells(±s, n = 3)

3.2 LPB 和MPB 對SMMC-7221 細胞周期和凋亡的影響

如圖2-A 所示，與對照組比較，LPB（0.546 mg/mL）組G1期細胞比例顯著升高（P＜0.05），LPB（0.390、0.546 mg/mL）組S 期細胞比例顯著降低（P＜0.05），G2期細胞比例顯著升高（P＜0.05），表明LPB 阻滯SMMC-7721 細胞于G1期和G2期；如圖2-B 所示，與對照組比較，MPB（0.181 mg/mL）組G1期細胞比例顯著降低（P＜0.05），S期和G2期細胞比例顯著升高（P＜0.05）；MPB（0.242 mg/mL）組S 期細胞比例顯著降低（P＜0.05），G2期細胞比例顯著升高（P＜0.05）。根據半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值選擇LPB（0.390 mg/mL）組和MPB（0.181 mg/mL）組進行凋亡實驗。

圖2 LPB (A) 和MPB (B) 對SMMC-7721 細胞周期的影響 (±s, n = 3)Fig.2 Effects of LPB (A) and MPB (B) on cell cycle of SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

如圖3 所示，LPB（0.390 mg/mL）組和MPB（0.181 mg/mL）組作用于SMMC-7721 細胞24 h 后，細胞凋亡率明顯升高（P＜0.001）。

圖3 LPB 和MPB 對SMMC-7721 細胞凋亡的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effects of LPB and MPB on apoptosis of SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

3.3 LPB 和MPB 對SMMC-7721 細胞遷移的影響

如圖4 所示，與對照組比較，LPB 顯著抑制SMMC-7721 細胞遷移（P＜0.05、0.01），表明LPB具有抑制肝癌細胞遷移的作用。

圖4 LPB 和MPB 對SMMC-7221 細胞遷移的影響 (±s, n = 3)Fig.4 Effects of LPB and MPB on migration of SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

3.4 LPB 和MPB 對SMMC-7721 細胞周期、凋亡和遷移相關基因和表蛋白達的影響

3.4.1 細胞周期相關基因與蛋白表達 如圖5-A、B 所示，與對照組比較，LPB 組NPAS2、CDK1、CDK2、CyclinB1、CyclinEmRNA 表達水平均顯著下降（P＜0.05），CDC25A、CDC25BmRNA 呈下降趨勢；MPB 組CDC25B、CDK1、CyclinB1mRNA表達水平顯著下降（P＜0.05）。為了探究LPB 組誘導阻滯與生物鐘NAPS2基因的關系，采用Western blotting 檢測NAPS2、CDC25A 蛋白表達（圖5-C），結果顯示，LPB 組NAPS2、CDC25A 蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01）。

圖5 LPB 和MPB 對SMMC-7721 細胞周期 (A～C)、凋亡 (D) 和遷移 (E) 相關蛋白及基因表達的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effects of LPB and MPB on cell cycle (A—C), apoptosis (D) and migration (E) related protein and gene expressions in SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

3.4.2 凋亡相關蛋白表達 如圖5-D 所示，與對照組比較，LPB 和MPB 組Bax、Bax/Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P＜0.01、0.001）。

3.4.3 遷移相關蛋白表達 如圖5-E 所示，與對照組比較，LPB 和MPB 組MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01、0.001），MMP-9/TIMP-1值顯著降低（P＜0.01）。

3.5 代謝組學分析

3.5.1 代謝輪廓數據采集 采用課題組前期建立的UPLC-MS 方法[9]對正常組、模型組、LPB 組和MPB組樣品進行數據采集，分別采集正、負離子2 種模式來提高代謝物的覆蓋度。由總離子流色譜圖（圖6）可知，各組之間代謝成分具有差異。

圖6 正 (A)、負 (B) 離子模式下各組樣本總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatograms of samples in each group in positive (A) and negative (B) ion modes

3.5.2 差異代謝物分析與鑒定 偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）得分圖（圖7）可看出，正常組和模型組明顯分離，表明肝癌細胞與正常肝細胞內源性代謝產生差異；給藥組與模型組明顯分離。為了驗證模型可靠性，對上述模型數據進行排列實驗（permutation test，n＝200）；評判標準參考本課題組前期報道[18]；相關驗證結果表明模型可靠。借助HMDB 及NCBI 數據庫對正常肝細胞組和肝癌組的顯著性差異物進行鑒定，共鑒定出20 個與肝癌相關的差異代謝物（表2）。

圖7 各組肝細胞樣品PLS-DA 評分圖 (A、C) 及其模型驗證圖 (B、D)Fig.7 PLS-DA score chart (A, C) of hepatocyte samples in each group and its model validation chart (B, D)

表2 各組樣本差異代謝物Table 2 Differential metabolites of samples in each group

3.5.3 LPB 和MPB 對差異代謝物的影響 如圖8 所示，與模型組比較，LPB 能夠回調的肝癌細胞差異代謝物有7 種，MPB 組能夠回調的肝癌細胞差異代謝物有12 種。LPB 和MPB 能夠共同干預3-磷酸甘油酸、乙酰肉堿、谷氨酰胺和尿苷等差異代謝物；LPB能夠干預谷氨酸、次黃嘌呤和黃嘌呤等差異代謝物；MPB 能夠干預神經酰胺（d18∶1/16∶0），溶血卵磷脂（14∶0/0∶0）、肉桂酸、2-羥基己酸、甘膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、L-正亮氨酸和5′-磷酸腺苷等代謝物。

圖8 各組差異代謝物相對含量變化Fig.8 Changes in relative content of differential metabolites in each group

3.5.4 差異代謝物的代謝通路分析 為更好地分析各差異代謝物在各組間的內在聯系，借助在線KEGG 數據庫對上述差異代謝物進行整合代謝通路分析（圖9）。7 種LPB 和12 種MPB 回調的差異代謝物涉及甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、糖酵解途徑、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和核苷酸代謝途徑等。

圖9 差異代謝物的代謝通路分析Fig.9 Metabolic pathway analysis of differential metabolites

4 討論

已有研究表明，使用中醫藥作為術后輔助治療可以取得更好療效，如調補氣血、疏肝理氣和恢復體質[19]。此外，中醫藥可以緩解患者的腫瘤癥狀，控制腫瘤的大小，從而提高患者的生活質量并延長患者的生存時間[20]，因此探究中藥在癌癥治療的作用機制至關重要。柴胡歸肝、膽經，具有疏肝解郁等功效，臨床上以柴胡為君藥的柴胡類方用于治療肝癌?，F代藥理學研究也表明，柴胡有效成分如柴胡皂苷D 能夠抑制腫瘤生長，通過調控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）信號通路誘發肝癌細胞自噬[21-22]。因此柴胡不同極性部位抑制肝癌細胞增殖以及誘導其凋亡的作用機制需要深入探究。

研究表明，細胞周期由大量調節蛋白參與，主要受CDK-Cyclin 復合物的調控，是細胞周期的核心過程。相關癌癥數據提示CDK-Cyclin 復合物在癌組織中表達增高，而癌旁組織表達相對較低，提示癌癥的大量增殖可能與CDK-Cyclin 復合物的表達密切相關[23-24]。同時細胞周期節律基因的紊亂與腫瘤的發生、發展密切相關，且已在乳腺癌等腫瘤中得到證實[25]。Npas2基因在肝癌細胞中高表達，且為哺乳動物中最大的生物鐘基因，而CDC25A 的轉錄表達受到NPAS2基因的調控[26]，且可以調控Bcl-2 蛋白去磷酸化參與肝癌細胞凋亡。CDC25B 為G2/M 期過度的關鍵基因，通過調節下游CDK1-Cyclin B1 復合物去磷酸化參與G2/M 期的進程[27-29]。本研究發現，LPB 作用于細胞后，G1和G2期細胞比例增加，表明LPB 可通過阻滯肝癌細胞周期，從而影響肝癌細胞增殖。qRT-PCR 及Western blotting結果表明，LPB 可能通過下調NPAS2 表達，進而導致CDK2-Cyclin E 復合物表達下調，肝癌細胞過度到S 期受阻，G1期細胞大量增多，同時通過下調CDC25B基因表達，引起CDK1-Cyclin B1 復合物表達下降，干預G2/M 肝癌周期進程，發揮抑制肝癌增殖細胞的作用。LPB 可能會通過下調Npas2，進而下調CDC25A 的表達，下調Bcl-2 蛋白去磷酸化，從而促進肝癌細胞凋亡；而MPB 作用于肝癌細胞后，主要表現為G2期細胞比例增加，表明MPB 可通過阻滯肝癌細胞周期，影響細胞增殖。qRT-PCR結果表明，MPB 通過下調CDC25B基因，進而引起CDK1-Cyclin B1 復合物表達下降，干預G2/M 肝癌周期進程，發揮抑制肝癌細胞增殖的作用。MPB 通過升高Bax/Bcl-2 比值，促使Cyt-C 從線粒體釋放，進而激活下游Caspase-3 蛋白，從而引起肝癌細胞凋亡（圖10）。

圖10 柴胡不同部位抑制增殖及促進凋亡機制通路圖Fig.10 Pathways of mechanism of inhibition of proliferation and promotion of apoptosis in different polarity fractions of Bupleuri Radix

采用代謝組學方法鑒定了20 個與肝癌相關的差異代謝物，其中LPB 能夠回調7 種差異代謝物，MPB 能回調12 種，并利用KEGG 數據庫對差異代謝物進行整合通路分析。研究表明，鞘磷脂代謝改變和腫瘤增加密切相關[30]。神經酰胺為鞘脂代謝的中心紐帶分子，在調節癌細胞惡性增殖及抑制腫瘤增殖發揮重要角色[31-32]。本研究結果發現LPB 能調控C16 神經酰胺合成，激活內質網應激，從而發揮促進肝癌細胞凋亡。研究表明，癌細胞增殖所必需的葉酸代謝和氧化還原穩態的平衡可能需要活性絲氨酸合成，3-磷酸甘油酸是合成絲氨酸的原料[33]。肝癌細胞中3-磷酸甘油酸含量大幅增加，LPB 和MPB 干預后，含量被回調接近至正常組發揮抗肝癌作用。谷氨酰胺的增加會導致腫瘤細胞快速生長[34]，可以調節程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）的表達通過Wnt/β-連環蛋白途徑，因此可能是肝細胞癌的新治療靶點[35]。而LPB 和MPB 組可以顯著逆轉肝癌導致的谷氨酰胺含量，達到抗肝癌作用。

綜上，LPB 和MPB 能夠抑制肝癌細胞的增殖而且能夠使其凋亡，肝癌細胞阻滯于G1期主要與Npas2-CDC25A-CDK2-Cyclin E 通路有關，阻滯于G2期主要與CDC25B-CDK1-Cyclin B1 復合物有關，凋亡主要與Npas2-CDC25A 靶點以及激活線粒體凋亡途徑相關，代謝組學結果顯示肝癌的發生與甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、糖酵解途徑、氨基酸代謝和核苷酸代謝7 種代謝通路的紊亂密切相關。LPB 主要通過干預脂肪酸代謝、糖酵解、氨基酸代謝和核苷酸代謝4 種途徑發揮抗肝癌作用，MPB 主要通過干預甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、糖酵解途徑、氨基酸代謝和核苷酸代謝7 種途徑發揮抗肝癌作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突