基于一測多評結合熵權逼近理想解排序法對綿馬貫眾炭的質量評價

董雙濤，徐麗霞，高建平，李寶霞*

1.山西藥科職業學院，山西 太原 030031

2.山西醫科大學藥學院，山西 晉中 030600

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨DryopteriscrassirhizomaNakai 的干燥根莖和葉柄殘基，始載于《神農本草經》，主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、河北及內蒙古等地[1-2]，所含化學成分有間苯三酚類、黃酮類、甾體類、萜類和苯丙素類等[3-6]。綿馬貫眾炭由綿馬貫眾炮制加工而成[7]，收澀止血，臨床上常用于治療崩漏下血、衄血、吐血、便血、外傷出血等多種出血證[8-9]。綿馬貫眾炭收載于《中國藥典》2020 年版一部，但質量控制僅局限于性狀、薄層鑒別及浸出物測定等常規項，質控標準相對落后。中藥成分復雜，易受產地、炮制方法和采收時間影響，為保證臨床療效，建立科學合理質量評價模式對綿馬貫眾炭整體質量評控具有重要意義。本研究收集16 批綿馬貫眾藥材，按《中國藥典》2020 年版綿馬貫眾炭項下的炮制方法依法炮制，采用一測多評（QAMS）法同時測定綿馬貫眾炭中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷含量，并結合多元統計分析和EW-TOPSIS 法建立綿馬貫眾炭質量研究模型，綜合評價不同產地所得綿馬貫眾炭的整體質量優劣。

1 材料

1.1 試藥

對照品大豆素（批號111502-202304，質量分數99.3%）和異槲皮素（批號111809-202205，質量分數96.3%）來源于中國食品藥品檢定研究院；山柰素（批號PRF9022621，質量分數99.9%）、圣草次苷（批號PRF9121402，質量分數98.5%）、偽綿馬素（批號PRFM8042518，質量分數98.2%）和綿馬貫眾素ABBA（批號PRFM220725-01，質量分數97.6%）來源于成都普瑞法科技開發有限公司； 對照品白綿馬素 AA （ 批號RFSB14102203029，質量分數98.0%）來源于成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；二去甲基偽綿馬素AA（批號P27A11S122507，質量分數98.2%）和去甲氧基莢果蕨素（批號Z27J11S103919，質量分數96.2%）來源于上海源葉生物科技有限公司；對照品白綿馬素AP（批號CFS202201，質量分數98.3%）、綿馬酸ABA（批號CFS202102，質量分數96.5%）來源于武漢天植生物技術有限公司；綿馬貫眾經山西藥科職業學院李寶霞副教授鑒定為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨D.crassirhizomaNakai 的干燥根莖和葉柄殘基，按照《中國藥典》2020 年版方法制成綿馬貫眾炭，詳細信息見表 1；高效液相用乙腈和磷酸為Merck 公司色譜純試劑，甲醇為分析純。

1.2 儀器

FRQ-1010T 型超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；色譜柱Symmetry C18、Agilent Zorbax C18和Apollo C18，規格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm）；ME24102/XS205Du 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定后用70%甲醇制成含白綿馬素AA 0.226 mg/mL、二去甲基偽綿馬素AA 0.114 mg/mL、偽綿馬素0.31 mg/mL、白綿馬素AP 0.058 mg/mL、綿馬酸ABA 0.082 mg/mL、綿馬貫眾素 ABBA 0.57 mg/mL、山柰素 0.436 mg/mL、大豆素0.074 mg/mL、去甲氧基莢果蕨素2.39 mg/mL、異槲皮素0.278 mg/mL 和圣草次苷0.042 mg/mL 的貯備液；精密吸取貯備液1 mL，經70%甲醇稀釋20 倍，搖勻，即得白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷質量濃度依次為11.3、5.7、15.5、2.9、4.1、28.5、21.8、3.7、119.5、13.9、2.1 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取各產地綿馬貫眾綿馬貫眾炭粉末約1.0 g，精密稱定，加70%甲醇約20 mL，超聲提取30 min，冷卻，經提取溶劑定容至25 mL，搖勻，靜置，濾過，即得。

2.3 色譜條件

采用Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長298 nm 檢測白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA 和綿馬貫眾素ABBA，330 nm 檢測山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷；流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），分析時長60 min，梯度洗脫條件：0～11 min，52.0% B；11～18 min，52.0%～60.0% B；18～34 min，60.0%～85.0%B；34～53 min，85.0%～90.0% B；53～60 min，90.0%～52.0% B；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.4 HPLC 方法學考察

2.4.1 耐用性試驗 取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣，結果基線平穩，供試品溶液中11種成分的保留時間與對照品基本一致，且與相鄰色譜峰分離效果符合《中國藥典》2020 年版要求，見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和綿馬貫眾炭樣品 (B) 色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference (A) and Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma Carbonisatum sample (B)

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.1”項儲備液適量，分別用70%甲醇稀釋4、10、20、40、100 和200 倍制成一定質量濃度差的6 份溶液。各精密吸取10 μL 進樣。橫坐標（X）為白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷對照品的質量濃度，縱坐標（Y）為相應色譜峰峰面積。對11個成分峰面積繪出標準曲線，結果見表2，r均大于0.999，11 個對照品在相應質量濃度范圍內線性關系良好。

表2 11 個成分的線性回歸結果Table 2 Linear regression results of 11 components

2.4.3 精密度試驗 取綿馬貫眾炭（S1）樣品制成的供試品溶液1 份，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6 次，結果白綿馬素AA 等11 個成分峰面積RSD 值依次為0.66%、0.52%、1.06%、0.83%、1.38%、1.54%、1.67%、0.71%、1.68%、1.46%、1.39%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取綿馬貫眾炭（S1）樣品按“2.2” 項下方法制成的供試品溶液，分別于室溫下放置 0、2、5、9、14、20、24 h，按“2.3”項下色譜條件進樣，結果白綿馬素AA 等11 個成分峰面積RSD 值依次為1.01%、0.95%、1.58%、1.05%、1.61%、1.55%、1.85%、1.12%、1.91%、1.78%、1.46%。

2.4.5 重復性試驗 取綿馬貫眾炭（S1）樣品6 份，分別按“2.2”項下方法制成供試品溶液，各精密吸取10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄白綿馬素AA等11 個成分的峰面積，外標法計算11 個成分的質量分數，計算各成分含量的RSD 值依次為1.09%、0.91%、1.28%、1.16%、1.76%、1.85%、1.79%、1.32%、1.96%、1.76%、1.80%，表明重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取9 份同批次已知11 個成分含量的綿馬貫眾炭（S1）細粉，每份約0.5 g，精密稱定，按已知各成分含量的80%、100%、120%加入混合對照品溶液（含0.129 mg/mL 白綿馬素AA、0.068 mg/mL 二去甲基偽綿馬素AA、0.224 mg/mL 偽綿馬素、0.032 mg/mL 白綿馬素AP、0.047 mg/mL 綿馬酸ABA、0.391 mg/mL 綿馬貫眾素ABBA、0.283 mg/mL 山柰素、0.041 mg/mL 大豆素、1.762 mg/mL 去甲氧基莢果蕨素、0.157 mg/mL 異槲皮素和0.024 mg/mL 圣草次苷的溶液），每個水平制備3 份，再按“2.2”項方法制得加樣供試品溶液。各精密吸取10 μL，按照確立的色譜條件進樣，結果白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷加樣回收率分別為98.23%、97.95%、99.44%、97.70%、96.99%、100.01%、99.06%、100.15%、98.16%、99.52%、96.95%；RSD 分別為1.34%、1.40%、0.86%、1.34%、0.84%、0.77%、1.04%、1.89%、0.75%、1.50%、1.48%。

2.5 一測多評法質量評價模式的建立[10]

2.5.1 相對校正因子（f）的計算 按照確立的色譜條件，依法進樣“2.5”項6 份混合對照品溶液，以綿馬貫眾素ABBA 為內參物，按照公式計算各成分的f值。計算結果見表3，各成分f的RSD 均小于2.0%，提示f的均值可作為定量用。

f＝(ρi×As)/(ρs×Ai)

ρi和ρs分別為內參物和其他待測成分的質量濃度、Ai和As分別為內參物和其他待測成分的峰面積

2.5.2f穩健性考察 為了考察計算得到的f的穩健性，本試驗通過考察不同儀器及色譜柱、改變流速和柱溫對f的影響來評價。選用液相色譜儀（Agilent 1260 型和Waters Arc）和色譜柱（Symmetry C18柱、Agilent Zorbax C18柱和Apollo C18柱），體積流量（1.0±0.2）mL/min，柱溫（30±5）℃等條件，取“2.1”項下混合對照品溶液進樣，結果各成分的f值在以上條件改變時變化不顯著（RSD 均小于2.0%），提示建立的f穩定性良好。

2.5.3 色譜峰定位 記錄“2.5.2”項不同儀器與不同色譜柱時各成分色譜峰保留時間，采用相對保留時間值（t）法對色譜峰進行定位，結果各成分t值變化不顯著（RSD 均小于2.0%），且出峰順序不會改變，提示該法可用于綿馬貫眾炭中多組分色譜峰的定位（表4）。

表4 各成分的相對保留時間值Table 4 t value of various constituents

2.6 樣品常規外標法（ESM）和QAMS 法的準確性比較

16 批綿馬貫眾炭樣品（S1～S16），按“2.2”項流程制備供試品溶液（每批平行3 份），各精密吸取10 μL 按照確立的色譜條件進樣。運用ESM 法計算白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的含量，再以綿馬貫眾素ABBA 為內參物，利用上述建立的各成分f的均值，采用QAMS法計算樣品中其他成分的含量，再運用SPSS 26.0統計軟件的獨立樣本t檢驗法對各組分2 種方法所得數據進行分析，結果P＞0.05，提示2 種方法所得16 批綿馬貫眾炭樣品中11 個成分的含量結果沒有顯著的差別，見表5。

2.7 多元統計分析法[11]評價模式的建立

以16 批綿馬貫眾炭中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的含量數據（QAMS 法）為變量，借助SIMCA 14.1 軟件對16×11 矩陣數據構建PCA 模型（圖2），提取出2個主成分[12]，16 批綿馬貫眾炭樣品自動聚焦為3個象限，分成3 組，且所有數據點均在95%橢圓置信區間內，表明所有檢測數據無異常。進一步運行OPLS-DA，結果16 批樣品聚類良好，模型參數R2X＝0.928、R2Y＝0.822、Q2＝0.760，均大于0.5[13]，表明建立的模型穩定可靠、預測能力好（圖3 和圖4）。結合變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值法篩選對樣品分組起關鍵作用的變量，以VIP 值＞1.0 的變量作為標準，圖4 顯示VIP＞1 的組分分別為去甲氧基莢果蕨素（VIP＝2.102）、綿馬貫眾素ABBA（VIP＝1.503）、偽綿馬素（VIP＝1.276）和山柰素（VIP＝1.159），表明上述4 個組分對不同產地綿馬貫眾炭質量差異影響顯著。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 PCA score chart

圖3 16 批綿馬貫眾炭OPLS-DA 得分圖Fig.3 Score chart of OPLS-DA model for 16 batches of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma Carbonisatum samples

圖4 OPLS-DA 模型的VIP 圖Fig.4 VIP plot of OPLS-DA model

2.8 熵權TOPSIS[14]分析法的建立

設置16 批綿馬貫眾炭樣品中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的QAMS含量值為bc（b＝1，2，3，……，16；c＝1，2，3，……，11），組成多指標16×11 數據矩陣。由于以上11 種成分為正向指標，根據公式（1）對16×11 矩陣數據進行歸一化，以OPLS-DA 中白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的VIP 值為權重，將處理后的矩陣數據與各成分權重相乘得加權決策矩陣。再以決策矩陣中各成分的最大值為最優向量（Z+），最小值為最差向量（Z?），再按照最優向量歐氏距離（Db+）計算公式（2），最差向量歐氏距離（Db?）計算公式（3），相對貼近度（Jb）計算公式（4）分別計算Db+、Db?和Jb值，并根據Jb值的大小對樣品質量進行排序（表6）。從表6 可以看出吉林產地所得綿馬貫眾炭Jb值高于其他產地，提示吉林產地所得綿馬貫眾炭的整體質量較佳。

表6 綿馬貫眾炭藥材質量評價結果Table 6 Quality evaluation result of Dryopteridis Crassirhizomatis Rhizoma Carbonisatum

3 討論

3.1 提取溶劑及方法的選擇

本實驗以白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷提取峰面積為主要指標，對比了不同溶劑（70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇和水）、超聲15、30、45、60 min 的提取結果，結果顯示綿馬貫眾炭供試品最佳提取方式為70%甲醇超聲提取30 min。

3.2 檢測波長的確定

綿馬貫眾炭中待檢測成分白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷紫外吸收主要集中在190～400 nm。綜合11 個成分峰形、峰面積等，本研究分別采用不同波長進行對比考察后發現，在298 nm 波長處[15-17]，白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA 和綿馬貫眾素ABBA 有最大吸收；在330 nm波長處[18-19]，山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷的色譜峰飽滿且色譜峰分離度較好、基線較平。最后優選以2.3 項色譜條件同時檢測綿馬貫眾炭中以上11 個成分的含量。

3.3 評價結果分析

本實驗以5 省16 批綿馬貫眾炭為檢測樣品，首先建立ESM 方法學驗證，再采用ESM 法同步檢測19 批綿馬貫眾炭所含的白綿馬素AA、二去甲基偽綿馬素AA、偽綿馬素、白綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA、山柰素、大豆素、去甲氧基莢果蕨素、異槲皮素和圣草次苷等成分含量，同時建立QAMS 體系，對比了與QAMS 法計算的含量結果，ESM 法與QAMS 法所測結果無明顯差異；多元統計分析對檢測數據進行分析，結果顯示各批次間質量差異較大，OPLS-DA 結果提示導致樣品不同分類差異的有4 個成分（VIP＞1），分別為去甲氧基莢果蕨素、綿馬貫眾素ABBA、偽綿馬素和山柰素；EW-TOPSIS 法同樣顯示各批次間綿馬貫眾炭質量差異較大（Jb在0.137 1～0.706 7），其中吉林產地所得綿馬貫眾炭Jb值較高，提示吉林產地所得綿馬貫眾炭整體質量較佳。

本實驗建立的QAMS 法、多元統計分析和熵權TOPSIS 分析綜合評價綿馬貫眾炭質量方法，簡便省時、準確性好，為后續綿馬貫眾的道地性研究提供數據支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突