高產HEMF酵母對醬油品質的提升

王瀚 葉鵬 李婉寧 侯麗華

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.007

引文格式：王瀚，葉鵬，李婉寧，等.高產HEMF酵母對醬油品質的提升[J].中國調味品，2024，49（3）：39-45，67.

WANG H， YE P， LI W N， et al. Improvement of soy sauce quality by yeast with high HEMF productivity[J].China Condiment，2024，49（3）：39-45，67.

摘要：醬油風味物質中的4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF）是醬香風味貢獻的主要成分。假絲酵母（Candida versatilis）（以下簡稱C酵母）是醬油發酵過程中產HEMF的重要微生物，文章使用能耐受高濃度HEMF的新菌株C-1、C-2、C-3。經過隨機擴增多態DNA實驗（RAPD）驗證了3株優良菌株與出發菌株基因有所差異，證明基因重組成功。將其應用于發酵并進行對比分析，研究發現，C-1與出發菌株相比，氨氮和全氮含量分別增加3.20%和7.20%，HEMF含量增加29.40%。通過感官評價，醬香味有所提升。生物胺總含量低于1 000 mg/L，氨基甲酸乙酯含量低于20 μg/L，保證了醬油的安全性。綜上，高產HEMF酵母提高了醬油的品質。

關鍵詞：醬油；酵母菌；基因組重排；4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃（HEMF）；醬香

中圖分類號：TS264.21????? 文獻標志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）03-0039-07

Improvement of Soy Sauce Quality by Yeast with High HEMF Productivity

WANG Han， YE Peng， LI Wan-ning， HOU Li-hua*

（School of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and

Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： 4-Hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）-furanone （HEMF） in soy sauce flavor substances is the main component contributing to the flavor of soy sauce. Candida versatilis （hereinafter referred to as C yeast） is an important microorganism producing HEMF during soy sauce fermentation. In this paper， the new strains C-1， C-2 and C-3 that can tolerate high concentration of HEMF are used. After random amplified polymorphic DNA （RAPD） experiments， it is confirmed that the genes of the three excellent strains are different from those of the starting strain， which proves that the gene recombination is successful. They are applied to fermentation and comparative analysis， and it is found that compared with the starting strain， the content of ammonia nitrogen and total nitrogen of C-1 increases by 3.20% and 7.20% respectively， and the content of HEMF of C-1 increases by 29.40%. Through sensory evaluation， it is found that the flavor of soy sauce is improved. The total biogenic amine content is less than 1 000 mg/L， and the ethyl carbamate content is less than 20 μg/L， which ensures the safety of soy sauce. In conclusion， the yeast with high HEMF productivity improves the quality of soy sauce.

Key words：soy sauce; yeast; genomic recombination; 4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H） furanone （HEMF）; soy sauce aroma

收稿日期：2023-09-06

基金項目：國家自然科學基金項目（31401678）；企業科技特派員項目（21YDTPJC00650）

作者簡介：王瀚（1996—），男，碩士，研究方向：食品營養。

*通信作者：侯麗華（1974—），女，教授，博士生導師，博士，研究方向：食品科學、食品營養與安全。

醬油已有2 000多年的歷史[1]?，F今我國醬油產業規模巨大，李松[2]通過市場調查發現，2014年我國醬油產量已經達到938.8萬噸，更加證明了醬油在我國調味品中的地位之高，但隨著人們日益增長的美好生活的需要，人們已經不滿足于醬油的生產額達到日常生活所需要的量，普通醬油不再吸引人，大家逐漸開始追求一些高質量的醬油，如具有吸引人的香味（果香味、焦糖味等）。市面上一部分醬油無法滿足這樣的條件，這也間接導致醬油產業有所停滯。而HEMF是醬香型醬油主要的香味物質，構建能高產HEMF的菌株是解決該問題的關鍵因素[3]。

微生物育種是一種新的人工選擇技術，旨在改變微生物的遺傳組成，以造福植物或動物宿主[4-7]，基因組重排技術結合了傳統誘變技術和細胞融合技術，是一項對整個微生物基因組重排的新型育種技術?；蚪M重排技術通過多親本原生質體遞歸融合，可以使工程菌快速獲得多樣復雜的優良表型，是一種常用的微生物育種方法[8-11]。

本研究將基因重組后能耐受高濃度HEMF的菌株應用于醬油發酵，提升醬油的品質，為工業微生物的構建提供了有效途徑。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

已構建的耐受高濃度HEMF的3株優良菌株C-1、C-2、C-3。天津市利民公司供應的優質大豆、炒小麥。HEMF、磷酸緩沖液（pH 7.0）、硫代硫酸鈉、山梨醇、甲醛、溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑、磷酸二氫鉀、乙醇、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸（均為分析純）、酵母基因組提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2? 培養基及溶液

YPD培養基[12]：由酵母提取物、無水葡萄糖、蛋白胨和瓊脂粉組成，其中酵母提取物的比例為1%，蛋白胨的比例為2%，固體另加1.5%瓊脂粉；生理鹽水：將0.90 g氯化鈉溶解于99.1 mL蒸餾水中；EDTA·2Na：將0.05 mol/L EDTA（18.60 g EDTA·2Na）加入到蒸餾水中，使其達到1 000 mL，然后使用NaOH調節pH到7.5；ST溶液：由1 mol/L山梨醇和0.01 mol/L Tris-HCl組成，pH調至7.4；STC溶液：將0.01 mol/L CaCl2加入到ST溶液中；PTC溶液：35% PEG-6000、0.01 mol/L CaCl2、0.01 mol/L Tris-HCl（pH調至7.4）；TE溶液（pH 8.0）：200 mL 50 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0），2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）?；旌虾?，定容至1 000 mL。

1.3? 儀器與設備

PB-10型實驗室pH計? 美國Sartorius公司；立式壓力蒸汽滅菌器? 日本雅馬拓科技有限公司；SQP型分析天平? 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SH220N型石墨消解儀? 濟南海能儀器有限公司；ZDDN-11型自動凱氏定氮儀? 浙江托普儀器有限公司；超高速冷凍離心機? 美國Thermo Fisher Scientific公司；T5型自動電位滴定儀? 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺? 蘇凈集團安泰公司；PCR儀? 美國Bio-Rad公司；QP-Ultra 2010氣相色譜-質譜聯用儀? 日本島津公司。

1.4? 方法

1.4.1? 優良菌株基本性能的測定

1.4.1.1? 遺傳穩定性的測定

在含1.75% HEMF的YPD固體培養基中，對獲得的優良菌株進行多次傳代，篩選出能穩定遺傳HEMF耐受性的菌株。

1.4.1.2? RAPD驗證

使用酵母基因組提取試劑盒提取基因，使用表1中的7個隨機引物，在表3的PCR條件下驗證篩選菌株和原始菌株之間的DNA差異。發現只有隨機引物5可以擴增原始菌株和第三輪基因組重排獲得的酵母菌株之間的不同RAPD條帶。因此，選擇使用隨機引物5進行RAPD擴增實驗。將原始菌株和新構建的菌株的全基因組DNA作為模板，并使用隨機引物5進行擴增。PCR反應系統見表2。

1.4.1.3? 優良菌株生長曲線的測定

從固體培養基中選擇單個菌落保存優良的酵母菌株，然后接種到20 mL YPD液體培養基中，在30 ℃、180 r/min的條件下，搖瓶過夜。為了比較出發酵母和優良菌株在不同濃度的HEMF液體培養基中的耐受性和生長差異，將兩種液體培養基分別添加5%的接種物，并在30 ℃、180 r/min的條件下培養一夜，每4 h測量一次OD660 nm。

1.4.2? 新菌株應用于醬油發酵

在進行發酵前1 d用開水浸泡大豆，待大豆浸泡吸水后，過濾掉水分，按照大豆∶炒小麥為6∶4的比例混入炒小麥，再于121 ℃滅菌30 min并蒸熟，于30 ℃恒溫發酵120 d。

鹽水的配制：配制鹽分濃度為18%的鹽水，鹽水體積為總物料質量的2.2倍。將172.8 g食用鹽放入660 g自來水中，使其混合并完全融合。待溫度達到室溫后，再將300 g物質和鹽水混合，繼續進行發酵。

將曲料與鹽水混合均勻后，用搟面杖將其攪拌均勻，然后用保鮮膜、牛皮紙和棉線將發酵罐密封，定期攪拌，以確保曲料與鹽水完全混合，并添加1.0×106 CFU/g的C酵母和3輪基因重排構建的酵母。每隔5 d攪拌醬醪，使微生物和醬醪充分接觸混勻，提高發酵效果（注：發酵全程盡可能保證無菌操作，防止環境中微生物混入而影響實驗結果[13]）。

在發酵完成后，將其置于8 500 r/min的離心機中，經過20 min的離心處理，再用6層紗布過濾，即可獲得頭油（即本實驗中的成品醬油）。

共設置了8個發酵組，見表4。

1.4.3? 氨基酸態氮含量的測定

氨基酸態氮含量根據GB 5009.235—2016[14]的方法進行測定。

1.4.4? 全氮含量的測定

全氮含量根據GB 5009.235—2016的方法進行測定。

1.4.5? 還原糖含量的測定

還原糖含量根據DNS法測定。

1.4.6? 風味物質的測定

使用SPME-GC-MS技術[15]，采用固相微萃取和氣質結合的方式對樣品進行檢測。通過軟件進行手動積峰并進行整合和對比質譜儀記載的質譜圖與檢索數據庫系統給出的標準質譜圖，檢測出相似度超過80%的化學物質，通過定性分析方法，并使用面積歸一化法測算出其相應濃度，以此來鑒定風味化學物質。

1.4.7? 生物胺含量的測定

根據GB 5009.208—2016[16]的規定，醬油中8種生物胺的數量可以通過流動相A（乙腈）和流動相B（超純水）的比較來確定。

1.4.8? 氨基甲酸乙酯的測定

醬油中氨基甲酸乙酯按照GB 5009.223—2014[17]的方法測定。

2? 結果與分析

2.1? 優良菌株基本性能的測定

2.1.1? 優良菌株的RAPD驗證

對本研究3輪基因組重排構建的3株酵母菌和出發菌株C酵母進行RAPD驗證，結果見圖1。

注：泳道1代表Marker，泳道2代表出發菌株，泳道3代表C-1，泳道4代表C-2，泳道5代表C-3。

隨機擴增多態性DNA（RAPD）可以有效地檢測微生物中基因突變所導致的DNA多樣性[18]，其原理是通過將不同長度的DNA片段隨機分配到10 bp的靶模板上，然后根據DNA片段的長度和數量來評估DNA的多態性，并且可以檢測出相似菌株基因組DNA序列之間的微小差異，從而更好地進行分析。由圖1可知，所構建的菌株與出發菌株有明顯的差異性擴增條帶，可以證明基因組重排的有效性。

2.1.2? 優良菌株遺傳穩定性的驗證

使用YPD固體平板和含有1.75% HEMF的YPD固體平板，對出發菌株、3輪基因重排構建的菌株C-1、C-2、C-3進行連續傳代培養，結果見圖2。

由圖2可知，將4種菌株同時劃線培養在普通YPD培養基和含有1.75% HEMF的YPD培養基中，出發菌株C酵母只能在YPD培養基中生長，不能在含有1.75% HEMF的YPD培養基中正常生長。而進行了3輪基因組重排的菌株均能在YPD平板和含有1.75% HEMF的YPD培養基中正常生長，說明構建的菌株可以比較穩定地遺傳對HEMF耐受的優良性狀。

2.1.3? 優良菌株的生長特性分析

取1.0×106 CFU細胞量接種到含有1.75% HEMF的液體YPD培養基中，放入30 ℃、轉速180 r/min的搖床培育，每隔4 h測量一次660 nm波長下各菌液的吸光度值，最終得到的生長曲線見圖3。

C-2、C-3酵母的生長曲線

genome recombination

由圖3可知，出發菌株C酵母在含有1.75% HEMF的YPD液體培養基中始終無法生長，而3輪基因組重排獲得的菌株C-1、C-2、C-3均可以經歷遲緩期、對數期、穩定期，3株酵母在16 h左右進入對數期，28 h增加速度變慢進入穩定期，分析生長曲線可知，在含有1.75% HEMF的YPD培養基中，3輪基因組重排后的3株酵母進入對數期的時間雖然晚了近4 h，但是與出發菌株相比，對HEMF的耐受性均有所提高，其底物也會更多地被轉化成HEMF。

2.2? 優良菌株應用于醬油發酵

2.2.1? 氨基酸態氮含量的測定

酵母發酵所得醬油中氨基酸態氮含量的測定結果見圖4。

由圖4可知，氨基酸態氮含量在前期迅速增長，而后期整體呈現緩慢增長的趨勢。這是因為醬油醪在發酵初期，其中的酶系統，特別是蛋白酶肽酶活性極強，大部分蛋白質大分子都被有效降解，從而使得氨基酸態氮含量迅速增長。在發酵釀造初期，鹽水濃度高達18%，這使得可溶性氮在滲透壓的影響下被曲霉溶解，從而導致醬油醪中氨基酸態氮含量迅速提高。然而，伴隨著發酵釀造進入后期，整個發酵系統的蛋白酶活性逐漸減弱，氨基酸態氮含量變化不大。

在120 d的發酵釀造工藝中，加入優良酵母菌C-1的醬油的2-1發酵組中氨基酸態氮含量最高，達到0.959 6 g/dL，相比出發菌株提高了3.20%。而且與工藝一相比，工藝二的氨基酸態氮含量更高，但是兩種發酵工藝的氨基酸態氮總體水平相差不大。經過發酵處理，各個發酵組中氨基酸態氮含量均超過0.80 g/dL，滿足國標GB 18186—2000中特級醬油的質量要求。

2.2.2? 全氮含量的測定

酵母發酵所得醬油中全氮含量的測定結果見圖5。

由圖5可知，在整個發酵釀造過程中，所有發酵釀造組的全氮含量變化大致相同：前期穩步增加，中期快速增加，后期增長緩慢甚至停滯。在發酵初期，蛋白酶活性較強，大豆中的蛋白質被溶解，導致全氮含量迅速增加。隨著發酵過程的進行，酵母等細胞的增殖會消耗大量氮源，而美拉德反應則會使發酵系統中的一些含氮物質被用于反應，從而導致后期出現下降的趨勢。

發酵所得的醬油中，工藝二的2-1發酵組中全氮含量最高，為1.695 g/dL，高于添加了出發菌株C酵母的發酵組（7.20%），并且工藝二醬油的全氮含量整體高于工藝一醬油。

2.2.3? 還原糖含量的測定

酵母發酵所得醬油中還原糖含量的測定結果見圖6。

由圖6可知，隨著發酵的進行，還原糖含量迅速下降。工藝二的情況是由于酵母的加入時間較晚，導致原料在發酵初期受到葡萄糖淀粉酶的作用，迅速分解，從而使還原糖含量迅速升高。后期還原糖含量迅速下降是由于在高濃度鹽水的作用下，酶活性逐漸降低，原料分解變慢。當酵母菌加入時，它們可以利用還原糖作為底物，產生一系列獨特的風味物質，從而迅速降低還原糖含量。而且隨著發酵的進行，整個環境的pH值也有所降低，酵母菌等微生物的活動受到抑制，最終還原糖含量降低緩慢。

兩種發酵工藝的醬油中，添加了優良酵母菌株的發酵組中還原糖含量均低于添加了出發菌株C酵母的發酵組。其中工藝二的2-1發酵組還原糖含量最低，為1.523 5 g/dL，工藝一醬油的還原糖含量整體低于工藝二醬油。

2.2.4? 銨鹽含量的測定

酵母發酵所得醬油中銨鹽含量的測定結果見圖7。

蛋白質發酵過程中產生的異味使得醬油產品中的銨鹽含量容易超出GB 18186—2000《釀造醬油》的要求，并且最高濃度不能達到氨基酸態氮的30%。由圖7可知，所有發酵產品均符合國家標準的要求，因此必須嚴格執行這一規定。

2.2.5? 風味物質的測定

在醬油發酵釀造工藝中，最主要的香味成分是醇類物質，而α-酮酸則是形成高級醇的關鍵中間體，它們可以與異丁醇、異戊醇、甲硫醇和2-苯基乙醇等物質相互作用，從而產生獨特的香味。

邢爽等[19]的研究結果表明在pH適中的前提下，假絲酵母可以產生更多的酯類物質，而這些物質不會進一步參加反應或者分解，可以使醬油中酯類物質穩定存在并提高醬香的風味[20]。

由表5可知，醇類、酸類、醛類、酯類、酮類含量較多，相對總含量達到90%左右。雜環類、呋喃類、酚類含量較少。在兩組發酵醬油中，3株優良酵母菌株發酵組的酸類和酯類含量高于出發菌株C酵母發酵組。兩種發酵工藝相比，添加優良菌株相比對照組增加了許多風味物質，其中發酵組2-1相比2-4增加了15種不同的風味物質。2-1發酵組的酯類含量也顯著增加，達到26種，這表明45 d的酵母添加對醬油發酵中酯類的產生具有重要影響。同時證明了添加構建菌株可以改善醬油的風味（工藝二發酵組中的4組醬油風味物質種類最多）。

2.2.6? HEMF的測定

酵母發酵所得醬油中HEMF含量的測定結果見圖8。

由圖8可知，添加構建酵母的發酵組在相同原料比例的條件下HEMF含量高于添加出發菌株C酵母的發酵組，證明構建酵母在相同原料下可以產生更多的HEMF。最高為工藝二添加酵母C-1菌株的2-1發酵組，HEMF含量從0.17%提高到0.23%，增幅達到29.40%，表明原料中更多的戊糖與磷酸鹽發生非酶促反應并形成HEMF。

2.2.7? 生物胺含量的測定

本研究對醬油中可能存在的有害物質生物胺進行了檢測，發酵組醬油樣品中8種生物胺的含量和總含量測定結果見圖9。

by different yeasts

我國尚未對醬油中生物胺的含量作出明確規定，但歐洲食品安全局（EFSA）則嚴格規定醬油中生物胺總含量不得高于1 000 mg/L，以確保消費者的安全。

在發酵組中，色胺的含量為4.29～10.66 mg/L，苯乙胺的含量為1.53～10.39 mg/L，腐胺的含量為1.74～28.12 mg/L，尸胺的含量為22.26～42.78 mg/L，酪胺的含量為65.06～188.14 mg/L，亞精胺的含量為7.77～9.54 mg/L，精胺的含量為3.74～13.30 mg/L。

由圖9可知，經過本次實驗，所有醬油的生物胺總量低于250 mg/L[21-22]，表明構建的優良酵母菌株不會對人體健康造成潛在的危害。

2.2.8? 氨基甲酸乙酯含量的測定

本研究還對醬油中可能存在的有害物質氨基甲酸乙酯進行了測定，醬油中氨基甲酸乙酯含量見表6。

由表6可知，所有發酵組均檢測出了微量的氨基甲酸乙酯，但是它們的含量均小于20 μg/L（由聯合國糧農組織推薦的最大可檢出量）。但是添加了構建優良菌株的發酵組略高于添加了C酵母的發酵組。原因可能是精氨酸、尿素等作為氨基甲酸乙酯合成的前體物質被轉化率更高[23-24]。

2.2.9? 感官評價

在相同的滅菌條件（121 ℃蒸汽滅菌，時間10 min）下處理所得的醬油，感官評價人員從醬油的焦糖味、果香味、煙熏味、酒香味、碳烤味5個方面對這兩種工藝的醬油進行風味感官評價，結果見圖10。

通過對添加不同酵母菌發酵醬油的風味進行感官評價，由圖10可知，添加優良酵母菌株C-1、C-2、C-3的發酵組果香味和焦糖味得分高于對照組，其中發酵組2-1的果香味得分最高，證實了隨著HEMF含量的增加，醬油的風味得到了有效的改善。從焦糖味來看，2-1發酵組的焦糖味最高，而構建菌株發酵組整體上高于對照組。從葡萄酒風味和煙熏指數來看，所有發酵組的得分普遍不高。

上述研究結果表明，添加優良酵母菌株能夠有效提高醬油的焦糖味與果香味，與HEMF含量呈正相關，有助于提高醬油的醬香風味。其中優良菌株C-1在各項指標上均優于其他菌株，為最優菌株。

3? 結論

將出發菌株C酵母和優良菌株應用于醬油發酵。研究表明，添加構建的菌株可使醬油發酵中酸酯種類豐富度高于C酵母醬油，發酵組2-1的HEMF含量比對照組提高29.40%。根據醬油發酵過程中氨基酸態氮含量、全氮含量、感官評分等指標的測定結果，所構建的優良菌株能夠提高醬油的整體品質。同時對醬油中的有害物質生物胺和氨基甲酸乙酯進行了測定，其含量均在允許范圍內，表明用優良菌株發酵醬油是安全的。此外，發現工藝二在第45天添加酵母更有利于風味物質的形成，有助于增加具有水果味和焦糖味的HEMF的含量，并能進一步增強醬油的整體風味?？偟膩碚f，C-1為最優醬油發酵菌株。

參考文獻：

[1]ZHU Y， TRAMPER J. Koji—where East meets West in fermentation[J].Biotechnology Advances，2013，31（8）：1448-1457.

[2]李松.市售發酵醬油品質分析及模式識別研究[D].長春：吉林農業大學，2015.

[3]WANG X J， GUO M Y， SONG H L， et al. Characterization of key aroma compounds in traditional Chinese soy sauce through the molecular sensory science technique[J].LWT-Food Science and Technology，2020，128：109413.

[4]FENG J， ZHAN X B， ZHENG Z Y， et al. New model for flavour quality evaluation of soy sauce[J].Czech Journal of Food Sciences，2013，31（3）：292-305.

[5]WAN S P， WANG C L， HOU L H， et al. Effect of adding salt-tolerant microorganisms on the flavor of soy-sauce mash[C]//2011 International Conference on Remote Sensing， Environment and Transportation Engineering，2011：7500-7502.

[6]MACHIDA M， ASAI K， SANO M， et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae[J].Nature，2005，438（7071）：1157-1161.

[7]KAEWKROD A， NIAMSIRI N， LIKITWATTANASADE T， et al. Activities of macerating enzymes are useful for selection of soy sauce koji[J].LWT-Food Science and Technology，2018，89：735-739.

[8]UEHARA K， WATANABE J， MOGI Y， et al. Identification and characterization of an enzyme involved in the biosynthesis of the 4-hydroxy-2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-3（2H）-furanone in yeast[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2017，123（3）：333-341.

[9]SUGAWARA E， OHATA M， KANAZAWA T， et al. Effects of the amino-carbonyl reaction of ribose and glycine on the formation of the 2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-4-hydroxy-3（2H）-furanone aroma component specific to miso by halo-tolerant yeast[J].Bioscience Biotechnology & Biochemistry，2007，71（7）：1761-1763.

[10]GUO J， LUO W， WU X M， et al. Improving RNA content of salt-tolerant Zygosaccharomyces rouxii by atmospheric and room temperature plasma （ARTP） mutagenesis and its application in soy sauce brewing[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2019，35（12）：180.

[11]QI W， ZHANG W T， LU F P. Carbon metabolism and transcriptional variation in response to salt stress in the genome shuffled Candida versatilis and a wild-type salt tolerant yeast strain[J].RSC Advances，2017，7（3）：1646-1653.

[12]ORDONEZ J L， TRONCOSO A M， GARCIA P， et al. Recent trends in the determination of biogenic amines in fermented beverages－a review[J].Analytica Chimica Acta，2016，939（7）：10-25.

[13]張珊.耐鹽酵母的添加對高鹽稀態醬油的影響[D].天津：天津科技大學，2018.

[14]國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定：GB 5009.235—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[15]鄭海燕.醬油中紅色指數的測定方法[J].中國調味品，1999（1）：27-30.

[16]國家食品藥品監督管理總局，國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中生物胺含量的測定：GB 5009.208—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[17]國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定：GB 5009.223—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[18]ATIENZAR F A， JHA A N. The random amplified polymorphic DNA （RAPD） assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies： a critical review[J].Mutation Research，2006，613（23）：76-102.

[19]邢爽，王亞平，郭學武，等.發酵條件對5種產酯酵母酒精發酵和產酯的影響[J].中國釀造，2018，37（2）：24-28.

[20]周鈺涵，崔丹瑤，閆昕，等.釀酒酵母與球擬酵母混合發酵對白酒風味物質的影響[J].食品研究與開發，2021，42（17）：169-175.

[21]LU Y M， CHEN X H， JIANG M， et al. Biogenic amines in Chinese soy sauce[J].Food Control，2009，20（6）：593-597.

[22]LI J， ZHOU L N， FENG W， et al. Comparison of biogenic amines in Chinese commercial soy sauces[J].Molecules，2019，24（8）：1522.

[23]SHEN M Y， ZHANG F， HONG T， et al. Comparative study of the effects of antioxidants on furan formation during thermal processing in model systems[J].LWT-Food Science and Technology，2017，75：286-292.

[24]WUNDERLICHOVA L， BUNKOVA L， KOUTNY M， et al. Formation， degradation， and detoxification of putrescine by foodborne bacteria： a review[J].Comprehensive Review in Food Science and Food Safety，2014，13：1012-1030.