舒心解郁顆粒制備工藝及關鍵成分含量測定研究

謝先嬌，彭進城，左池靖，張 靜，梁萬徽，汪 杰，訾苗苗，韓 雙，方 玲，彭 燦，4，5，6，7，8

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥230012；2.安徽中醫藥大學附屬太和中醫院，安徽 太和236600；3.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，安徽 合肥230022；4.省部共建安徽道地中藥材品質提升協同創新中心，安徽 合肥230012；5.安徽省鄉村振興協同技術服務中心，安徽 合肥230012；6.安徽省現代中藥產業共性技術研究中心，安徽 合肥230012；7.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012；8.安徽省中醫藥研究院中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥230012）

舒心解郁顆粒由柴胡、赤芍、白芍、當歸、川芎、郁金、酸棗仁、炙甘草、夜交藤、柏子仁、遠志、菊花、石菖蒲、合歡皮、川楝子、延胡索十六味中藥提取制備而成，原方為舒心解郁湯，來源于安徽省太和縣中醫院的臨床經驗方，且臨床療效明確［1］。2020 版《中國藥典》中規定含量測定成分：赤芍和白芍為芍藥苷，當歸為阿魏酸。研究報道，芍藥苷對產后抑郁大鼠、中風后抑郁大鼠、重度抑郁大鼠和血虛肝郁大鼠等均有改善作用［2-5］。當歸等傳統中藥材中均富含阿魏酸，Dong 等［6］梳理一系列機制，體內外實驗表明阿魏酸抗抑郁作用。菊花中綠原酸和3， 5-O-雙咖啡?；鼘幩嵊行С珊至扛撸?，8］，已有研究表明，采用綠原酸預處理促腎上腺皮質激素誘導重度抑郁癥模型的大鼠，可以顯著改善大鼠抑郁樣行為、血清生化水平和腸道微生物群落結構，從而發揮抗抑郁作用［9］。斯皮諾素是酸棗仁的重要成分，可通過GABA 和5-HT 系統起到治療焦慮作用［10］。綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮枯^高，穩定，均可以測定，且能達到本方疏肝理氣、寬胸止痛、安神的療效，是治療疾病伴隨抑郁的常見藥物成分。在實驗過程，洋川芎內酯Ⅰ和沒食子酸的含量穩定且較高，且洋川芎內酯Ⅰ是舒心解郁方中當歸和川芎重要成分，可以有效防治抑郁癥和偏頭痛，更好地發揮療效。因此，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷脱蟠ㄜ簝弱ア?，可能是該制劑發揮藥效的關鍵成分。

目前臨床多以湯劑使用，但因煎煮困難、服用量大、貯存困難、中藥味濃、患者順應性差等不足，難以滿足臨床應用需求［11］。為此，開發成更適用于臨床的藥物制劑迫在眉睫。顆粒劑是在湯劑的基礎上，進一步濃縮、干燥、添加輔料等系列過程制備而成［12］，具有易吸收、劑量準確、使用方便等特點。為最大限度保留方中各味藥材的有效成分，保證顆粒劑療效，我們遵循中藥湯劑的傳統煎煮方法，將原藥材按照配比，以用水煎煮的方式進行提?。?3］。并以中藥復方常用評價指標出膏率對煎煮次數、煎煮時間、藥輔比進行考察，同時正交實驗優選最佳煎煮工藝參數［14，15］。然后對濃縮干燥后的物質進行成型工藝研究，為舒心解郁顆粒的研發制備奠定基礎。

另一方面，中藥復方制劑化學成分較復雜，多成分、多靶點協同作用是其發揮作用的重要特征［16］。且舒心解郁顆粒臨床使用量較大，質量評價標準尚未完全確定，為更好地控制舒心解郁顆粒臨床應用的安全性，展現中藥復方制劑多靶點、多成分的應用特點，及發展院內制劑，確保其質量可控，本實驗對其制備工藝進行優選，并擬建立關鍵物質含量測定方法。以期為舒心解郁顆粒的進一步規?；a和市場化提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2489 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），DF-101S 型恒溫水浴鍋（上海越眾儀器設備有限公司），YL-060S 型超聲波清洗機（中國濟南巴克超聲波科技有限公司），AB135-S 型十萬分之一電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

1.2 材料

純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），無水乙醇（分析純）購自合肥寶添科貿有限公司，甲醇（色譜純）購自上海安耐吉科技有限公司、乙腈（質譜級）購買于Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；甲酸（分析純，山東禹王實業有限公司），對照品：沒食子酸（PU0918-0025）、綠原酸（PU0100-0025）、芍藥苷（批號PS000825）、斯皮諾素（批號PS15260100）、阿魏酸（批號PU07720050）、3，5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ朠U0680-0025）和洋川芎內酯Ⅰ（批號PS21690020）對照品（純度均≥98.0%），均購于成都普思生物科技有限公司，藥材：當歸、炙甘草、延胡索、郁金和酸棗仁購自安徽金正元中藥飲片有限公 司，柴 胡（批 號：22071401）、赤 芍（批 號：22020801）、白芍（批號：21112701）、菊花（批號：22071301）、川芎（批號：22071401）采購于安徽守正中藥飲片有限公司，夜交藤（批號：21112701）、柏子仁（批號：21112701）、遠志（批號：220901）、石菖蒲（批號：201201）、合歡皮（批號：221001）和川楝子（批號：220501）購于安徽省萬生中藥飲片有限公司，實驗室試制舒心解郁顆粒（批號：230316、230320、230321、230322、230323、230324）。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

1.3.1.1 藥材吸水率 將藥材按配比，放入雙層濾布中，置入2 000 mL 燒杯中，加入10 倍水，浸泡24 h，將藥材表面流動的水濾去，倒盡全部未被吸收的溶劑，然后算出吸水率，吸水率（%）=［加水量（mL）-濾液量（mL）］/藥材量（g）×100%［17-19］。

1.3.1.2 出膏率 取舒心解郁方水煎液25 mL，放入干燥的、已恒定重量的蒸發皿，水浴蒸干，105 ℃環境中，干燥3 h，用干燥器冷卻30 min，然后，迅速精密稱定重量M2［20］。計算出膏率公式為：出膏率=（M2-M1）×V/（M×25）×100%（M1：蒸發皿質量，M2：25 mL 藥液中固體物和蒸發皿的質量，V：提取液體積，M：藥材投料量質量）［21］。

1.3.2 正交實驗及驗證 參照文獻［14，15］提取工藝因素和考察指標，結合舒心解郁顆粒情況，進行正交試驗設計，并對優選后的結果進行驗證。見表1。

表1 中藥舒心解郁顆粒提取工藝正交實驗水平因素表Tab 1 Factor table of the orthogonal experiment levels for the extraction process of Chinese medicine Shu Xin Jie Yu Granules

1.3.3 制劑成型性研究 按1.3.2 優選方法，將濾液濃縮至適當相對密度［（1.15～1.20）（60 ℃）］浸膏，干燥，備用。依次考察輔料種類、潤濕劑濃度、輔料用量和干燥溫度的最佳水平。其中，考察輔料種類包括可溶性淀粉、糊精和微晶纖維素；潤濕劑為乙醇，考察濃度包括60%、70%、80%、90% 和100%的乙醇；最終選擇糊精作為輔料，考察藥輔比例為1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2.0 和1∶3.0；對于濕顆粒的干燥溫度，考察溫度為45 ℃、55 ℃、65 ℃和85 ℃。以成型率、休止角、吸濕率為考察指標，篩選最優工藝，3 項指標的權重系數分別為0.4、0.2、0.4。綜合評分=（成型率/最大成型率）×0.4+（最小吸濕率/吸濕率）×0.4+（最小休止角/休止角）×0.2［17，22］。

1.3.4 指標成分含量測定

1.3.4.1 色譜條件 East Laboratory Epic C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min， 90%～38%B；30～40 min， 38%～42%B； 40～42 min， 42%～61%B； 42～46 min， 61%～90%B； 46～51 min，90%～10%B； 51～56 min， 10%B），體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。

1.3.4.2 對照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷脱蟠ㄜ簝弱ア駥φ掌愤m量置10 mL 容量瓶，加甲醇至刻度，超聲至充分溶解，補重，制成質量濃度分別為258、244、495、240、260、366、246 μg/mL 的溶液，過0.22 μm 有機微孔濾膜，取續濾液，即得對照品溶液。

1.3.4.3 供試品溶液的制備 精密稱定舒心解郁顆粒樣品2 g，研細，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇至刻度，25 ℃超聲，提取20 min。然后放至室溫，補足失重，取上清液，然后用0.22 μm 的有機微孔濾膜進行過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2 結果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 中藥材浸泡時間考察

2.1.1.1 中藥材吸水率考察 按照處方比例取藥材約113 g，按照1.3.1 提取工藝中藥材吸水率實驗計算吸水率。見表2。

表2 藥材吸水率考察結果Tab 2 Examination results of the water absorption of herbs

由表1 可知，處方量藥材浸泡24 h 后藥材平均吸水量為261.01%（RSD=1.72%）。為方便操作，藥材吸水量以2.5 倍計。因此第一次加水量多加2.5 倍。

2.1.1.2 浸泡時間對浸膏得率影響 以浸膏得率為指標，以水為溶劑，在滿足2.5 倍吸水量條件下，分別考察不同浸泡時間對水提液浸膏得率的影響，優選對水提液浸膏得率影響最大的浸泡時間。見表3。

表3 浸泡時間對浸膏得率影響Tab 3 Effect of soaking time on the yield of extracts

結果顯示，2.0 h 后總固體得率不再顯著增加，說明已經浸泡基本完全?？紤]到若藥材浸泡時間過長，可能滋生細菌和引起變質，而不再進一步延長浸漬時間，因此，可以確定飲片提取前的浸泡時間為2.0 h。

2.1.2 正交實驗結果 選取提取時間、提取次數和加水量為自變量，作為提取工藝因素水平，以出膏率考察指標進行正交試驗設計，建立最優提取工藝，實驗結果和分析見表4、5。

表4 中藥舒心解郁顆粒提取工藝正交實驗結果Tab 4 Results of orthogonal experiments on the extraction process of the Chinese herbal medicine Shu Xin Jie Yu Granules

結合表4 及表5 的分析結果，以浸膏得率作為評價指標，考察提取效果的影響因素順序為B＞A＞C，最佳提取條件為A3B3C3，考慮到大生產降低成本和縮短生產周期，選擇A3B3C2即藥材飲片加12 倍量水，煎煮3 次，每次40 min。

表5 方差分析結果Tab 5 Analysis of Variance Results

2.1.3 驗證實驗 為檢驗提取工藝的可行性，合理性，根據優選的提取工藝，設計3 批實驗，對提取工藝進行驗證。按比例稱取3 份藥材，加12 倍水煎煮，提取3 次，每次40 min，分別測定干浸膏得率，計算綜合評分［23］。見表6。

表6 提取工藝驗證實驗結果Tab 6 Results of the extraction process validation experiments

最終測試得出干浸膏得率的均值數據是22.86%（n=3，RSD=1.11%）。由實驗結果可知，本方法準確有效，具備可行性。

2.2 顆粒劑成型工藝研究

2.2.1 輔料種類選擇 根據中藥顆粒劑制備的特點，舒心解郁浸膏減壓干燥耗時長，且所得干浸膏粉有較大黏性和吸濕性，流動性差，直接制粒困難，不易儲存，故實際生產中，在濕浸膏中加入一定輔料進行噴霧干燥，縮短干燥時長并改善其物理性質，通常選擇以可溶性淀粉、糊精、糖粉和微晶纖維素為輔料。以糊精為輔料時，顆粒容易制備，且優于其余輔料組，經濟實用，所以選用糊精為輔料進行后續試驗。

2.2.2 潤濕劑濃度的篩選 本文采用濕法制顆粒技術，潤濕劑選擇不同比例的乙醇，以軟材達到“輕握成團，輕壓即散”為原則，考察乙醇濃度對成型工藝的影響，以軟材性狀、成型率、制粒難易程度為指標，篩選合適濃度的乙醇作為潤濕劑［22］。見表7。

表7 潤濕劑濃度考察結果Tab 7 Results of examination of wetting agent concentrations

試驗結果表明60%～90%的乙醇所制顆粒劑性狀相差不大，但考慮到本方中藥材吸濕性，最終選擇80%乙醇為潤濕劑［24］。

2.2.3 輔料用量 考察不同藥輔比，以80%乙醇作潤濕劑，進行制粒，整粒，通過對成型率、休止角、溶解時間和吸濕率指標的研究，確定適宜的輔料配比［25］。成型率按照藥典雙篩分法進行測定，溶化性通過顆粒在熱水中的溶解情況進行評價，休止角按照固定圓錐的測定方法進行測定。取適量的糊精，藥輔比1∶1.2、1∶1.5、1∶1.8、1∶2.0、1∶3.0，按上述方法去制備顆粒，檢測制得的樣品的成型率等4 項指標和成型率、休止角、吸濕率的綜合評分。見表8。

表8 輔料用量考察結果Tab 8 Examination results of excipient dosage

實驗結果顯示，使用藥輔比1∶1.8，制成的顆粒樣品綜合評分最高，故處方中藥輔比為1∶1.8 最佳。

2.2.4 干燥溫度 按上述方法制粒，將制得的濕顆粒分成3 份，分別放入45 ℃、55 ℃、65 ℃和85 ℃的烘箱中干燥，觀察顆粒的干燥情況，結合考慮節省工時，成分不被高溫破壞，最終選擇濕顆粒干燥條件為干燥溫度65 ℃。

2.2.5 重復性實驗 上述實驗結果，得出制備顆粒劑最優的方法為：以糊精為輔料，藥輔比為1∶1.8，80%乙醇為潤濕劑，65 ℃進行干燥，根據實驗優選得到最佳提取工藝，進行3 次實驗制備顆粒，主觀評價所得產品：深棕色，顏色均一，無結塊現象，硬度適宜，顆粒大小較均勻［24］。同時對其考察指標進行測定。見表9。

表9 重復性實驗結果Tab 9 Repeatability experiment results

2.3 舒心解郁顆粒含量測定

2.3.1 專屬性試驗 按“1.3.4.1” 項下色譜條件，檢測并記錄空白試劑、供試品溶液和混合對照品溶液色譜圖。對照品和供試品溶液色譜圖譜，各峰分離度良好，在各對照品成分的相應位置，供試品中均有色譜峰與之對應，表明該方法專屬性較好，可以用來舒心解郁顆粒含量測定，色譜圖見圖1。

圖1 舒心解郁顆粒專屬性試驗HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Shu Xin Jie Yu Granules exclusive test

2.3.2 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液，逐次按濃度稀釋，分別放入10 mL 容量瓶，用甲醇加至刻度，混勻，過0.22 μm 有機微孔濾膜，取續濾液，按照1.3.4.1 項下色譜條件進樣分析，以質量濃度X為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，獲得各成分線性關系。見表10。

表10 7 個成分的線性關系考察結果Tab 10 Results of linear relationship examination of seven components

2.3.3 精密度試驗 在1.3.4.1 項下色譜條件，連續進樣6 次，1.3.4.2 項下混合對照品溶液，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、洋川芎內酯Ⅰ的峰面積RSD 分 別 為 0.77%、0.79%、0.076%、0.75%、0.71%、0.76%、0.74%，表明儀器精密度較好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一批舒心解郁顆粒（批號：230316），根據1.3.4.3 項方法配制供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h，按2.1 項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、洋川芎內酯Ⅰ的峰面積RSD 分別為1.40%、1.23%、1.52%、1.16%、1.10%、2.50%、0.85%，表明供試品在24 h之內穩定性較好。

2.3.5 重復性試驗 取舒心解郁顆粒（批號：230316），按1.3.4.3 項方法，平行配制供試品溶液6份，按1.3.4.1 項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、洋川芎內酯Ⅰ的峰面積RSD分 別 為1.63%、1.92%、1.21%、1.02%、1.27%、1.15%、1.16%，表明方法重復性較好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的舒心解郁顆粒6 份（批號：230316），分別加入相當于樣品含量100%對照品各6 份，按1.3.4.3 所述配制供試品溶液，進樣并測定，然后計算加樣回收率。沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、洋川芎內酯Ⅰ的平均加樣回收率分 別 為 97.64%、103.95%、102.25%、103.89%、102.03%、99.98%、100.77%；加樣回收率的RSD 分別為1.10%、1.99%、0.86%、1.79%、1.84%、0.12%和0.97%。

2.4 樣品含量測定

取6 批舒心解郁顆粒（批號：230316、230320、230321、230322、230323、230324），進行含量測定，該批樣品中，沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、洋川芎內酯Ⅰ的平 均 含 量 分 別0.193 1、0.130 1、0.618 6、0.077 2、0.378 9、0.107 0、0.059 0 mg/g。見表11。

表11 樣品含量測定結果（mg/g）Tab 11 Results of sample content determination（mg/g）

3 討論

3.1 成型工藝

顆粒劑常使用的輔料為糊精、可溶性淀粉、微晶纖維素、乳糖、糖粉等［26］?？紤]到部分患者可能存在乳糖酶缺乏，使用乳糖易造成患者腹瀉等不良反應，因此輔料不使用乳糖。而蔗糖容易吸濕，過多攝入引起肥胖和血糖升高等不良反應，輔料不考慮使用糖粉。糊精、可溶性淀粉和微晶纖維素均可制粒，而可溶性淀粉過篩時細粉過多，成型率低于糊精和微晶纖維素，且與微晶纖維素相比，糊精作為輔料的操作性更強，顆粒更均勻，因此選用糊精作為輔料。蒸餾水和乙醇是顆粒劑最常用的潤濕劑，而舒心解郁方以浸膏形式制粒，浸膏有較大黏性，因此試驗選用80%乙醇進行制粒，結果顯示軟材黏度適中，并且顆粒成型性好。

3.2 含量測定

對正交實驗各工藝提取物均進行指標成分含量測定，在加入12 倍水，提取3 次，每次40 min 的提取工藝條件下，指標成分含量最高，進一步驗證優選后的工藝是適用的。舒心解郁顆粒，成分復雜、干擾成分多，難以用HPLC 實現精確定量。后期我們擬運用靈敏度更高、選擇性更強、準確性更好的UHPLC-MS/MS 聯用，將離子按質荷比分離后進行檢測的方法，對舒心解郁顆粒進行含量測定［27］。在前期預實驗，我們考察了以乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%甲酸為流動相，結果發現在流動相中選擇加入百分之零點一的甲酸，可以獲得良好的分離效果，且無拖尾現象，達到最佳的峰形［27］。為確保測定過程舒心解郁顆粒中的沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷脱蟠ㄜ簝弱ア竦某煞趾?，各組分均有較好的響應值，采用DAD 檢測器對舒心解郁顆粒溶液進行全波長掃描，最終選擇254 nm 作為檢測波長。

本研究采用正交試驗優選提取工藝，并對制粒所用輔料和方法進行優化。建立沒食子酸、綠原酸、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷脱蟠ㄜ簝弱ア竦母咝б合嗌V含量測定方法。所建立的方法，簡單易操作，穩定可靠，為后期更好地挖掘舒心解郁顆粒的藥效物質基礎及質量評價提供依據。

作者貢獻度說明：

謝先嬌：參與實驗選題與設計，進行提取工藝、成型工藝和含量測定試驗、指標測定、數據分析和論文撰寫；彭燦、韓雙：提供基金支持，并對論文提出建設性意見；左池靖、張靜、梁萬徽、汪杰、方玲：指導、論文修改；彭進城、訾苗苗：參與實驗內容及協助收集數據。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。