血清1-磷酸鞘氨醇聯合透明質酸檢測對結直腸癌的診斷及預后價值

陳丹丹，胡嘉捷，劉鷖雯，何怡青，楊翠霞，張國良，高 鋒，杜 艷

（1.上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院中心實驗室，上海 200233；2.上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院檢驗科，上海 200233）

近年來，我國結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發病率和死亡率呈持續增長、年輕化趨勢［1］。多數CRC 患者在被確診時已經處于疾病的的中晚期，而現有的循環腫瘤標志物都存在各自的局限性，因此尋找早期篩查CRC 的新型無創性標志物尤為重要［1］。

1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是一種多效性鞘脂代謝物，能通過結合細胞表面1-磷酸鞘氨醇受體調節癌細胞的異常增殖及轉移、血管和淋巴管新生以及腫瘤的化學耐藥等，從而促進多種癌癥的發生發展［2，3］。有研究報道S1P 在CRC患者血清中的水平顯著高于腸道良性疾病患者和健康體檢者［4］。透明質酸（hyaluronan，HA）是由雙糖重復單位構成的細胞外基質的重要成分之一，其在多種腫瘤如轉移性乳腺癌、結直腸癌中異常升高，并 與 患 者 的 預 后 不 良 相 關［5，6］。既 往 研 究 發 現HA 能夠參與調控腫瘤細胞的遷移、侵襲以及腫瘤相關血管及淋巴管生成［6-8］。另有研究發現HA 可通過與淋巴管內皮細胞透明質酸受體-1 結合從而調控S1P 受體表達［9］?；赟1P 受體受HA 調控的機理，我們推測S1P 和HA 可能在腫瘤進展中存在交互作用，且S1P 與HA 皆以可溶性分子形式存在于血液中。因此，兩者聯合檢測可能在CRC 的早期篩查和手術療效監測中發揮協同以及互補的作用，目前未見相關研究報道。本研究旨在探討CRC 患者術前術后血清S1P 及HA 水平變化與CRC 的關系，以期為CRC 的輔助診斷和預后評估提供新的潛力標志物。

1? 資料與方法

1.1 研究對象

選取2022 年9～12 月期間本院47 例CRC 患者作為結直腸癌組，30 例腸道良性疾病患者作為良性疾病組，38 名健康體檢者作為健康對照組。結直腸癌組男性31 例、女性16 例，年齡29～87 歲；良性疾病組（結腸炎、克羅恩病、腺瘤）：男性20 例、女性10例，年齡23～83 歲；健康對照組：男性26 名、女性10名，年齡50～72 歲，血糖、血脂、血壓、肝功能和腎功能等指標均正常。3 組間年齡、性別比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經我院倫理委員會批準，且所有研究對象均知情同意。納入標準：（1）病理確診；（2）術前未經放療、化療等處理；（3）比較全面的臨床資料。排除標準：（1）有惡性腫瘤病史；（2）術前進行過放化療等治療；（3）臨床資料不完整；（4）依從性較差。

1.2 研究方法

搜集所有受試者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM 分期、淋巴轉移狀態、神經侵犯情況、脈管侵犯情況、血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、血清糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9， CA19-9）等。其中結直腸癌組有8 例腫瘤大小未知，4 例淋巴轉移情況不詳，5 例神經侵犯未知，5 例脈管侵犯情況不明，9 例Ras 基因型信息缺失。

清晨采集所有受試者空腹靜脈血3 mL，離心分離血清，并分裝凍存于-80 ℃冰箱。利用Epoch 酶標儀（美國BioTek 公司）和ELISA 試劑盒（上海酶聯生物）檢測S1P。采用全自動化學發光免疫分析儀MAGLUMI?X8（深圳新產業）及配套試劑檢測HA。所有操作均按照廠商說明書進行。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0 軟件和Graphpad 8.0 軟件對所有數據統計分析，非正態分布的計量資料以M（P25～P75）表示。兩組之間的比較用兩獨立樣本Wilcoxon 檢驗。術前術后指標比較用配對樣本Wilcoxon 檢驗。S1P 和HA 指標的相關分析采用Spearman相關性分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各指標診斷CRC的效能。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 健康對照組、良性疾病組和結直腸癌組之間血清S1P 和HA 水

血清S1P 的水平在健康對照組、良性疾病組及結直腸癌組中逐次升高（Z=-3.533，P＜0.001；Z=-2.371，P＜0.05）。結直腸癌組血清HA 水平顯著高于健康對照組（Z=-2.393，P＜0.05），而良性疾病組分別與結直腸癌組和健康對照組之間的HA水平差異無統計學意義（Z=-2.371，P＞0.05；Z=-1.123，P＞0.05）。見表1。

表1 各組之間血清S1P 和HA 水平的比較［M（P25～P75）］Tab 1 Comparison of serum S1P and HA levels among the three groups ［M（P25～P75）］

2.2 結直腸癌患者血清S1P 和HA 水平與臨床病理特征的關系

血清S1P 水平與結直腸癌組患者TNM 分期（早/晚期）和淋巴轉移有關，晚期CRC 患者血清S1P 水平低于早期CRC 患者（P＜0.05）；淋巴轉移陽性CRC 患者血清S1P 水平顯著低于淋巴轉移陰性CRC 患者（P＜0.05）。另外，本研究結果顯示，血清HA 水平與結直腸癌組患者TNM 分期和脈管侵犯有關，晚期CRC 患者血清HA 水平低于早期CRC患者（P＜0.05）；脈管侵犯陽性的CRC 患者血清HA 水平低于脈管侵犯陰性的CRC 患者（P＜0.05）。見表2。

表2 結直腸癌患者血清S1P 和HA 水平與臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between serum S1P and HA levels and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

2.3 血清S1P 和HA 的相關性分析

Spearman 相關分析顯示，術前結直腸癌患者血清S1P 與 HA 水平呈正相關，相關方程為：Y=4.449X+450.8（r=0.406，P＜0.05）。見圖1。

圖1 結直腸癌患者術前血清S1P 與HA 水平的相關性Fig 1 Correlation between preoperative serum S1P and HA levels in patients with colorectal cancer

2.4 血清S1P 和HA 輔助診斷結直腸癌的效能

S1P、HA、CEA 及CA19-9 4 項指標單獨及聯合診斷結直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.871、0.642、0.694、0.593 及0.916，敏感性分別為88.60%、40.90%、56.80%、45.50% 及81.80%，特異性分別為76.50%、91.20%、79.40%、100.00%及88.20%。見表3 和圖2。

圖2 各項指標單獨和聯合輔助診斷結直腸癌的ROC 曲線Fig 2 The ROC curve for the diagnosis of colorectal cancer by individual and combined tests

表3 各項指標單獨和聯合診斷結直腸癌的ROC 曲線參數Tab 3 The ROC curve parameters for the diagnosis of colorectal cancer by individual and combined tests

2.5 血清S1P 和HA 輔助診斷CEA 和/或CA19-9陰性的結直腸癌的效能

S1P、HA、CEA 及CA19-9 單 獨 及 聯 合 診 斷CEA 和/或CA19-9 陰性的結直腸癌的AUC 分別為0.860、0.656、0.636、0.516 及0.897，敏 感 性 分 別 為86.50%、37.80%、62.20%、35.10%及78.40%，特異性 分 別 為76.50%、97.10%、67.60%、100.00% 及88.20%。見表4 和圖3。

圖3 各項指標單獨和聯合檢測診斷CEA 和/或CA19-9 陰性的結直腸癌的ROC 曲線參數Fig 3 The ROC curve for the diagnosis of CEA and/or CA19-9 negative colorectal cancer by individual and combined tests

表4 各項指標單獨和聯合診斷CEA 和/或CA19-9 陰性的結直腸癌的ROC 曲線參數Tab 4 The ROC curve parameters for the diagnosis of CEA and/or CA19-9 negative colorectal cancer by individual and combined tests

2.6 結直腸癌患者各項指標術前、術后變化

結直腸癌患者術后血清HA、CEA 和CA19-9 水平均顯著降低（Z=-3.381，P=0.001；Z=-5.103，P＜0.001；Z=-2.942，P=0.003）；血清S1P 水平術前、術后差異無統計學意義（Z=-1.014，P=0.310）。見圖4。

圖4 結直腸癌患者各項指標術前、術后變化Fig 4 Preoperative and postoperative changes of various indexes in patients with colorectal cancer

3 討論

結直腸癌是世界第四大致命癌癥，預計到2035年，全球CRC 新病患將持續增加至250 萬［10］。目前CRC 篩查方案主要是危險度評估及糞便隱血試驗，若結果為陽性，再行結腸鏡檢查［1］。然而糞便隱血試驗和糞便DNA 標志物檢測等非侵入性檢查分別存在低敏感度、高成本或低效益等不足［11］。常用的血液腫瘤標志物如 CEA、CA19-9 也缺乏高度敏感性和臟器特異性［12］。雖然腸道鏡檢是“金標準”，但其屬于有創檢查方法，且費用高、患者依從性差，還存在出血、穿孔的風險［11］。綜上所述，現有的結直腸癌早期篩查手段存在一定的局限性，迫切需要一種能高效篩查和預后判斷的新型生物標志物或聯合檢測方法。

既往研究認為大多數結直腸癌是由分子和遺傳改變引起［13］，近年來，研究發現結直腸癌代謝異常與結直腸癌發病率和死亡率呈年輕化趨勢密切相關［14］。S1P 是種多效性脂質介質，由鞘脂代謝產物鞘氨醇在鞘氨醇激酶的磷酸化作用下形成［2］。生理條件下，健康人血漿中S1P 濃度在300～500 nmol/L，其主要來源于紅細胞，并在免疫系統等方面起重要作用［15］。當腫瘤發生時，腫瘤細胞及其相關基質細胞以自分泌或旁分泌的方式釋放S1P 至腫瘤微環境，介導癌細胞增殖、侵襲轉移、血管及淋巴管生成等過程［2］。本研究顯示CRC 患者血清S1P水平在健康對照組、良性疾病組、結直腸癌組呈現遞增趨勢（P＜0.001，P＜0.05），提示血清S1P 具有鑒別診斷CRC 的潛力。HA 也參與人體的新陳代謝，是細胞外基質的重要成分，其在結直腸癌腫瘤間質中呈高表達［16，17］。本研究結果顯示，結直腸癌患者血清HA 水平顯著高于健康體檢者（P＜0.05），亦初步提示HA 具有輔助診斷結直腸癌的潛能。

另外，結直腸癌組早期患者血清S1P 和HA 水平均高于晚期患者，且Spearman 相關分析結果顯示S1P 水平與HA 水平呈正相關，這提示兩者聯合檢測在結直腸癌早期輔助診斷中可能發揮協同互補的優勢。此外，血清S1P 水平在3 組之間具有顯著性差異，而血清HA 在良性疾病組和結直腸癌組之間的差異不及S1P 變化顯著（P＞0.05），這有可能與良性疾病組患者體內存在促HA 合成的炎癥因子相關，故HA 需與其他標志物結合以提高診斷的特異性。本研究還發現，淋巴結轉移陽性CRC 患者的血清S1P 水平顯著降低（P＜0.05），該結果與前人在前列腺癌和結直腸癌中的結論一致［4，18］，Nunes 等［18］在研究前列腺癌時檢測了受試者的紅細胞狀態，發現相對于健康對照組，前列腺癌患者紅細胞S1P 合成酶的活性較低，且循環S1P 水平的降低與紅細胞中S1P 合成酶1 活性下降趨勢一致，這提示血清S1P水平下降與癌癥的早期進展相關，并非與臨床臨床轉移狀態聯系。然而仍然有必要對其分子機理進行進一步的探討，并分析其臨床應用價值。另外，類似的情況也出現在HA 的分析結果中，無脈管侵犯的CRC 患者HA 水平高于發生脈管侵犯的患者（P＜0.05），這可能是由于腫瘤微環境下細胞外基質發生重構，導致HA 發生降解。研究顯示HA 的降解產物如低分子量HA 在結直腸癌組織中異常升高，與患者的預后不良相關［19］。然而由于低分子量HA 的檢測需經離心、過濾、抽提等復雜過程，有待于未來方法成熟及簡化后，再做比較研究。

通過ROC 曲線分析，發現血清中S1P、HA 聯合傳統指標CEA、CA19-9 檢測診斷CRC 的效能值明顯高于單一指標，值得關注的是，在針對CEA 和/或CA19-9 陰性的CRC 的ROC 曲線分析結果中，發現四項聯合診斷能明顯提高CRC 診斷敏感性，提示聯合S1P、HA 聯合傳統標志物或可提高結直腸癌患者的檢出率。

術后動態監測對于防止腫瘤復發起關鍵作用，因此我們對CRC 患者的術后血清S1P、HA 指標也進行了分析。既往研究表明CEA 與CA19-9 的半衰期分別為1～5 d、1～3 d［19］，故本次研究選擇CRC 患者術后3～5 d 的血清樣本進行檢測。研究發現CRC者術后3～5 d 血清HA 水平顯著降低（P＜0.001），與張等［8］研究結果一致，提示對CRC 患者術后的療效監測具有重要意義。此外，CRC 患者血清S1P 水平在腫瘤切除手術前后差異沒有顯著統計學意義（P＞0.05），這可能是S1P 較長的半衰期所致。因此，相對于HA，CRC 患者術后血清S1P 水平降低可能相對延遲，這進一步提示S1P、HA 結合檢測在CRC 患者術后療效監測中具有互補性。由于本研究系單中心研究，且側重納入術前術后血清樣本配對的CRC病例，致使樣本量較小，后續將擴大規模，聯合其他醫學中心收集更多樣本，并進行追蹤研究。

綜上，血清S1P 與HA 在CRC 輔助診斷及預后監測中展現出相關性和互補性，結合傳統腫瘤標志物CEA、CA19-9，能夠在結直腸癌診斷和療效監測中發揮一定的臨床價值。

作者貢獻度說明：

陳丹丹參與文章構思與設計、數據收集與整理以及原稿寫作；胡嘉捷參與樣本收集、數據收集與管理、原稿審查與編輯；劉翳雯、何怡青進行樣本檢測、數據收集與管理；楊翠霞、張國良、高鋒參與文章審查與編輯；杜艷負責文章構思與設計，文章質量控制與審查。

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