ATP1B3 在神經膠質瘤中表達及其對細胞增殖和遷移的影響

嚴其康，扈清云，孫 權，王彩霞，朱金玲

（1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學第一附屬醫院， 黑龍江 佳木斯 154007）

神經膠質瘤是起源于神經膠質細胞的中樞神經系統腫瘤，是顱內腫瘤中最常見和最致命的類型，生長迅速，具有極強的侵襲性，病人預后差。神經膠質瘤的基礎研究和對其治療手段的探索一直是國內外學者研究的熱點和難點問題。Na/K-ATP酶 由 催 化 亞 基α（100～112 kDa），調 節β（45～55 kDa）亞基和γ（FXYD2）（6.5～10 kDa）亞基組成［1］。已經鑒定出β 亞基的3 種不同的同種型：β1（ATP1B1基因），β2（ATP1B2基因）和β3（ATP1B3基因）［2］。3 種β 亞基在細胞中的分布具有組織特異性。已有文獻說明，Na/K-ATP 酶β 亞基參與調節細胞粘附功能，特別是在癌癥進展期間［3-6］。實驗室前期發現CASPR1-ATP1B3 蛋白相互作用影響腦微血管內皮細胞Na/K-ATP 酶的質膜定位，但在膠質瘤細胞中研究極少［7］。 并且有研究表明，ATP1B3基因在胃癌、肝癌中存在高表達，影響其發生發展，而在膠質瘤中未見研究，因此本研究選Na/K-ATP 酶的核心蛋白ATP1B3 作為靶分子研究其在不同組織級別的膠質瘤細胞中的表達水平，探討ATP1B3基因表達對膠質瘤患者總體生存率的影響及對膠質瘤細胞的增殖、遷移的影響。為尋找神經腫瘤細胞標志物和治療的分子靶點提供試驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料來源

人膠質母細胞瘤（U87MG）及MEM 培養基購自上海酶研生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、逆轉錄試劑盒、DAB 顯色液均購自上海碧云天生物技術有限公司，熒光定量PCR 試劑盒購自中國Takara 公司，單克隆ATP1B3 抗體（67554-1-lg）及GAPDH 抗體（60004-1-lg）購自中國proteintech 公司，干擾RNA 購自中國吉瑪基因公司。2 級、3 級、4 級膠質瘤組織切片來自于佳木斯大學第一附屬醫院。1 級通常為低級-例如毛細胞星形細胞瘤；2 級為低度惡性腫瘤，如星形膠質瘤或少突膠質細胞瘤浸潤；3 級包括間變性星形細胞瘤，間變性室管膜瘤，間變性少突膠質細胞瘤和間變性少星形膠質瘤；4 級通常為膠質母細胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM） 具有內皮細胞增殖或腫瘤壞死。

1.2 方法

1.2.1 在線數據庫分析ATP1B3在膠質瘤中的表達，及其與患者生存預后的關系 下載TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov）數據庫中膠質瘤患者的轉錄組基因表達數據集、臨床數據集并進行整理。然后使用CGGA（http：//www.cgga.org.cn/）數據庫在線分析ATP1B3在不同級別膠質瘤組織中的表達，進入官網，首頁選擇“Analyze”；點擊mRNA data；在 Distribution 處“gene”框 輸 入“ATP1B3”；點擊submit。對TCGA 數據庫下載的數據進行處理，通過ATP1B3表達水平中位值將膠質瘤患者分為兩組，分別為高表達ATP1B3組和低表達ATP1B3組。采用R 包"survival" "survminer"分析ATP1B3基因表達水平與膠質瘤患者生存率的關系，包括患者總生存期（overall Survival， OS），無進展生存期（progression-free survival， PFS）， ROC（receiver operating characteristic curve， ROC）生存分析。比較分析ATP1B3表達水平與癌癥患者臨床特征的相關性，包括分級、年齡和性別等。

1.2.2 免疫組化染色驗證ATP1B3在膠質瘤組織切片中的表達 對2 級、3 級、4 級膠質瘤組織進行IHC 染色。常規石蠟切片后60 ℃烤片15 min，進行二甲苯脫蠟與梯度酒精脫水，PBS 緩沖液沖洗，pH值8.0～8.5 的EDTA 抗原修復液100 ℃抗原修復，PBS 緩沖液沖洗，37 ℃過氧化氫甲醇消化內源性過氧化物酶10 min，PBS 緩沖液沖洗，加入5%BSA 封閉液封閉。滴加ATP1B3 抗體（1∶300）4 ℃冰箱內孵育過夜，PBS 緩沖液沖洗，羊抗鼠IgG 聚合物滴定及DAB 顯色，蘇木素染液襯染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.3 體外細胞培養 將在MEM 完全培養基（10%胎牛血清和1%雙抗）中的U87MG 細胞，放入6 孔板中培養，6 孔板置于5%CO2的恒溫37 ℃的培養箱中培養細胞。

1.2.4 細胞轉染 干擾RNA 序列由吉瑪基因公司設計，ATP1B3-Homo-336 序列為，S： CAUUCACGAUGUGGGUUAUTT AS： AUAACCCACAUCGUGAAUGTT；ATP1B3-Homo-530 序列為S：GAAGAACAGAAGAACCUCATT AS：UGAGGUUCUUCUGUUCUUCTT ；ATP1B3- Homo -976 序 列 為 S：GGGACGAGUUAUGUUCAAA TT AS：UUUGAACAUAACUCGUCCCTT；陰性對 照siRNA 序 列 為S：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT AS：ACGUGACACGUUCGGAGAATT；將培養細胞分為5 組，即空白對照組、陰性對照組（SI-NC）、si-ATP1B3-336 組、si-ATP1B3-530組、si-ATP1B3-976 組，當6 孔板中細胞密度達到30%～50%時，配制轉染體系，加入125 μL OPTIMEM、100pmol si-RNA（陰性對照組加入陰性對照siRNA、si-ATP1B3-336 組 加 入ATP1B3-Homo-336、si-ATP1B3-530 組加入ATP1B3-Homo-530、si-ATP1B3-976 組加入ATP1B3-Homo-976）、4 μL Lipo-8000，混勻，室溫下靜置20 min?；旌虾蟮捏w系以點滴的方式將轉染復合物加入含有U87MG 細胞的6 孔板中，輕輕搖勻后放入細胞培養箱中培養24 h后以備用于RT-PCR 檢測，轉染細胞培養48 h 后以備Western blot 檢測。篩選敲減效率高的siRNA 以被后續實驗。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測轉染后細胞ATP1B3基因的mRNA 表達水平 用RNA 抽提試劑盒提取轉染后U87MG細胞中總mRNA，分光光度計測定RNA的濃度和純度，反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR 試 劑 盒 進 行RT-PCR 擴 增，ATP1B3-S：ACGATGTGGGTTATGCTTCAGACTC；ATP1B3-AS：CCTGCATACGAAGTTGGATCAGACC；內參GAPDH 序列為S：UGACCUCAACUACAUGGUUTT；AS：AACCAUGUAGUUGAGGUCATT。7300 檢測結果，采用2-ΔΔCt法計算各組細胞ATP1B3基因mRNA 的相對表達量（內參為GAPDH）。

1.2.6 Western blotting 檢測轉染后ATP1B3 蛋白及相關通路蛋白MTOR、P-MTOR 表達量 收集轉染后U87MG 細胞，蛋白裂解液提取總蛋白，通過BCA 法測定提取蛋白質的濃度。取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE（12%）電泳分離，濕轉法將蛋白轉移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，將膜置于相應的ATP1B3鼠單克隆抗體（1∶1 500）、GAPDH 鼠 單 克 隆 抗 體（1∶10 000）中4 ℃過 夜，MTOR、P-MTOR（1∶1 500），TBS-T 洗去未結合的一抗，洗滌3 次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 37 ℃孵育1 h。TBS-T洗去未結合的二抗，洗滌3 次，每次10 min。利用全自動化學發光/熒光圖像分析系統觀察結果，ImageJ 進行分析。

1.2.7 CCK-8 法檢測細胞增殖 收集對照組及si-ATP1B3-336 組細胞接種于96 孔板（3×103個/孔），每組5 個復孔，每孔加入10 μL CCK-8 溶液（按試劑說明書操作），于培養箱內培養1 h，使用酶標儀檢測450 nm 波長處的光密度值（OD 值）。在0、24、48 和72 h 連續記錄各個孔的數值。細胞增殖越多越快，則顏色越深，OD 值越大。

1.2.8 Transwell 檢測細胞遷移能力 收集對照組、si-ATP1B3-336 組細胞加入0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的MEM 培養液制備單細胞懸液（5×104個/mL），取200 μL 細胞懸液接種于transwell 上室，下室加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養液，將小室放入培養箱內培養24 h 后，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察記錄細胞遷移結果。

1.3 統計學處理

TCGA 數據庫下載的數據檢驗結果均通過R4.2.2 程序計算所得，CGGA 數據庫在線分析結果有網站內部程序自動生成。實驗檢測結果采用GraphPad Prism9 軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 在線數據獲取和分析結果

從TCGA 數據中獲得神經膠質瘤樣本共704個，并對ATP1B3高、低表達兩組進行獨立性檢驗。CGGA 數據庫分析膠質瘤患者癌組織中ATP1B3mRNA 的表達水平，隨著膠質瘤級別（2，3，4 級）的升高，ATP1B3的表達水平顯著升高，（P＜0.001）（圖1A）。通過R 軟件進行分層分析，結果顯示：ATP1B3在膠質瘤患者中的表達水平與年齡和病理分級有關，差異有顯著性（P＜0.001）（圖2A、C），ATP1B3表達水平與性別無關（P＞0.05）（圖2B）。使用R 語言包計算ATP1B3表達水平對膠質瘤患者總體生存率的影響，繪制生存曲線圖，ATP1B3低表達組生存率明顯高于ATP1B3高表達組（P＜0.001）（圖3）。

圖1 ATP1B3 在不同級別膠質瘤中的表達Fig 1 ATP1B3 expression in different grades of gliomas

圖2 ATP1B3 表達水平與臨床特征相關分析Fig 2 Correlation analysis between ATP1B3 expression level and clinical characteristics

圖3 ATP1B3 表達水平與患者生存率Fig 3 ATP1B3 expression level and patient survival rate

2.2 免疫組化檢測ATP1B3 在膠質瘤組織切片中的表達結果

免疫組化結果顯示，2、3、4 級別膠質瘤組織切片分別呈現淡黃色、黃褐色、棕色，印證了數據庫分析結果（圖1B）。染色強度評分具體為-（無染色），+（弱染色為淡黃色），++（中等染色為黃褐色），+++（強染色為棕色）。

2.3 SI-ATP1B3-336 干擾效果明顯

敲減ATP1B3基因表達，RT-qPCR 檢測結果顯示，相較于對照組，SI-ATP1B3-336 組mRNA 水平顯著降低（F=17.45，P＜0.01）（圖4A），western blot實驗結果進一步證明si-ATP1B3-336 組中ATP1B3的敲減效果（F=30.84，P＜0.000 1）（圖4B），因此將該干擾序列用于后續研究。

圖4 干擾RNA（ si-RNA）篩選Fig 4 Interfering RNA （Si-RNA） screening

2.4 敲減ATP1B3 對膠質瘤細胞增殖、遷移的影響

Transwell 遷移實驗結果表明，si-ATP1B3-336組遷移細胞數明顯減少（t=6.254，P＜0.01）細胞遷移能力減弱（圖5A）。CCK8 實驗結果表明，si-ATP1B3-336 組細胞的增殖能力顯著低于對照組（t=9.812，P＜0.001）（圖5B）。

圖5 敲減ATP1B3 后 U87MG 細胞增殖、遷移能力Fig 5 Proliferation and migration ability of U87MG cells after knockdown of ATP1B3

2.5 敲減ATP1B3 對MTOR 信號通路蛋白的影響

與對照組相比敲減ATP1B3后，P-MTOR 蛋白表達量顯著下降（t=3.909，P＜0.05），P-MTOR/MTOR 比值顯著降低（t=3.132，P＜0.05）（圖6），表明ATP1B3可能通過影響細胞生長信號通路從而影響膠質瘤細胞的增殖和遷移。

圖6 MTOR、P-MTOR 蛋白表達水平Fig 6 MTOR，P-MTOR protein expression levels

3 討 論

2021 年出版了第五版中樞神經系統腫瘤分類（WHO-CNS5）。WHO-CNS5 將基因、分子及信號通路改變等特征納入分類系統，并結合病理組織學特征、免疫組化等方法進行整合和分層診斷［8，9］。根據腦膠質細胞瘤的組織結構和細胞特征，在顯微鏡下觀察術中或術后膠質瘤的病理分級。不同級別的膠質瘤治療方式有所不同，預后和生存情況也大不同。對于低級別膠質瘤采用的是手術為主的治療。對于高級別膠質瘤，無論術后是否達到了全切都必須進行放療、化療等后續的輔助治療。多形性惡性膠質瘤惡性程度高，GBM 最明顯的特征之一就是細胞增殖失控［10］，研究發現GBM 呈現表觀遺傳學和遺傳不同亞群的多態性特點，會導致其發生和發展具有不同的機制，并導致治療的失?。?1］。目前越來越多的證據表明，在不同或同一細胞類型中，相同的配體可能有不同的受體，進而誘導不同的反應［12］。動物細胞中質膜的嵌入蛋白，又稱Na-K泵，通過水解ATP 轉運細胞內外的鈉鉀離子，維持細胞的電化學梯度［13］，并維持離子濃度的平衡。研究表明Na/K-ATP 酶是一種信號轉導和轉錄激活因子［14-17］，影響細胞增殖［18］，參與細胞運動［19］和細胞凋亡［20］。最近的綜述描述了Na/K-ATP 酶參與細胞增殖和肥大，細胞凋亡，細胞粘附，細胞遷移，信號轉導通路和鈉泵結合藥物的相關分子基礎［21］。

最近有研究指出膠質瘤在侵入腦實質時，利用離子通道和轉運蛋白體維持它們的單一生長和侵襲［22，23］，其中包括Na/K-ATP 酶，但其具體機制不詳。Li 等［24］研究表明，ATP1B3在胃癌細胞系中的mRNA 和蛋白質水平均升高，并通過PI3K/AKT 信號通路調節胃癌細胞的進展，敲減ATP1B3顯著抑制了人胃癌細胞的細胞增殖、集落形成能力、遷移和侵襲能力以及增加細胞凋亡。Lu 等［25］研究發現，ATP1B3在肝癌組織中高表達，敲減ATP1B3抑制肝癌細胞增殖和遷移，促進肝癌細胞凋亡和上皮向間充質轉化。

本研究結果顯示敲減U87MG 細胞中的ATP1B3后，膠質瘤細胞的增殖、遷移能力顯著下降。ATP1B3表達水平隨著膠質瘤惡性程度的升高而升高，ATP1B3高表達不利于患者的生存、預后，下調ATP1B3減少了P-MTOR 的表達，推測其可能是通過影響MTOR 信號通路從而影響U87MG 細胞增殖、遷移。綜上所述，ATP1B3可能作為神經膠質瘤治療的潛在靶點，但關于其具體作用機制仍需進一步探究。

作者貢獻度說明：

嚴其康：課題的構思與實驗，撰寫文章；扈清云、孫權、王彩霞： 實驗數據整理，分析；朱金玲：論文指導與修改，經費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。