高效液相色譜法測定肝復顆粒中6 種成分含量

吳國軍，徐惠玲，龔艷珍（通信作者）

江西省人民醫院 （江西南昌 330006）

肝復顆粒是一種中成藥，主要由虎杖、冷水花、吉祥草、苦參、黃柏、丹參、梔子等7 味藥材組成, 具有疏肝利膽、活血化瘀、清熱解毒等功效，主要用于治療氣滯血瘀、肝膽濕熱所致的急慢性肝炎。方中虎杖的主要成分為虎杖苷和大黃素，具有護肝的作用[1-2]；梔子的有效成分為梔子苷和西紅花苷類，具有保肝、抗癌等作用[3-4]；丹參中丹參酮類成分主要具有保護肝臟、抗菌消炎的作用[5-6]。

《中國藥典》[7]的原有標準收載中記載了梔子苷的定量限定，但是關于其他成分測定的相關研究較少。研究證實，復方中藥成分復雜，其療效由方中藥材獨立或相互作用決定，各藥材所占比例將影響整個藥方的療效[7-10]。因此，評價復方中藥的療效需多成分測定。本研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定肝復顆粒中6 種成分（虎杖苷、西紅花苷Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、梔子苷）的含量，以期全面、客觀地評價肝復顆粒的藥效成分，現報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（山東魯創分析儀器股份有限公司，型號：LC-500）；高精度電子天平（上海贊維衡器有限公司，型號：ZA505AS）；恒溫水浴鍋（常州國宇儀器有限公司，型號：HH-s6）；數控超聲波清洗器（北京東南儀誠實驗室設備有限公司，型號：KQ5200DV）。

1.2 藥品與試劑

對照品梔子苷（批號：110749-201919）、虎杖苷（批號：111575-201603）、隱丹參酮（批號：110852-201807）、丹參酮Ⅰ（批號：110867-201607）、丹參酮ⅡA（批號：110766-202022）均購自中國食品藥品檢定研究院，西紅花苷Ⅰ（上海澤葉生物科技有限公司，批號：ZY67302SD），色譜純乙腈（上海優試化工有限公司，批號：20200322），色譜純甲醇（廣州浩盈化工科技有限公司，批號：20200310）。肝復顆粒共12 批，生產廠家為貴州君之堂制藥有限公司（批次分別為：200201、200202、200203、200204、020401、200402、200403、200404、200701、200702、200703、200704）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：COSMOSIL C18（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）。流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）。以0.8 ml/min 流速梯度洗脫（0～10 min，A：2%→16%；10～15 min，A：16% →16%；15～20 min，A：16%→50%；20～23 min，A：50%→70%；23～26 min，A：70% →2%；26～30 min，A：2%），檢測波長為205 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為10 μl。

2.2 配制對照溶液

同一25 ml 容量瓶中放入適量的虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷為對照品，加甲醇溶解制成每毫升含虎杖苷0.28 mg、隱丹參酮0.36 mg、丹參酮Ⅰ0.44 mg、丹參酮ⅡA 0.14 mg、西紅花苷Ⅰ 0.22 mg、梔子苷0.12 mg 的混合溶液，備用。

2.3 配制供試品溶液

取肝復顆粒研磨成均勻細粉，稱量0.5 g，放入具塞錐形瓶中，添加色譜純甲醇溶解，稱定質量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）提取30 min 取出、放冷，加色譜純甲醇補足質量，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜過濾后得所需濾液。

2.4 配制陰性供試品溶液

按照顆粒制備工藝，分別制備小樣虎杖、丹參及梔子陰性顆粒，并按“2.3”方法分別制備陰性溶液。

圖1 各樣品高效液相色譜圖

2.5 方法學

2.5.1 線性試驗

采用甲醇按比例稀釋“2.2”中混合對照品儲備液，分別稀釋2、10、50、100 倍。按色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算對照品的回歸方程及相關系數，見表1。

表1 6 種成分的線性關系

2.5.2 精密度試驗

根據“2.1”方法色譜條件將混合對照品連續進樣 6 次，記錄峰面積、保留時間，虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷的相對標準偏差（relative standard devition，RSD）分別為0.22%、0.42%、0.83%、0.17%、0.31%及0.24%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性

稱量6 份顆粒粉末，按供試品制備方法制得樣品 6 份，根據“2.1”方法色譜條件測定，記錄保留時間、峰面積，計算虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷的平均含量分別為1.7427 、1.3941 、1.2448 、0.7967 、0.4481 mg/g，RSD 分別為1.31%、0.26%、1.55%、0.38%、1.31%及0.25%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性

根據“2.1”方法色譜條件分別對制備后 0、2、4、8、12、24 h 試品溶液進行測定，記錄峰面積、保留時間，計算虎杖苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、西紅花苷Ⅰ、梔子苷的RSD 分別為0.34%、1.28%、1.37%、0.61%、1.28% 及1.23%，表明供試品溶液24 h 內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收率

在具塞錐形瓶中放入已知含量的樣品0.5 g，6 份，按100%加入6 個對照品，按照“2.3”實驗方法制成供試品溶液，測定溶液中成分的含量并計算回收率，同時以溶液檢測時的信噪比S/N ≥3 作為最低檢測限，見表2。

表2 加樣回收率結果

2.5.6 系統適應性

參照《中國藥典》[7]2015 年版第4 部“0512 高效液相色譜法”中系統適應性試驗進行考察，結果其柱效、分離度、靈敏度、重現性等均符合規定，故可用于含量測定。

2.6 樣品含量測定

取12 批次樣品，分別按“2.3”方法制備供試品溶液各3 份，每個溶液按“2.1”色譜條件進樣測定2 次，記錄峰面積，并按外標法計算虎杖苷、西紅花苷Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、梔子苷的含量，見表3。

2.7 數據分析

將表3 中的定量數據采用SIMCA 13.0 軟件進行主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）分析，結果如圖2 所示，12 個批次的肝復顆粒分為3 類，通過不同月份的生產批次區分，其成分含量差異與不同月份顆粒樣品的相對應。

圖2 PCA 和OPLS-DA 分析結果

此外，定量數據經SPSS 的聚類分析和因子分析后，結果見圖3，12 批次的顆粒樣品可分為3 類，均與月份樣品相對應。此結果與PCA 的分析一致。因子分析中，以特征值>1，方差貢獻率>80%為標準，發現成分1 和2 為主要的影響成分。由碎石圖和方差累積值（表4）可知，梔子苷和西紅花苷Ⅰ是影響差異的主要成分。

表4 解釋的總方差

圖3 聚類分析和因子分析結果

3 討論

本實驗同時測定肝復顆粒中6 種成分，將乙腈作為有機相是由于色譜峰的基線平穩和洗脫；選擇水相流動相時，加入磷酸，在一定程度上可以調節峰的平滑度和峰形的對稱性。由于磷酸具有一定黏度，因此選擇柱溫為40 ℃、流速為0.8 ml/min，以便溶劑流動相良好。在選擇上述參數的情況下，整個系統柱壓運行平穩，說明此提取條件可行。

因待測化合物具有不同的最大吸收波長，逐一選擇最大吸收波長對后期計算不便，因此綜合考慮選擇205 nm 為檢測波長，各化合物有一定的吸收強度。配制樣品時，需考察不同濃度溶劑對提取效果的影響，發現采用70%甲醇作為提取溶劑時，各組分的含量處于一個整體，較其他溶劑（水、乙醇、50%甲醇、70%乙醇等）提取水平高。

本實驗測定結果顯示，不同批次的6 種成分存在一定的差異，如丹參酮Ⅰ、虎杖苷在不同批次中含量差異波動>50%，可能是由于生產投料時原藥材含量質量差異所致，因此在選擇原藥材時，應規范藥材產區，以維持成分含量的平穩。且定量數據經軟件處理后，篩查出影響差異的主要因素是梔子苷和西紅花苷Ⅰ，為相應評定標準的建立提供參考依據。

另外，本實驗保證批次樣品間的穩定性，縮小了批次間的差異性，建立了梔子苷和西紅花苷Ⅰ的定量標準。本實驗應用HPLC 法對肝復顆粒6 種成分含量的測定以及質量控制，對比較不同批次的樣品及藥效評價提供了一定的數據參考。