復合酸化劑對大腸桿菌和沙門菌的體外抑菌效果探討

李明舉 楊小臺 趙瑋 戚卿業 由佳

摘? 要：隨著飼料中禁止添加除中草藥外的藥物飼料添加劑，畜禽生產中消化道和呼吸道疾病的發病率普遍升高。藥物投入增加和抗生素替代產品價格較高，導致飼養成本增加的問題凸顯，高效綠色抗生素替代產品的尋找已成為畜禽業關注的重點。本文通過對雞場中分離到的大腸桿菌和沙門菌進行復合酸化劑體外抑菌試驗，研究復合酸化劑對常見細菌的殺滅和抑制效果，為在養殖業中的合理使用提供參考。

關鍵詞：復合酸化劑；大腸桿菌；沙門菌；最小抑菌濃度；抑菌效果

中圖分類號：S854.4+3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）01-0080-04

酸化劑可作為添加劑用于飼料中，養殖場常用的酸化劑主要有檸檬酸、延胡索酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸及其鹽類，有的還混有適量的蘋果酸、琥珀酸、山梨酸和磷酸。由一種有機酸組成的酸化劑（簡稱“單一酸化劑”）存在功能簡單、添加量大、腐蝕性強、適口性差等缺點；由多種有機酸組成的復合酸化劑，能夠降低畜禽胃腸道內腔的pH，對大腸桿菌、沙門菌、葡萄球菌和梭菌等細菌具有殺滅和抑制作用，同時，還能夠調節腸道菌群結構和平衡，促進畜禽的生長和消化吸收，提高生產性能。因此，與單一酸化劑相比，復合酸化劑具有更多的優點。本研究將從病死雞上分離到的大腸桿菌和沙門菌菌株復蘇，通過測定兩種復合酸化劑的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），比較兩種復合酸化劑對大腸桿菌和沙門菌的體外抑菌效果。

1? 材料

1.1 試驗菌株和復合酸化劑

試驗菌株為從雞場病死雞上分離的大腸桿菌和沙門菌。復合酸化劑有A、B兩種。

1.2 試驗材料

無菌試管和三角燒瓶，營養瓊脂平板，營養肉湯，2倍濃縮營養肉湯，8×100 ?L排槍，200 ?L移液器，1 mL移液器，96孔細胞培養板，滅菌水，無菌的0.22 ?m過濾器，分光光度計，酶標儀。

2? 方法

2.1 菌株復蘇

取大腸桿菌、沙門菌凍存液各0.1 mL，分別接種到含有5 mL營養肉湯的試管中，37 ℃搖床振蕩培養6 h。

2.2 菌液稀釋

用分光光度計將菌液中的細菌數調整至1.5×10⁸CFU/mL。用營養肉湯將調整好的菌液稀釋1 000倍，用于測定MIC。

2.3 酸化劑預處理

取10 mL的復合酸化劑A和復合酸化劑B，分別加入10 mL的2倍濃縮營養肉湯，混勻，備用。

2.4 最小抑菌濃度（MIC）測定^[1]

2.4.1 加入營養肉湯

在96孔細胞培養板上每孔加入100 ?L的營養肉湯。

2.4.2 加受試溶液并梯度稀釋

在96孔細胞培養板前4行的第2列（A2，B2，C2，D2）加入100 ?L預處理的復合酸化劑A，向該培養板后4行的第2列（E2，F2，G2，H2）加入100 ?L預處理的復合酸化劑B，用排槍混勻后吸取100 ?L到第3列中，混勻，再從第? 3列中吸取100 ?L到第4列中，如此依次稀釋第11列，從第11列吸取100 ?L溶液棄掉。

2.4.3 加稀釋好的菌液

在96孔細胞培養板第1、2、5和6行，自第12孔向第2孔加入100 ?L大腸桿菌液（細菌數為1.5×10⁵CFU/mL），向該培養板第3、4、7和8行，自第12孔向第2孔加入100 ?L沙門菌液（細菌數為1.5×10⁵CFU/mL）。96孔細胞培養板第1列再加入100 ?L的營養肉湯，即第1列只有200 ?L的營養肉湯，不加酸化劑和菌液，作為陰性對照；細胞培養板第12列只有營養肉湯和菌液，不加酸化劑，作為陽性對照。

2.4.4 細菌培養

將96孔細胞培養板放置振蕩器上輕輕振蕩混勻，注意不要把孔內液體振出，然后放入? ?37 ℃恒溫培養箱中培養。

2.4.5 讀取結果

分別在培養18 h和30 h讀取MIC結果，自右向左完全不長菌的第1孔為受試溶液的MIC?？蓪?6孔細胞培養板放入酶標儀中，測定? ? 630 nm時的吸光度（optical density，OD），以OD630 nm值與200 ?L營養肉湯（陰性對照）一致的孔作為完全不長菌的陰性孔（圖1、圖2）。

3? 結果及分析

由表1得知，復合酸化劑A和B對大腸桿菌和沙門菌均具有抑制細菌生長的作用，培養18 h 后MIC結果顯示，試驗中選用的兩種復合酸化劑的最低抑菌濃度相同，均為0.2％（體積分數）。由表2得知，隨著時間的增加，復合酸化劑A和B對兩種細菌的抑菌作用逐漸減弱，細菌開始繁殖；從渾濁度來看，復合酸化劑A和B對大腸桿菌的抑菌作用稍好于對沙門菌的，但相互間差異不大；復合酸化劑A的抑菌效果稍好于復合酸化劑B的，但差異不大。

4? 討論

4.1 酸化劑在抑制細菌方面的研究

葉幫同等^[2]指出，酸化劑的作用機理主要是破壞細菌細胞壁，干擾細菌酶合成，抑制細菌內酶的活性，影響致病菌DNA的復制，大腸桿菌、沙門菌和梭狀芽孢桿菌在腸道內生長的最適pH分別為6.0～8.0、6.8～7.2和6.0～7.5，而乳酸桿菌生長的最適pH為5.4～6.4，酸化劑可以將腸道內腔pH降低到6.0以下，從而抑制有害微生物的繁殖，同時促進有益菌的增殖。雷燕等^[3]在同等酸度條件下比較了單一酸化劑及復合酸化劑的體外抑菌效果，結果發現復合酸化劑的抑菌效果優于單一酸化劑的。嚴欣茹等^[4]研究了復合酸化劑和抗生素對大腸桿菌、沙門菌等常見致病菌的體外抑菌效果，發現復合酸化劑對沙門菌和大腸桿菌的抑菌效果優于抗生素的，建議在日糧中添加適量的復合酸化劑。

4.2 酸化劑的應用前景

酸化劑作為一種無殘留、無耐藥性、無毒副作用的產品，具有調節動物機體腸道內腔pH、抑菌殺菌、提高酶活性、促進禽畜生長以及改善機體免疫功能等作用，在畜禽飼養中越來越受到廣泛的關注。尤其是在蛋雞生產中，酸化劑可提高日糧蛋白質的轉化率，緩解應激反應導致的呼吸性堿中毒，調節因機體代謝加強而引發的鈣磷比例失調以及產蛋率和蛋品質的下降，因而在提高蛋雞生產性能和蛋品質方面具有重要作用。

參考文獻

[1] 關飛，尤永君，安俊峰．三種酸化劑最小殺菌濃度（MBC）的測定[J]．中國動物保健，2015，17（4）：71-73.

[2] 葉幫同，李孟偉，陳清華．酸化劑的作用機理及應用[J]．湖南飼料，2015（3）：38-40.

[3] 雷燕，李瀚林，曾凡坤，等．不同單一酸化劑及復合酸化劑體外抑菌能力比較研究[J]．現代畜牧獸醫，2021（7）：28-31.

[4] 嚴欣茹，董璦榕，羅璋，等．磷酸復合型酸化劑及抗生素添加劑體外抑菌效果研究[J]．畜牧產業，2020（9）：65-70.

*通信作者：由佳（1982－ ），女，高級獸醫師，主要從事畜牧獸醫技術推廣工作