葉面真菌群落對白粉病發病的分子生態響應機制

黃海濤 劉文儀 楊文武 張建鐸 米其利 李菁菁 陳義強 李浩斌 尹華群 高茜

收稿日期：2023-08-13；修回日期：2023-10-07。

基金項目：云南省煙草化學重點實驗室開放課題項目（2021539200340244）。

作者簡介：#為并列第一作者。黃海濤，副研究員，主要從事煙草育種方面的研究。劉文儀，碩士研究生。

* 通信作者：高茜，副研究員，主要從事煙草育種方面的研究。E-mail： gaoqian@ynzy-tobacco.com。

摘 要：葉面微生物群落組成與植物葉部病害發生密切相關，但植物真菌性葉部病害的發病程度與葉面真菌群落組成及多樣性的關聯機制仍然未知。本研究利用真核生物內源轉錄間隔區（ITS）擴增子高通量測序技術，在茄科作物白粉病不同發病程度下，研究了葉面真菌群落的組成和多樣性差異，解析了葉面真菌分子生態網絡拓撲性質的變化規律，并探明了葉面真菌群落系統發育裝配的生態過程。多樣性分析表明，隨著白粉病病情程度加重，葉面真菌群落豐富度及多樣性逐漸下降；網絡分析表明，相較于中度和重度感病植株，輕微發病植株葉面真菌網絡的節點和連接數更多，網絡密度、聚集系數和平均連通度更高。在不同發病程度的植株中，葉面真菌群落的系統發育裝配的生態過程均由隨機性主導，但隨著發病程度加重，葉面真菌群落趨向于系統發育擴散。綜上所述，病原菌入侵改變了葉面真菌群落結構，擾動了真菌群落之間的相互作用和群落系統發育的生態裝配過程，這些結果為深入認識白粉病病害與葉面真菌群落關聯機制和生產上防控該病具有重要意義。

關鍵詞：白粉??；葉面微生物；真菌群落；生態網絡；群落裝配

中圖分類號：S432? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.01.009

Response in Fungal Community on Plant Leaves to Powdery Mildew

HUANG Haitao1#， LIU Wenyi2#， YANG Wenwu1， ZHANG Jianduo1， MI Qili1， LI Jingjing3， CHEN Yiqiang3， LI Haobin4， YIN Huaqun5， GAO Qian1*

（1. Yunnan Key Laboratory of Tobacco Chemistry， R&D Center of China Tobacco Yunnan Industry Co.， Ltd，? Kunming 650231， China; 2. College of Environment and Ecology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 3. Technical Center of Fujian Tobacco Industry Co.， Ltd， Xiamen 361022， China; 4. Yuxi Cigarette Factory， Hongta Group， Yuxi 653100， China;

5. School of Minerals Processing and Bioengineering， Central South University， Changsha 410083， China）

Abstract： The composition of microbial communities on leaf surface is closely related to plant foliar diseases. However， the response in fungal community on plant leaves to the severity of pant diseases are still unknown. In this study， we used high-throughput ITS amplicon sequencing technology to investigate the differences in the composition and diversity of fungal community on plant leaves with different disease severities of powdery mildew disease in Solanaceae crops. We analyzed the changes in the topological properties of molecular ecological networks of fungal community and explored the ecological processes of community phylogenetic assembly. Diversity analysis showed that as the severity of powdery mildew disease increased， the richness and diversity of fungal communities gradually decreased. Network analysis revealed that compared to plants with moderate and severe infection， plants with mild disease symptoms had more nodes and connections in the ecological network， with higher network density， clustering coefficient， and average connectivity. Among the plants with different disease severities， the ecological processes of phylogenetic assembly in fungal communities were dominated by stochastic processes， whereas the fungal communities tended to have phylogenetic dispersion with increasing severity of powdery mildew. In conclusion， invasive pathogens alter the existing community structure， disrupt the interactions between fungal communities， and influence the ecological processes of community phylogenetic assembly. These findings provide a deep insight into the association between powdery mildew disease and the fungal community on plant leaves.

Key words： powdery mildew; phyllosphere microorganisms; fungal community; ecological network; phylogenetic structure

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（1）： 073-079）

白粉?。╬owdery mildew）是在全球范圍內廣泛流行的植物真菌病害，其病原菌為二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）［1-2］，可導致作物葉片光合作用減少、生長受損、早衰和產量下降等，每年對農業造成了巨大的經濟損失［3］。例如：南非白粉病造成的年平均經濟作物損失為20%～30%；在奧地利、爪哇島、馬其頓王國和蘇門答臘，農作物白粉病頻發［4］，每年損失產值4億～5億美元。從生態學的角度看，白粉病的發生是葉面微生物群落結構穩態改變的過程，其微生物群落結構和多樣性的變化規律已有一定的研究。例如：感染白粉病后，南瓜（Cucurbita moschata）葉片細菌的數量、多樣性和豐富度均增加［5］；高抗薔薇（Rosa）的真菌多樣性降低，而高感薔薇的真菌多樣性則增加［6］。這些結果表明，白粉病的發生可能改變了葉面微生物的群落多樣性，并且真菌和細菌對白粉病的響應機制存在差異，但白粉病發病程度與患病植株葉面微生物結構及多樣性的關聯機制研究仍較少。

葉面微生物生態網絡及群落系統發育裝配與作物質量、發病密切相關。Lei等［7］發現，作物葉面真菌群落組裝過程顯著影響了作物質量；Tao等［8］研究發現，茄科作物感染葉斑病后，隨著侵染變嚴重，葉面網絡的復雜性降低，這表明作物病害是影響葉面微生物群落裝配的關鍵因素。然而，關于白粉病的發生如何改變感病植株葉面真菌相互作用和群落系統發育裝配的生態過程仍未清楚。

高通量測序技術被廣泛應用于探索環境微生物的多樣性及其功能研究，是目前環境微生物組研究的關鍵技術。本研究以白粉病感病作物為研究對象，利用內源轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）擴增子高通量測序技術探究葉面真菌群落多樣性及組成，旨在揭示葉面真菌群落的演替規律、微生物相互作用網絡變化和群落系統發育裝配。本研究結果發現了白粉病發病程度與微生物群落多樣性、微生物相互作用網絡、群落系統發育密切相關。這些研究結果對深入理解白粉菌侵染對植株葉面真菌群落的影響具有重要意義，可為白粉病的生態防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在云南省昆明市（24°23'N，102°10'E）進行了感染白粉病煙草樣品的采集。分別從輕微、中度和嚴重感染白粉病的煙葉中各隨機選取了6株進行采樣，分別編號為S（輕微發?。?、M（中度發?。┖虸（重度發?。?。在采集過程中，使用消毒剪刀將發病葉片剪下，并置于無菌取樣袋中。所有樣品均放入低溫保藏箱，再迅速帶回實驗室置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2 樣品DNA提取、擴增及測序

采用十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，CTAB）法對植株葉面樣品進行DNA提取，具體方法參照李淵等［9］的研究。吸取1 000 μL CTAB裂解液至2.0 mL EP管里，加入溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65℃水浴，期間顛倒混勻數次使樣品充分裂解。樣品總DNA提取完畢后，質量濃度和純度使用NanoDrop測定，純度A260 nm/A280 nm值要求在1.8～2.0。以微生物DNA［9］為模板，采用引物ITS1FI2（5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對真菌ITS2區域進行PCR擴增。PCR反應體系包含Phusion酶12.5 μL，正向引物和反向引物各2.5 μL，模板DNA為50.0 ng，加ddH2O至25.0 μL。PCR擴增反應條件為：98℃初始變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32個循環；最后72℃延伸10 min，降溫至4℃保存。利用gel extraction kit（OMEGA Bio-Tek Inc）純化PCR產物。利用Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen）對其定量，建庫后，在 Illumina NovaSeq PE250 平臺上進行高通量測序（聯川公司，LC-Bio Technology Co.，Ltd），得到已去接頭的FASTQ 格式原始數據。

1.3 序列處理和統計分析

利用 QIIME 2［10］ 軟件處理原始測序數據。按barcode 拆分樣品序列，低質量序列［質量控制（quality control，QC）<20；讀長 <200 bp］和嵌合體被去除后，以97%的相似水平將序列聚類生成可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并構建特征表；利用OTU代表性序列構建系統進化樹，并進行物種注釋。

利用microeco 0.5.1包［11］ 對細菌群落進行生態數據統計和可視化分析，采用Venn圖分析組間的共有和特有擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASVs），使用Ggplot2包繪制物種豐度圖，基于Kruskal-Wallis秩和檢驗和多重比較方差分析檢驗組間的細菌群落Alpha多樣性差異。采用主坐標分析（PCoA）對微生物群落進行降維分析，利用Bray-Curtis距離計算群落beta多樣性?；赟pearman 相關性系數（P<0.05）構建分子生態網絡（meolecular ecological network analysis，MENs），通過隨機矩陣理論（random matrix theory，RMT）確定最優相關系數閾值，使用 Gephi［12］繪制網絡圖。采用picante包［13］計算微生物群落的凈譜系親緣關系指數（net relatedness index，NRI）和最近種間親緣關系指數（nearest taxon index，NTI）。所有統計分析均在R 3.4.0 ［14］環境中實現。

2 結果與分析

2.1 群落演替

2.1.1 不同發病程度植株葉面真菌ASVs豐度和Alpha多樣性

通過ITS擴增子高通量測序技術對植株葉面真菌群落組成進行檢測，共得到12 488個擴增子序列變異體（ASVs）。如圖1所示，3個不同病害程度植株葉面共有的ASVs共161個（8.36%），而輕微（S）、中等（M）、嚴重（I）發病植株葉面特有的真菌ASVs數分別為626、259和154個。輕微發病植物葉面特有的真菌ASVs數是中等發病植株的2.42倍，嚴重發病植株的4.06倍，病害的發生顯著減少了特有真菌ASVs數量。

圖1 植株葉面真菌群落的韋恩圖分析

Fig. 1 Venn diagram of the number of ASVs of fungal community on plant leaves

如圖2所示，輕微發病的植物葉面Shannon多樣性指數為1.60±0.86，高于中度發?。?.28±0.05）和重度發?。?.08±0.03）的植物葉面Shannon多樣性指數。此外，輕微發病植物的葉面Simpson指數為0.49，低于中度和重度發病的植物葉面Simpson指數0.57和0.54。這表明，隨著白粉病發病程度加重，植株葉面真菌多樣性逐漸降低。

2.1.2 屬水平上不同感病程度植物葉面真菌的

群落組成

在屬分類水平上，如圖3所示，白粉病發病植株葉面真菌群落主要由高氏白粉菌屬（Golovinomyces）、枝孢屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、紅菇屬（Russula）和馬拉色菌屬（Malassezia）組成。在白粉病輕微患病植株葉面中，高氏白粉菌屬的相對豐度為11.86%，明顯低于中度（44.21%）和重度（40.93%）患病植株葉面高氏白粉菌屬的相對豐度，表明隨著發病程度的加重，高氏白粉菌屬的相對豐度呈現出先增加后減少的趨勢。在白粉病重度患病植物的葉面真菌微生物群落中，枝孢屬、紅菇屬、馬拉色菌屬和木霉屬（Trichoderma）的相對豐度分別為0.38%、0.10%、0.20%和0.01%，低于中度發病植株的相對豐度（0.63%、0.11%、0.29%、0.16%），也低于輕微發病植株的相對豐度（1.51%、1.62%、0.38%、0.37%）。這些結果表明，白粉病會對葉面真菌群落的相對豐度產生影響，進而可能影響葉際微生物的結構與功能。

2.1.3 真菌群落組成的 PCoA分析

主坐標分析（PCoA）表明，如圖4a所示，主成分1（PCo1）和主成分2（PCo2）可解釋白粉病患病植株葉面真菌群落組成的93.5%，其中PCo1的解釋度為68.6%，PCo2的解釋度為24.9%。輕微發病的植物葉面真菌群落主要分布在PCo1的正值區域，而中度和重度發病的葉面真菌群落主要分布在PCo1的負值區域。

β多樣性分析表明，如圖4b所示，隨著發病程度增加，葉面真菌β多樣性逐漸降低，即I（0.10）

2.2 分子生態網絡

為了研究植株葉面真菌群落相互作用與白粉病患病程度之間的關系，我們基于隨機矩陣理論構建了S、M、I 的分子生態網絡。結果顯示：輕微發病植株的節點個數（vetex）為324個，連接數（edge）為2 586個，平均連接度（average degree）為22.14；相較之下，中度發病植株節點個數（107）、連接數（186）和平均連接度（3.48）顯著減少，而重度發病植株節點個數（53）、連接數（52）和平均連接度（1.96）也顯著減少。這表明輕微發病植株葉面中真菌網絡物種間關系更加復雜，網絡密度、聚集系數和平均連通度更高（表2）。

網絡中物種間的相互關系可以分為正相關和負相關，前者意味著物種具有相似的生態位或存在共生關系，而后者則表示它們之間存在競爭或捕食關系。在3個不同發病程度植株網絡中，正相關關系占主導地位。在不同患病程度的植株葉面，S的正相關性最高（97.77%），高于M（93.01%）和I（96.54%），這表明在這些植物的葉面中真菌之間主要存在協同合作關系，競爭關系相對較少。這也意味著隨著白粉病發病程度加重，葉面真菌互作網絡的競爭關系比例逐漸提高（圖5）。

2.3 不同發病程度植株葉面群落譜系結構

如圖 6 所示，白粉病發病植株葉面真菌群落的βNTI絕對值全部在0到2之間，表明感病植株葉面真菌群落裝配由隨機性過程主導。如表3所示：在輕微發病組中，有1個樣品的NRI大于0，而有5個樣品的NRI小于0，此外，2個樣品的NTI大于0，而4個樣品的NTI小于0；在中度發病組中，6個樣品的NRI和NTI均小于0；在重度發病組中，有6個樣品的NRI和NTI均大于0。這些結果表明，在不同感病程度植株葉面群落中，系統發育指數NRI和NTI的變化趨勢相同。隨著感病程度的增加，患病植株葉面群落譜系結構呈現由聚集到發散的變化。在輕微感染病害的植株中，大部分樣品葉面真菌群落表現為譜系發散，少數表現為譜系聚集；在中度感染病害的植株中，葉面真菌群落表現為譜系發散；在嚴重感染的植株中，葉面真菌群落表現為譜系聚集。

3 討論

葉際微生物在塑造植物第一層免疫力防線方面發揮著至關重要的作用［15］。隨著對葉面微生物的關注逐漸增加，它們在抗病原體研究中的應用也越來越廣泛［16-17］。本研究旨在探究葉面真菌群落與白粉病的嚴重程度之間的關系，結果表明，白粉菌的侵染與葉面真菌群落的多樣性和微生物的相互作用密切相關。

大量研究表明，隨著病害的發生，作物微生物群落的多樣性會降低［18-19］。Liu等［20］的研究發現，微生物群落多樣性的變化可以用來指示微生物群落的變化。在我們的研究中，中度和重度發病組植株葉面真菌多樣性指數低于輕度發病組（圖2）。與之前的研究結果一致［21-22］，在作物發病初期，病原菌的豐度相對低，沒有對群落產生顯著影響，在葉面資源欠缺的條件下，病原菌與其他微生物的競爭加強，并在一定程度上促進了群落多樣性的增加。然而，隨著病原菌的定殖和增殖，葉面微生物群落原有的平衡被打破，導致群落多樣性明顯降低。

微生物之間的相互作用是葉面微生物組的重要組成部分［23］。已有研究顯示［8］，感染野火病的植株，隨著病害程度增長，葉面真菌網絡的復雜程度降低，真菌網絡的節點個數、連接數和平均連接度等拓撲屬性也降低。相似地，我們的結果表明，隨著白粉病病情加重，植株葉面真菌網絡的復雜性降低，表現為網絡節點數、連接數和平均連接度的減少（表2），并且負相互作用的比例增加。與Cordero等［24］的研究一致，隨著病原菌的侵染，發病后期真菌與病原菌負相互作用增加，病原菌與其他真菌進行資源競爭。

生態組裝過程對于構建微生物群落至關重要［25］。Wang等［26］的研究指出，茄科作物葉面細菌群落的大部分βNTI值落在-2和+2之間，表明隨機過程主導了葉面細菌群落系統發育裝配。同樣，我們也發現，發病植株葉表面真菌群落NTI在-2到2之間，表明隨機過程在群落過程中起著關鍵作用。然而，Liu等［27］的研究指出，土傳病病原菌入侵過程中，番茄作物根際細菌群落系統發育裝配的確定性過程重要性逐漸加強，并表現為系譜系結構聚集。這與我們的研究結果趨勢一致，即隨著發病變嚴重，葉面真菌群落譜系結構逐漸聚集。這些結果表明，病原菌的入侵可能競爭性排斥大部分具有較弱競爭力的物種，而與發育相似且具有較強競爭力的物種共存。

綜上所述，本研究揭示了白粉病不同發病程度植物葉面真菌群落的組成、分子生態網絡拓撲性質和群落系統發育裝配的差異。白粉菌的侵染導致葉面真菌群落的多樣性下降，改變了植株葉面真菌相互作用網絡結構，并增加真菌之間競爭關系的比例，譜系結構由發散到聚集。本研究對深入理解白粉病病害與葉面真菌群落關聯機制具有重要意義，為緩解和防控白粉病害提供了重要依據。

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