不同體色錦鯉體色觀察、基因表達以及過表達pnp4a對體色發育的影響

黃靖 王海濤 王梅 符文 彭亮躍 肖亞梅 劉錦輝

收稿日期：2023-07-24；修回日期：2023-10-02。

基金項目：國家自然科學基金項目（31802284）。

作者簡介：#并列第一作者。黃靖，碩士研究生；王海濤，碩士研究生。

* 通信作者：劉錦輝，副教授，主要從事魚類遺傳發育的研究。E-mail： 13099125@qq.com。

摘 要：錦鯉色彩鮮艷，游姿飄逸，觀賞價值高，被稱作“會游泳的藝術品”。魚類體色主要是由皮膚或鱗片上的色素細胞的種類和分布決定的。本文對黑色、白色、黃色和紅色4種不同體色錦鯉的鱗片和皮膚的色素細胞組成、分布及形態結構等進行了比較觀察，結果顯示，鱗片和皮膚的色素細胞組成一致，4種錦鯉均存在著豐富的虹彩細胞，在黑色錦鯉中還觀察到了黑色素細胞，黃色錦鯉和紅色錦鯉還分布著黃/紅色素細胞，在白色錦鯉中只觀察到虹彩細胞。利用透射顯微鏡觀察了4種體色錦鯉的虹彩細胞的超微結構，虹彩細胞主要有3種不同形態：梭形、短棒狀和空泡狀；采用實時熒光定量PCR檢測了8個虹彩細胞發育相關基因在4種不同體色錦鯉皮膚中的表達情況，結果顯示，8個虹彩細胞發育相關基因在不同體色錦鯉皮膚中均有表達，但表達存在差異，其中alk、pka、sox10、pax3、foxd3和pnp4a基因在紅色和黃色錦鯉中相對表達量較高，ltk和alx4a基因在白色錦鯉中相對表達量最高。為進一步證實pnp4a基因在虹彩細胞中的作用，構建了pnp4a過表達重組質粒，并將其顯微注射至AB斑馬魚受精卵中，過表達斑馬魚中虹彩細胞明顯多于對照組，進一步證實了pnp4a 在魚類體色形成尤其是在虹彩細胞發生方面發揮著重要作用。

關鍵詞：錦鯉；虹彩細胞；pnp4a；體色發育；基因表達

中圖分類號：Q78? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.01.004

Observation of Body Colour and Gene Expression in Koi of Different Body Colours， and the Effects of Overexpression of pnp4a on Body Colour Development

HUANG Jing#， WANG Haitao#， WANG Mei， FU Wen， PENG Liangyue， XIAO Yamei， LIU Jinhui*

（State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract： Koi is a brightly coloured， elegant fish with high ornamental value， and is known as a “swimming work of art”. Fish body colour is mainly determined by the type and distribution of pigment cells on the skin or scales. In this paper， the composition， distribution and morphology of pigment cells in the scales and skin of four different body colours， namely， black， white， yellow and red koi， were compared. The composition of pigment cells in the scales and skin was consistent， and rich iridescent cells were present in all four koi， with melanophores in black koi， and xanthophores and erythrophores in yellow and red koi. Only iridophores were observed in white koi. The ultrastructure of iridophores in all four koi colours was observed by transmission microscopy， and the iridophores mainly had three different morphologies： pike-shaped， short rod-shaped and vacuolated. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of eight iridocyte development-related genes in the skin of four different body colors of koi carp， the results showed that eight genes related to iridophores development were expressed in the skin of different body colours， whereas there were differences in expression， among which the relative expression of alk， pka， sox10， pax3， foxd3 and pnp4a genes was higher in red and yellow koi， while the relative expression of ltk and alx4a genes was the highest in white koi. In order to further confirm the role of the pnp4a genes in iridophores development， the recombinant plasmid of overexpression of pnp4a gene was constructed， and was microinjected into the fertilized eggs of AB zebrafish. In order to further confirm the role of pnp4a gene in fish body colour formation， especially in iridophores， we constructed a pnp4a overexpression recombinant plasmid and microinjected it into the fertilized eggs of zebrafish （AB）.

Key words： koi; iridophores; pnp4a; body color development; gene expression

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（1）： 031-039）

體色是一個重要的生物學性狀，在動物的偽裝、生存、求偶、繁衍等生命活動中起著重要的作用［1］。魚類體色主要由皮膚色素細胞隨著生長發育不斷遷移堆積形成。目前已知的色素細胞類型主要有4種，分別是黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞和虹彩細胞［2］。魚類體色著色類型主要有色素色和結構色2種，以及二者的結合［3］。色素色由色素細胞內色素顆粒對特定波長的入射光選擇性吸收所形成，如黑色素細胞內的黑色素、黃色素與紅色素細胞內的類胡蘿卜素［4］。結構色則是由胞內物對光線干涉和散射所形成，如虹彩細胞內鳥嘌呤晶體使魚體呈現銀色、藍色或金屬色澤［5-6］。魚類體色多樣，構成體色圖案的色素細胞的種類、分布以及色素相關基團的形態和密度變化均會影響魚類體色的形成［7-9］。目前，關于黑色素細胞、黃色素細胞和紅色素細胞的相關研究較多，而虹彩細胞的相關研究相對較少。

虹彩細胞是硬骨魚中常見的色素細胞之一，主要分布在皮膚和眼睛中［11］。虹彩細胞的化學本質是嘌呤，其著色相關的細胞器為反射血小板［12］，是一種含有鳥嘌呤的晶體結構，其形成與高爾基體的雙層膜囊泡有關［13］，在各種脊椎動物中產生明亮的反射結構顏色［14］。Morrison［15］認為，虹彩細胞能夠通過光學現象決定其呈現的顏色，而反射血小板的寬度和血小板層之間的細胞質間距決定虹彩細胞的最大反射光的波長。虹彩細胞的形成與分化受到多種基因以及遺傳因素的調控。cAMP信號傳導通路的效應激酶 （cAMP dependent protein kinase，PKA） ［16］能夠參與色素細胞的分化，H89抑制劑對PKA的抑制促使虹彩細胞數量增加，表明PKA對虹彩細胞的形成和分化具有一定的抑制作用［17］。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）和相關的白細胞酪氨酸激酶（leukocyte receptor tyrosine kinase，LTK）通過參與內神經嵴的調節來影響斑馬魚體色模式的發生，兩者的過表達均會促使虹彩細胞的形成和增加，其中ltk基因對虹彩發育起著主導作用［18-19］。對墨魚（Sepiella maindroni）的研究驗證了alx4a基因能夠調控虹彩細胞的分化，在鳥嘌呤合成途徑中具有潛在的調節作用［20］。Petratou等［21］通過基因敲除試驗驗證了缺失sox10的斑馬魚虹彩色素細胞出現缺失，虹彩色素產生失敗，證明sox10與pax3在虹彩色素細胞的分化過程中起關鍵作用。pnp4a被認為是虹彩細胞早期的標記基因［22］，是早期虹彩細胞表達所必須的。虹彩細胞的形成促進和維持了黑色素細胞以及黃色素細胞的形成，不同色素細胞共同調控體色圖案的生成［23］。

錦鯉（Cyprinus carpio var. koi），屬于輻鰭魚亞綱（Actinopterygii），鯉形目 （Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鯉屬（Cyprinus），是風靡當今世界的一種高檔觀賞魚，有“水中活寶石”的美稱［10］。錦鯉體色艷麗且復雜多變，體表分布著豐富的虹彩細胞，是研究虹彩細胞的絕佳對象之一。錦鯉按照顏色斑紋來分類，主要有單色類、雙色類和三色類。目前的研究對象主要集中在雙色和三色錦鯉中，而關于單色錦鯉的研究相對缺乏。

本論文以4種不同單色（黑色、白色、紅色、黃色）的錦鯉為試驗材料，對這4種錦鯉的皮膚和鱗片色素細胞的組成、結構及分布等特征進行比較觀察，并利用透射電鏡對錦鯉的虹彩細胞的超微結構進行了分類總結，檢測了8個虹彩細胞發育相關基因在4種不同體色錦鯉皮膚中的表達，研究了pnp4a基因在魚類體色發育中的作用。相關研究成果為觀賞魚類的分子遺傳選育和品質改良提供了重要的理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用野生型AB斑馬魚（Danio rerio）來自中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心，所用4種不同體色的錦鯉來自長沙花鳥市場，4種不同體色錦鯉如圖1所示。

圖1 4種不同體色錦鯉

Fig. 1 Four different body colors of koi

（a）白色錦鯉；（b）黃色錦鯉；（c）黑色錦鯉；（d）紅色錦鯉。

（a） White koi; （b） Yellow koi; （c） Black koi; （d） Red koi.

1.2 4種不同體色錦鯉組織學觀察

將4種不同體色錦鯉用MS-222（100 mg/L）麻醉后，使用經75%酒精消毒后的剪刀和鑷子采集頸背部鱗片和皮膚。因其鱗片較薄且透明，在經過生理鹽水清洗干凈后，可置于載玻片上制成臨時玻片，在顯微鏡下觀察并對色素細胞的類型、形態和分布情況進行記錄。采集的皮膚組織經生理鹽水清洗后，一部分切成4 mm×4 mm的組織塊。組織塊經聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物包埋后，利用冰凍切片機進行切片（表皮層），切片厚度為10 μm，中性樹膠封片，使用顯微鏡觀察并對色素細胞的形態和分布進行記錄。另一部分皮膚組織盡量剔除肌肉，取樣體積小于1 mm3，快速投入2.5%戊二醛中，4℃固定10 h以上。0.2 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次10 min。1%餓酸固定液固定2 h，0.2 mol/L的PBS清洗3次，每次10 min。經10%至100%丙酮梯度脫水，環氧丙烷置換10 min后，環氧樹脂Epon812浸透包埋。EMUC6超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾染色2 h過夜。利用透射電子顯微鏡（HT7800，日本）觀察并拍照。

1.3 總RNA的提取及反轉錄PCR反應

用總RNA試劑盒（OMEGA，美國）提取錦鯉皮膚組織的mRNA， PrimerScript RT Reagent Kit （Takara公司）反轉錄合成cDNA后，進行alk（XM_042742958.1）、pka（XM_042718134.1）、sox10（XM_042719427.1）、pax3（XM_019072770.2）、ltk（XM_042774590.1）、alx4a（XM_019090555.2）、foxd3（XM_042758374.1）和pnp4a（XM_042734177.1）基因的mRNA水平檢測，以β-actin為內參，用GraphPad Prism軟件分析這些體色相關基因在不同體色錦鯉皮膚中的表達情況，進行3次以上重復試驗。引物序列參照表1。

1.4 pnp4a基因的過表達

首先，使用HiPure Total RNA Midi Kit RNA提取試劑盒（Magen公司，R4124）進行斑馬魚胚胎RNA的提取，再用反轉錄試劑盒（TAKARA公司，RR047A）進行反轉錄得到斑馬魚cDNA。根據NCBI基因庫中上傳的斑馬魚pnp4a基因序列（NM_001002102.1）篩選得到其蛋白編碼區（coding sequence，CDS），比較過表達所選擇的質粒載體與基因序列，篩選得到Hind III與Nhe I雙酶切位點。使用引物設計原則在CDS區上下游兩端設計帶有人工添加酶切位點的引物。以反轉錄得到的斑馬魚cDNA為模板，加入設計的引物，進行PCR擴增，得到目的片段。將其與P-EGFP-N1質粒載體進行連接得到過表達重組質粒（圖2）。在顯微注射儀上將所構建的過表達質粒顯微注射至AB斑馬魚胚胎中，顯微注射的過表達質粒的質量濃度控制在100～200 ng/μL，并且注射P-EGFP-N1質粒載體作為對照。然后，在熒光顯微鏡下觀察質粒的表達情況、用總RNA試劑盒（OMEGA，美國）提取對照組和試驗組斑馬魚的mRNA，PrimerScript RT Reagent Kit（Takara公司）反轉錄合成cDNA后，進行pnp4a基因的mRNA水平檢測，β-actin為對照，用GraphPad Prism軟件分析該基因在不同時期的表達情況，進行3次以上重復試驗。

圖2 pnp4a過表達質粒載體圖譜

Fig. 2 pnp4a overexpression plasmid vector map

2 結果與分析

2.1 4種不同體色錦鯉色素細胞的顯微觀察

鱗片顯微觀察顯示：4種體色錦鯉鱗片上均分布有大量排列緊密的梭形虹彩細胞，白色錦鯉鱗片（圖3a～3c）上無其他色素細胞類型；黃色錦鯉鱗片（圖3d～3f）上還分布有黃色素細胞，且黃色素細胞分布十分廣泛；黑色錦鯉鱗片（圖3g～3i）上還分布有黑色素細胞和黃色素細胞，黑色素細胞分布在鱗片基區，排列緊密呈現高度分化的團狀，有少量黃色素細胞分布在黑色素細胞周圍；紅色錦鯉鱗片（圖3j～3l）上還分布有紅色素細胞，紅色素細胞呈現高度聚集的滴狀且分布廣泛。在鱗片的不同區域上，色素細胞的分布和種類同樣具有差異。同時，不同區域上的鱗片大小、色素細胞分布、色素細胞形態、色素細胞大小和數量也具有差異。

皮膚冰凍切片觀察顯示：白色錦鯉皮膚表皮層無色素細胞分布，色素層僅分布虹彩細胞（圖4a～4c）；黃色錦鯉表皮層僅分布黃色素細胞，色素層連續分布有大量虹彩細胞，表皮層和色素層均無黑色素細胞存在（圖4d～4f）；黑色錦鯉表皮層和色素層均分布有虹彩細胞、黃色素細胞和黑色素細胞（圖4g～4i）；紅色錦鯉表皮層僅分布有大量紅色素細胞，色素層間斷分布虹彩細胞和紅黃色素細胞，表皮層和色素層均無黑色素細胞存在（圖4j～4l）。

2.2 4種不同體色錦鯉虹彩細胞的超微結構觀察

通過透射電子顯微鏡觀察4種不同體色錦鯉皮膚，在電鏡下可觀察到3種類型虹彩細胞反光板結構：第一類為呈梭形的虹彩細胞（圖5a～5c）；第二類為呈短棒狀的虹彩細胞（圖5d～5f）；第三類為呈空泡狀的虹彩細胞（圖5g～5i）。虹彩細胞反光板均呈銀白色，反光小板平行排列或者緊密相鄰，長短大小不一。同一個體不同的組織部位的虹彩細胞類型存在差異。本文透射電鏡以背部皮膚為研究對象，4種不同體色的錦鯉在背部區域并不是都存在這3種類型的虹彩細胞。其中黑色錦鯉中空泡狀虹彩細胞幾乎無分布，梭形虹彩細胞在白色錦鯉中分布最多，紅色和黃色錦鯉中均分布有這3種類型的虹彩細胞。

2.3 虹彩細胞發育相關基因在4種不同體色錦鯉皮膚中的表達分析

運用反轉錄PCR檢測了alk、pka、sox10、pax3、foxd3、pnp4a、ltk和alx4a這8個虹彩細胞發育相關的基因在不同體色錦鯉皮膚中的表達情況（圖6）。8個基因在4個不同體色錦鯉中均有表達，但表達情況存在差異：alk、pka、sox10、pax3、foxd3和pnp4a基因在紅色和黃色錦鯉中相對表達量較高，在黑色和白色錦鯉中相對表達量較少；ltk和alx4a基因在白色錦鯉中相對表達量最高，在黑色、黃色和紅色錦鯉中相對表達量較少。

2.4 AB斑馬魚pnp4a基因的過表達

為進一步證實pnp4a基因在虹彩細胞中的作用，利用P-EGFP-N1質粒構建了pnp4a基因過表達質粒載體（圖2）。采用顯微注射技術，并通過體式熒光顯微鏡進行熒光篩選，獲得了具有熒光的陽性胚胎（圖7a～7c），綠色熒光持續10 d后消失，注射情況如表2所示。顯微鏡下觀察并分析表型特征，受精后第11天開始，眼部虹膜發育，虹彩細胞才開始形成。第15天，腹部虹彩細胞分化明顯，在不同背景下觀察，發現試驗組（圖7f～7g）斑馬魚虹彩細胞遠多于對照組（圖7d～7e）。利用實時熒光定量PCR分析比較了pnp4a基因在試驗組和對照組中不同時期的相對表達量（圖7h），結果顯示，試驗組pnp4a基因的表達量遠遠高于對照組。

3 討論

魚類色素細胞種類豐富，體色模式具有多樣性。鱗片為皮膚組織的衍生物，色素細胞多分布在真皮層、鱗片和魚鰭上。黑色素細胞、紅色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞是魚類中4種常見的色素細胞［24］。色素體可以選擇性地吸收特定波長光，同時反射其他波長的光，并與色素細胞相互作用，形成不同的體色圖案［25］。除此之外，體色圖案也受到遺傳因素、環境因素和食物營養成分等多種因素的影響。

錦鯉作為一種風靡全球的高檔觀賞魚類，現如今已經成為眾多學者的研究對象。結合鱗片顯微觀察、皮膚冰凍切片觀察和皮膚透射電鏡觀察的結果，本研究對4種不同體色錦鯉的色素細胞種類、分布和形態分布特征進行了觀察總結。我們發現在白色、黃色、黑色和紅色錦鯉鱗片上均分布著大量且致密的虹彩細胞，不同體色錦鯉在黑色素細胞、黃色素細胞和紅色素細胞的分布上存在顯著差異，其中黑色素細胞僅在黑色錦鯉上存在，白色錦鯉未觀察到其他色素細胞類型，黃色素細胞和紅色素細胞在黃色和紅色錦鯉上廣泛分布。透射電鏡結果顯示，4種體色錦鯉中存在3種類型的虹彩細胞：梭形、短棒狀和空泡狀。周康奇等［26］在鸚鵡魚鱗片超微結構中觀察到了棍棒狀和桿狀的虹彩細胞，同我們觀察到的短棒狀和梭形結果一致，此外，我們還發現了呈現空泡狀的虹彩細胞。不同的形態和分布特征同樣也是虹彩細胞呈色的重要影響因素之一。壁虎能夠發出綠色的熒光，而導致這種現象的原因是其分布的兩種類型的虹彩細胞，熒光虹膜體和基底型非熒光虹膜體，后者可能起到鏡子的作用，增強熒光［17］；在巨型蛤蚌中虹膜細胞直徑和層間距的特定組合是其產生特定顏色的關鍵［27］。

為進一步探究虹彩細胞，本研究選取了8個與虹彩細胞相關的基因（alk、pka、foxd3、sox10、pax3、alx4a、ltk和pnp4a），對它們在不同體色錦鯉皮膚中的mRNA相對表達水平進行檢測。alk基因通過參與內神經脊的調節來影響斑馬魚體色模式的發生，過表達alk基因將會促使虹彩細胞的形成和數量增加［18-19］。pka被cAMP激活后，通過磷酸化蛋白質參與到細胞分化、生長等各種生命活動中，包括色素細胞內的色素小體細胞器的運輸［28］。foxd3屬于叉頭類轉錄因子，在遷移前的神經嵴細胞中表達，其對虹彩細胞的分化是必需的。缺失foxd3的斑馬魚部分神經嵴衍生物出現了分化缺陷，包括軟骨細胞、外周神經元細胞、膠質細胞以及虹彩細胞，其中，虹彩細胞大量減少，而黑色素細胞和黃色素細胞基本不受影響［29］。alk、pka和foxd3基因在黃色和紅色錦鯉皮膚中相對表達量較高，推測二者可能參與紅黃色素細胞的發育。sox10在早期神經嵴細胞發育和分化中具有重要的作用，缺少sox10使得快速遷徙的神經嵴細胞未達到成熟階段就會死亡［30］。sox10基因對斑馬魚黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞的發育都是必需的，推測sox10在黃色和紅色錦鯉中相對表達量高，顯示了其對紅黃色素細胞的發育具有重要作用。pax3在神經嵴發育過程中起著重要作用［31］，是斑馬魚神經嵴細胞分化為黃色素細胞和腸神經元所必須的。pax3在黃色和紅色錦鯉中相對表達量較高，進一步佐證了其在黃色素細胞發育中的重要作用。alx4a編碼一種轉錄因子，在虹彩細胞中高度富集。在斑馬魚中敲除alx4a 基因，受精后4 h時發現突變體僅在眼睛處觀察到虹彩細胞，表明虹彩細胞不能完成分化［32］。ltk編碼屬于受體酪氨酸激酶類的白細胞酪氨酸激酶［33］。在斑馬魚中，ltk在遷移前的神經嵴細胞中表達，隨后在虹彩細胞譜系中持續穩定表達。alx4a和lkt在白色錦鯉皮膚中顯著表達，這與白色皮膚中虹彩細胞數量多的現象具有一致性，進一步證明了lkt在虹彩細胞發育中的作用。

pnp4a基因是虹彩細胞早期發育的標記基因。范云鵬等［34］發現，pnp4a基因在花鯽和紅鯽各個組織以及發育的各個時期中均有表達。Kuriyama等［35］研究發現，pnp4a基因在青鳉中被敲除后，導致虹彩細胞色素沉著減少。本研究觀察陽性胚胎的體色發育過程，發現其發育至第15天時，試驗組虹彩細胞顯著多于對照組。熒光定量結果顯示，pnp4a基因在試驗組斑馬魚中各時期的表達量顯著高于對照組，說明pnp4a是虹彩細胞形成和發育的重要調控基因。以上研究進一步證實，pnp4a基因對于虹彩細胞形成具有重要作用。不同的色素細胞類型和分布特征是導致錦鯉呈現不同體色的重要原因，與此同時，不同的基因表達水平也和體色息息相關，以上因素共同作用、相互影響，最終使得錦鯉體色豐富多彩。本研究結果為觀賞魚類的體色改良研究積累了基礎資料。

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