釀酒酵母培養條件優化

潘冬梅，楊傳倫，張心青，李 杰，李大鵬，韓立霞，馮文娟，和富明，傅英旬，翟 嬌，成魯南，李丙祥

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256500；2.山東博華高效生態農業科技有限公司，山東濱州 256500；3.山東京博控股集團有限公司，山東濱州 256500）

益生菌微生態制劑是全面禁抗環境下產生的一種新型綠色添加劑，能有效維持胃腸道微生態平衡，改善微生物種類（劉瀟，2018），提高消化吸收，并具有無殘留、無毒副作用的優點（Lokapirnasari 等，2019）。釀酒酵母是常用的益生菌微生態制劑，可降低家畜瘤胃中的氧氣（Gao等，2017），利于有益菌的繁殖，提高飼料消化率，改善家畜健康狀態和生產性能（He 等，2019）。目前涉及釀酒酵母作為益生菌微生態制劑的研究較多。

Thrune 等（2020）研究發現，釀酒酵母的重要作用之一是減緩瘤胃家畜pH 的下降，從而保持瘤胃健康，提高家畜生產性能。牛建康等（2021）研究結果顯示，添加釀酒酵母的奶牛瘤胃pH 為6.22 ～6.27，處于正常范圍且波動較小。Chaucheyras-Durand 和Fonty（2022）、Marden等（2021）多項研究表明，釀酒酵母可以降低瘤胃家畜的氧化還原電勢，有利于提高并促進厭氧微生物的活性。Ding 等（2019）研究表明，釀酒酵母可提高瘤胃微生物豐度。金鑫（2019）研究發現，酵母細胞壁（Yeast cell wall，YCW）由β- 葡聚糖和甘露聚糖兩種主要功能成分組成，可以作為免疫調節因子提高家畜免疫力。Bose 等（2022）、Brown 等（2021）研究表明，β- 葡聚糖可與巨噬細胞和淋巴細胞等表面受體結合，從而刺激機體 免 疫 系 統。Machová 和Bystricky（2022）、Cheng 等（2020）研究發現，甘露聚糖具有良好的免疫原性、抗氧化性及抗炎等功能。

近年來，人們利用微生物發酵技術為基礎獲得釀酒酵母益生菌微生態制劑（趙小麗等，2014），已取得一定進展。微生物的培養條件（如培養溫度、培養時間、培養基初始pH、菌齡、接種量等）在很大程度上影響釀酒酵母的發酵水平（李聰，2014），關乎釀酒酵母作為益生菌微生態制劑的應用成本。王穎等（2007）報道，通過優化釀酒酵母S.cerevisiae高密度培養條件優化，溫度30℃、轉速150 r/min，菌液最高OD600值和細胞密度分別達15.82 和2.03×108CFU/mL。宋志元等（2015）報道表面，通過優化釀酒酵母發酵條件，初始pH值6.0，裝液量75 mL/500 mL，接種量5.0%，振蕩速率180 r/min，發酵溫度30℃，釀酒酵母活菌數達到5.8×108CFU/mL。

為進一步改善釀酒酵母的培養條件，提高菌體產量，降低應用成本。本試驗在前期釀酒酵母培養基優化基礎上采用單因素試驗篩選釀酒酵母培養條件，再以釀酒酵母菌體干質量（dry cell mass，DCM）為響應值，利用響應面法對釀酒酵母培養基條件進行優化，為釀酒酵母生產提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由本實驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑 葡萄糖、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳、維生素B1、維生素B7（分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；糖蜜（工業生產用）、酵母抽提物（分析純或生化試劑）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養基 種子培養基（g/L）（陳雪等，2014）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，121℃滅菌20 min。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖48、糖蜜50、酵母抽提物78、硫酸銨2、磷酸氫二鉀3、氯化鈣0.1、硫酸鋅0.05、硫酸錳0.05、維生素B10.1、維生素B70.1，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備 XY-1B/2C 電子天平：江蘇省常州市Xingyun ；405-60-SC 型精密pH 計：梅特勒；BKQ-Z301 立式壓力蒸汽滅菌器：山東博科集團；SW-CJ-2G 型超凈工作臺：聚創環保設備有限公司；HZQ-QD 型恒溫恒濕振蕩培養箱：蘇州威爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

（1）種子液制備：挑取1 環釀酒酵母菌株的新鮮斜面接種于100 mL YPD 培養基 中，28 ℃，180 r/min 條 件 下 震 蕩 培 養16 h（OD600nm=1.2 ～1.4）。

（2）發酵方法：將菌齡為16 h 種子液，按5%接種于裝有100 mL 初始pH 為7.0 發酵培養基中，28℃，180 r/min 條件下震蕩培養48 h，檢測酵母菌體干質量。

（3）酵母菌體干質量（dry cell mass，DCM）的測定（Xu 等，2016）：酵母發酵液6000 r/min離心5 min，用蒸餾水洗滌菌體2 次，105℃烘干至質量恒定。

1.3.2 釀酒酵母培養條件優化

（1）單因素試驗 培養溫度篩選：將菌齡為16 h 種子液，按5% 的接種量、接種于初始pH 為7.0 滅菌后的發酵培養基中，發酵溫度分別為22、24、26、28、30℃，180 r/min 條件下振蕩培養48 h后檢測酵母菌體干質量。

培養時間篩選：將菌齡為16 h 種子液，按5%的接種量接種于初始pH 為7.0 滅菌后的發酵培養基中，按已確定培養溫度，180 r/min 條件下振蕩培養時間分別為24、48、72、96、120 h 后檢測酵母菌體干質量。

培養基初始pH 篩選：將菌齡為16 h 種子液，按5% 的接種量接種于初始pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 滅菌后的發酵培養基中，按已確定發酵溫度，180 r/min 條件下振蕩培養已確定時間后，檢測酵母菌體干質量。

菌 齡 篩 選：將 菌 齡 分 別 為8、12、16、20、24 h 種子液，按5% 的接種量接種于已確定初始pH 滅菌后的發酵培養基中，按已確定發酵溫度，180 r/min 條件下振蕩培養已確定時間后檢測酵母菌體干質量。

（2）響應面試驗 根據釀酒酵母培養條件單因素優化結果，選擇對酵母菌體干質量影響較大的培養溫度、培養時間、培養基初始pH、菌齡4 個因素，采用Box-Behnken 試驗設計作響應面試驗（WANG 等，2015），試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母培養條件單因素試驗

2.1.1 培養溫度試驗 釀酒酵母培養溫度不同，生長速率也不同，在合適的溫度下酵母菌體干質量積累多。由圖1 可知，在培養溫度為24℃時，酵母菌體干質量最高，為24.10 g/L；當培養溫度為24 ～30℃時，酵母菌體干質量隨溫度升高而下降，可能高溫加速了酵母菌體的衰亡，導致酵母菌體干質量降低（鄒艷等，2017）。因此，釀酒酵母最適培養溫度為24℃。

圖1 不同培養溫度對酵母菌體干質量的影響

2.1.2 培養時間試驗 由圖2 可知，當培養時間為24 ～72 h 時，酵母菌體干質量隨培養時間延長而增高；培養時間為72 h 時，酵母菌體干質量最高，為27.34 g/L；當培養時間為72 ～120 h 時，酵母菌體干質量有所下降。因此，釀酒酵母最適培養時間為96 h。

圖2 不同培養時間對酵母菌體干質量的影響

2.1.3 培養基初始pH 試驗 由圖3 可知，培養基初始pH 為6.5 時酵母菌體干質量最高，為28.67 g/L，pH 偏低或偏高都不利于酵母菌體的生長。因此，釀酒酵母最適培養基初始pH 為6.5。

圖3 不同培養基初始pH 對酵母菌體干質量的影響

2.1.4 菌齡試驗 菌齡代表種子液的培養時間，種子液在對數期轉接發酵瓶，菌種生理代謝最強，不同菌齡對酵母菌體干質量的影響結果見圖4，當菌齡為12 h 時，酵母菌體干質量最高，為29.31 g/L，種子液處在對數期。因此，釀酒酵母最適菌齡為12 h。

通過釀酒酵母培養條件單因素試驗優化，釀酒酵母在培養條件為：培養溫度24℃、培養時間96 h、培養基初始pH6.5、菌齡12 h 時，酵母菌體干質量最高為29.56 g/L。

2.2 釀酒酵母培養條件響應面試驗

2.2.1 Box-Benhnken 試驗結果與分析 根據釀酒酵母培養條件單因素優化結果選擇對酵母菌體干質量影響較大的培養溫度（A）、培養時間（B）、培養基初始pH（C）、菌齡（D）為自變量，酵母菌體干質量（R）為響應值，運用Box-Benhnken 試驗設計29 組試驗。設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設計結果

表3 回歸模型方差分析

所得的多元二次回歸方程為：

由表3 可知，模型相關系數R2=0.9614，調整決定系數R2Adj=0.9227，模 型P值＜0.0001，模型顯著；失擬項P值0.0562 ＞0.05，失擬項不顯著，表明模型可用于分析釀酒酵母的培養條件試驗結果（Marek 等，2016）。由P值可知，一次項A，交互項CD，二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F 值可知，4 個因素對酵母菌體干質量影響由大到小順序為：培養溫度（A）＞培養基初始pH（C）＞菌齡（D）＞培養時間（B）。

圖5 為根據多元二次回歸方程繪制培養基初始pH（C）和菌齡（D）交互作用的三維響應面圖。由圖6 可知，酵母菌體干質量隨著培養基初始pH（C）和菌齡（D）兩者均呈現先增加后減少的趨勢，C、D 交互作用響應面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，對酵母菌體干質量的影響極顯著（P＜0.01）（Kieliszek 等，2015）。根據二次回歸方程得到釀酒酵母最優培養條件為：培養溫度23.74℃、培養時間71.44 h、培養基初始pH 6.53、菌齡12.11 h 時，酵母菌體干質量最高為29.72 g/L。

圖5 培養基初始pH 和菌齡交互作用對酵母菌體干質量影響的響應面

2.2.2 模型驗證 為了方便操作，將釀酒酵母培養條件修正為：培養溫度23.5 ℃、培養時間71.5 h、培養基初始pH 6.5、菌齡12 h。在此條件下進行3 次平行驗證試驗，酵母菌體干質量平均值為（29.70±0.04）g/L，與預測值基本一致，說明模型可以較好地反映出酵母菌體干質量與培養條件變化關系的趨勢（李莉等，2015）；同時，用釀酒酵母最優培養條件發酵較優化前提高了33.12%。

3 結論

本研究取釀酒酵母菌體干質量培養的重要條件進行單因素試驗，篩選4 個重要影響因素，根據Box-Behnken 設計原理設計響應面試驗，得出釀酒酵母最優培養條件為：培養溫度23.5℃、培養時間71.5 h、培養基初始pH 6.5、菌齡12 h。在最優培養條件下，酵母菌體干質量達到（29.70±0.04）g/L，較優化前提高33.12%。