云木香二氯甲烷提取物抗肝纖維化活性成分的鑒定*

黃韻秋, 張正寬, 李靖, 付瓊, 李晶, 廖尚高*

(貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550025)

云木香 [Saussrureacostus(Falc.) Lipech或AucklandialappaDecne]又稱木香、青木香、廣木香及興瞿草[1-2]。云木香為云南道地藥材,后引種至我國貴、川、兩廣等高寒潮濕等地,是全國重點中藥材生產品種[3]。中國藥典收錄的多種中成藥如小兒香精丸、八寶坤順丸、三九胃泰膠囊等均采取云木香為主要原料[4]。云木香根莖入藥,具有解除平滑肌痙攣、降壓、抗菌、健胃及止痛的功效[5],現代藥理研究對云木香及其活性成分主要集中在抗腫瘤、抗炎及抑菌方面[5]。已有的研究表明,云木香中存在單萜、倍半萜、三萜、糖苷、蒽醌及其它小分子類化合物,其中分離得到的倍半萜類單體占比最多,達200余個,為云木香的主要活性成分,涉及愈創木烷、吉瑪烷、桉葉烷及橄欖烷等骨架類型,其中桉葉烷型骨架類型在該種屬中數量最豐富[6]。隨著對云木香的深入研究,含量較少的倍半萜二聚體和倍半萜與氨基酸雜合體也更多地被發現[6]。本課題組前期預實驗結果顯示,云木香95%乙醇提取物的二氯甲烷部位具有較好的抗肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)作用[半數抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)=62 mg/L],但其活性成分未知。因此,本研究對該部位的化學成分進行研究,并評價各化學成分對人肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)株LX-2的增殖作用的影響,確定二氯甲烷部位抗HF的活性成分。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要藥材及細胞來源 本研究所用的藥材購自貴州土特產中藥材批發市場,經貴州醫科大學龍慶德副教授鑒定為鳳毛菊屬植物云木香(S.costus)的根,該藥材標本(20190710)保存于貴州醫科大學天然藥物化學教研室;人HSC株LX-2購自廣州吉尼歐有限公司。

1.1.2主要試劑 色譜分析、分離用的薄層層析硅膠GF254和柱層析硅膠(青島海洋化工廠),Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia Biotech),石油醚(60～90 ℃,上海泰坦科技股份有限公司),分析純醋酸乙酯和甲醇(國藥集團化學試劑有限公司),色譜甲醇和乙腈(上海薩恩化學技術有限公司),分析純丙酮和氯仿(上海申博化工有限公司),胎牛血清(加拿大維森特生物技術有限公司),二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和噻唑藍(methyl thiazolyltetrazolium,MTT;北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3主要儀器 Bruker AVANCE NEO 600M核磁共振(NMR)波譜儀(德國 Bruker公司),Thermo Scientific TSQ Endura三重四級桿質譜儀(美國賽默飛世爾科技公司),全波長多功能酶標儀(Bio-Tek)和SW-CJ-2D 型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),2001HY-6003型CO2細胞培養箱以及TS-8 型轉移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1提取與分離 干燥的云木香藥材根莖30 kg打成粗粉,室溫浸泡24 h,95%乙醇加熱回流提取2 h,共3次,合并粗提物并減壓濃縮得到醇提浸膏5 kg;水溶浸膏,按等體積量有機試劑極性從小到大依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯及正丁醇進行萃取,共計3次,完成分段處理。對二氯甲烷萃取部位(1 000 g),以正相硅膠(300～400目)為吸附劑,石油醚∶醋酸乙酯(純石油醚、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、純醋酸乙酯)進行梯度洗脫,薄層色譜檢識后合并相同組分,共得到7個流分(Fr.1～Fr.7)。Fr.1(2.0 g)通過硅膠柱(300～400目)層析,以石油醚∶丙酮(40∶1、20∶1、5∶1)梯度洗脫,所得組分再經硅膠柱(300～400目)層析,以石油醚∶醋酸乙酯(40∶1、20∶1、5∶1)進行梯度洗脫,得到化合物11(5.0 mg)。Fr.2(39.7 g)通過硅膠柱(300～400目)層析,以石油醚∶丙酮(40∶1、20∶1、5∶1)梯度洗脫,得到11個組分(Fr.2-1～Fr.2-11);Fr.2-6經硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯,30∶1、10∶1、5∶1)梯度洗脫后得到6個組分(Fr.2-6-1～Fr.2-6-6);Fr.2-6-1經反復硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯,50∶1、30∶1、10∶1)梯度洗脫分離得到化合物2(20.1 mg)。Fr.2-6-2經正相制備型高效液相色譜(preparative HPLC, pHPLC;石油醚∶醋酸乙酯為70∶30)分離得到化合物3(2.3 mg)。對Fr.2-6-5先經Sephadex LH-20層析(氯仿∶甲醇為3∶2)進行分離除雜,再經反相pHPLC(甲醇∶水為68∶32)分離得到化合物13(7.1 mg)。Fr.2-8經反復硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯,50∶1、30∶1、10∶1)梯度洗脫分離得到化合物1(19.5 mg)。Fr.3(7.3 g)經硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶丙酮,20∶1、10∶1、5∶1)進行梯度洗脫分離得到13個組分(Fr.3-1～Fr.3-13)。Fr.3-3經反相pHPLC(甲醇∶水為68∶32)分離得到化合物12(5.1 mg)。Fr.3-9經硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯為20∶1、0∶1)分離后再利用pHPLC(甲醇∶水為65∶35)純化后得到化合物16(1.2 mg)。Fr.4(11.2 g)經硅膠柱(300～400目)色譜,以石油醚∶丙酮(20∶1、10∶1、5∶1、7∶3、3∶2)梯度洗脫,得到5個組分Fr.4-1～Fr.4-5。Fr.4-3采用MCI(乙醇∶水,0%～100%)洗脫,分離得到9個組分Fr.4-3-1～Fr.4-3-9。Fr.4-3-8經硅膠柱(二氯甲烷∶醋酸乙酯為1∶0、0∶1)后經過正相pHPLC(石油醚∶醋酸乙酯為60∶40)分離得到化合物8(2.0 mg)。Fr.4-3-2經過反相pHPLC(甲醇∶水為60∶40)分離得到化合物15(4.1 mg)。Fr.4-3-3經硅膠柱(300～400目)層析(二氯甲烷∶甲醇為1∶0、0∶1) 洗脫得到Fr.4-3-3-1～Fr.4-3-3-5。Fr.4-3-3-1經過硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶丙酮為20∶1、0∶1)分離得到化合物14(1.2 mg)。Fr.4-3-4經羥丙基葡聚糖凝膠柱(sephadex LH-20,氯仿∶甲醇為3∶2)洗脫得到6個組分Fr.4-3-4-1～Fr.4-3-4-6,Fr.4-3-4-3經過硅膠柱(300～400目)層析(二氯甲烷∶醋酸乙酯為1∶0、0∶1)洗脫得到5個組分(Fr.4-3-4-3-1～Fr.4-3-4-3-5),Fr.4-3-4-3-4經反相pHPLC(甲醇∶水為56∶44)分離得到化合物6(1.5 mg),其中Fr.4-3-4-3-1經過正相pHPLC(石油醚∶醋酸乙酯為60∶40)分離得到化合物5(1.3 mg),Fr.4-3-3-4經過反相pHPLC(甲醇∶水為64∶36)分離得到化合物4(1.4 mg)。Fr.4-2經過硅膠柱(300～400目)層析(二氯甲烷∶甲醇為1∶0、0∶1)洗脫后得到9個組分(Fr.4-2-1～Fr.4-2-9),Fr.4-2-3先經羥丙基葡聚糖凝膠柱(Sephadex LH-20)分離后經正相pHPLC(石油醚∶醋酸乙酯為40∶60)純化得到化合物9(2.2 mg)和化合物10(1.5 mg);Fr.4-2-6過硅膠柱(300～400目)層析(石油醚∶醋酸乙酯為1∶0、0∶1)和反相pHPLC(甲醇∶水為72∶28)分離純化得到化合物7(2.1 mg)。

1.2.2化合物單體成分及陽性藥的配制 二甲基亞砜溶解單體化合物以及陽性藥索拉非尼,配制成100 mmol/L母液,-20 ℃保存備用。

1.2.3細胞培養 LX-2細胞使用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養基(完全培養基)于37 ℃、5%CO2及90%濕度環境中孵育,顯微鏡下觀察細胞長滿培養瓶至80%～90%后進行一傳二培養,每隔2 d換液,取處于對數期細胞用于抗HF活性測試。

1.2.4抗HF活性測試 取處于對數生長期的LX-2細胞,胰蛋白酶消化,用培養基混懸以50個/L的密度以100 μL/孔體積接種于96孔培養板中,邊緣加無菌PBS 200 μL,鋪板24 h,棄上清;1、10、50、100及200 μmol/L不同濃度單體化合物組以100 μL/孔加入板中,另設正常對照組、DMSO對照組、陽性藥對照組,以上各組均設6個復孔;給藥48 h,棄上清,避光加5 g/L MTT溶液100 μL,孵育4 h,除盡上清液,加二甲亞砜100 μL,搖床搖勻10 min;選定測定波長為492 nm,于酶標儀上測定溶液的吸光度(absorbance,A),計算細胞存活率。

2 結果

2.1 結構鑒定

經質譜和NMR數據分析,所分離到的16個化合物結構分別得以鑒定(如圖1)。

圖1 從云木香中分離得到的16個化合物Fig.1 16 compounds isolated from Saussurea costus

2.1.1化合物1無色針晶(丙酮)。ESI-MS為 255.1 [M+Na]+。1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ: 6.05 (1H,d,J=3.6 Hz,H-13a),5.66 (1H,d,J=3.6 Hz,H-13b),4.79 (1H,dd,J=11.2,3.6 Hz,H-1),4.74 (2H,m,H-5,6),2.61 (1H,m,H-7),2.31～2.20 (3H,m,H2-9,H-3a),2.09～2.05 (3H,m,H-3b,H2-2),1.95～1.91 (1H,m,H-8a),1.69～1.65 (1H,m,H-8b),1.63 (3H,s,CH3-15),1.34 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 170.0 (C-12),140.6 (C-11),140.5 (C-4),137.0 (C-10),127.5 (C-1),126.2 (C-5),119.4 (C-13),81.2 (C-6),49.5 (C-7),40.4 (C-9),38.8 (C-3),27.1 (C-8),25.8 (C-2),17.0 (C-15),15.9 (C-14)?；衔?鑒定為木香烯內酯。

2.1.2化合物2無色針晶(丙酮)。ESI-MS為 253.1 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 6.26 (1 H,d,J=3.3 Hz,H-13a),5.53 (1H,d,J=3.3 Hz,H-13b),5.31 (1H,d,J=1.8 Hz,H-15a),5.11 (1 H,d,J=1.8 Hz,H-15b),4.94 (1H,br s,H-14a),4.86 (1H,br s,H-14b),4.00 (1H,t,J=9.3 Hz,H-6);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 170.2 (C-12),151.2 (C-11),149.2 (C-4),139.7 (C-10),120.1 (C-13),112.6 (C-15),109.5 (C-14),85.2 (C-6),52.0 (C-5),47.6 (C-7),45.1 (C-1),36.2 (C-3),32.5 (C-9),30.9 (C-8),30.2 (C-2)?；衔?鑒定為脫氫木香內酯。

2.1.3化合物3淡黃色膠狀物。ESI-MS為 271.1 [M+K]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 6.01 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13a),5.49 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13b),4.93 (1H,s,H-15a),4.76 (1H,s,H-15b),4.06 (1H,t,J=10.9 Hz,H-6),2.63 (1H,m,H-7),0.89 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CD3OD,)δ:173.4(C-12),146.9 (C-4),141.8 (C-11),117.5 (C-13),109.5 (C-15),82.3 (C-6),56.5 (C-5),51.5 (C-7),43.2 (C-1),41.2 (C-3),40.2 (C-10),37.5 (C-9),24.5 (C-8),23.0 (C-2),18.8 (C-14)?；衔?鑒定為β-環木香烯內酯。

2.1.4化合物4白色粉末。ESI-MS為 259.2 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 5.16 (1H,s,H-13a),5.13 (1H,s,H-13b),4.72 (1H,d,J=1.3 Hz,H-15a),4.39 (1H,d,J=1.3 Hz,H-15b),4.33 (2H,s,H2-12),3.49 (1H,s,-OH),2.30 (1H,m,H-5),2.29～2.27 (1H,m,H-3b),2.03 (1H,m,H-3a);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 154.3 (C-11),150.0 (C-4),110.5 (C-13),104.8 (C-14),74.1 (C-7),64.4 (C-12),43.4 (C-5),40.9 (C-1),36.4 (C-3),35.1 (C-6),35.6 (C-9),35.1 (C-10),32.1 (C-8),23.0 (C-2),14.9 (C-15)?；衔?鑒定為7α-木香醇。

2.1.5化合物5白色粉末。ESI-MS為 271.1 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 6.09 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13a),5.41 (1H,d,J=3.1 Hz,H-13b),4.99 (1H,s,H-15a),4.86 (1H,s,H-15b),4.03 (1H,t,J=10.9 Hz,H-6),3.53 (1H,dd,J=11.5,4.6 Hz,H-1),2.18 (1H,d,J=10.9 Hz,H-5),0.82 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 170.8 (C-12),142.6 (C-4),139.4 (C-11),117.2 (C-13),110.8 (C-15),79.7 (C-6),78.4 (C-1),53.1 (C-5),49.7 (C-7),43.1 (C-10),35.8 (C-9),33.7 (C-3),31.5 (C-2),21.6 (C-8),11.8 (C-14)?；衔?鑒定為瑞諾木烯內酯。

2.1.6化合物6白色粉末。ESI-MS為 273.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 6.21 (1H,s,H-13a),5.50 (1H,s,H-13b),5.10 (1H,s,H-5),2.83～2.68 (2H,m,H-6,7),2.13 (1H,m,H-2a),1.99 (1H,m,H-3a),1.90 (1H,m,H-3b),1.81 (1H,dd,J=9.2,5.2 Hz,H-1),1.59～1.75 (3H,m,H-9a,H-9b,H-2b),1.54 (3H,s,CH3-15),1.17 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 170.0 (C-12),145.8 (C-11),136.5 (C-4),124.4 (C-13),122.4 (C-5),73.8 (C-10),45.6 (C-1),42.9 (C-9),42.9 (C-7),37.6 (C-6),29.6 (C-3),25.9(C-8),25.1 (C-14),23.8 (C-15),23.1 (C-2)?；衔?鑒定為10α-羥基青蒿酸。

2.1.7化合物7無色油狀物。ESI-MS為 271.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 5.13 (1H,s,H-15a),4.99 (1H,s,H-15b),4.94 (1H,s,H-14a),4.85 (1H,s,H-14b),3.94 (1H,t,J=9.7 Hz,H-6),3.61 (1H,td,J=9.3,5.4 Hz,H-8),2.96 (1H,m,H-1β),2.83 (1H,t,J=9.1 Hz,H-5),2.68 (1H,dd,J=12.6,5.3 Hz,H-9a),2.61 (1H,dq,J=10.7,7.1 Hz,H-11) 2.52～2.46 (2H,m,H-3a,3b),2.17～2.08 (1H,m,H-9b),1.95 (1H,m,H-2a),1.86 (1H,m,H-2b),1.33 (3H,d,J=7.1 Hz,CH3-13);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 181.7 (C-12),153.5 (C-4),146.8 (C-10),114.2 (C-14),109.5 (C-15),82.3 (C-6),76.1 (C-8),56.4 (C-7),53.8 (C-5),48.4 (C-1),48.3 (C-9),42.7 (C-11),33.4 (C-2),31.0 (C-3),16.5 (C-13)?；衔?鑒定為8α-羥基-11β-11,13-二氫去氫海桑內酯。

2.1.8化合物8白色粉末。ESI-MS為 485.3 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 5.30 (1H,s,J=1.8 Hz,H-15a),5.07 (1H,s,J=1.8 Hz,H-15b),4.93 (1H,s,H-15′a),4.84 (1H,s,H-14a),4.77 (1H,s,H-14b),4.67 (1H,s,H-15′b),4.03 (1H,t,J=9.6 Hz,H-6),3.85 (1H,dd,J=10.7,4.3 Hz,H-12′a),3.80 (1 H,dd,J=10.7,7.2 Hz,H-12′b),3.12 (1H,t,J=9 Hz,H-5),2.95 (1H,m,H-7),2.86 (1H,m,H-1),2.75 (1H,s,H-6′a),2.53 (2H,m,H-3),2.49 (1H,m,H-11′),2.48 (1H,m,H-5′),2.46 (1H,s,H-9a),2.32 (1H,m,H-3′a),2.28 (1H,s,H-6′b),2.09～2.03 (1H,m,H-1),1.97～1.89 (5H,m,H-2a,H-3′b,H-9b,H-13a,H-13′a),1.84～1.75 (3H,m,H-2′,H-13b),1.82 (1H,m,H-8),1.78 (1H,m,H-13′b),1.44 (1H,m,H-1′b,H-2′b),1.25 (1H,m,H-2b),0.91 (1H,s,CH3-14′);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 202.7 (C-16),180.8 (C-12′),159.6 (C-12),152.8 (C-4),152.0 (C-4′),150.6 (C-10),147.8 (C-10′),130.6 (C-14′),111.5 (C-14),109.7 (C-15′),108.3(C-15),84.1 (C-6),64.5 (C-6′),51.8 (C-5′),50.1 (C-5),47.9 (C-7),47.0 (C-1′),46.2 (C-1),44.9 (C-11),43.5 (C-13),38.0 (C-7′),35.9 (C-9),33.4 (C-11′),32.8 (C-9′),31.4 (C-3),30.2 (C-17),29.8 (C-2′),29.4 (C-3′),24.1 (C-2),22.8 (C-8′),21.0 (C-8),15.4 (C-13′)?；衔?鑒定為Vlasouliolide B。

2.1.9化合物9白色粉末。ESI-MS為 271.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 5.94 (1H,d,J=3.2 Hz,H-13a),5.43 (1H,d,J=3.2 Hz,H-13b),5.31 (1H,m,H-3),3.97 (1H,t,J=11.0 Hz,H-6),3.55 (1H,dd,J=10.1,6.7 Hz,H-1),2.51 (1H,m,H-7),2.33 (1H,m,H-5),2.26 (1H,m,H-2α),2.06～2.00 (1H,m,H-8α),2.04 (1H,m,H-9β),1.97 (1H,m,H-2β),1.76 (3H,s,H-15),1.64～1.56 (1H,m,H-8β),1.30～1.24 (1H,m,H-9α),0.81 (3H,s,H-14);13C-NMR ( 150 MHz,CD3OD)δ: 172.9 (C-12),141.1 (C-11),134.8 (C-4),123.0 (C-3),117.2 (C-13),83.6 (C-6),76.0 (C-1),52.5 (C-5),52.3 (C-7),42.3 (C-10),35.7 (C-9),33.6 (C-2),23.8 (C-15),22.3 (C-8),11.5(C-14)?；衔?鑒定為珊塔瑪內酯。

2.1.10化合物10淡黃色粉末。ESI-MS為 273.1 [M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 3.42 (1H,dd,J=12.2,3.5 Hz,H-1),3.33 (1H,s,OH),2.39 (1H,dq,J=11.6,3.3 Hz,H-11),2.18 (1H,m,H-3),2.05 (1H,m,H-3),1.98 (1H,m,H-9b),1.92 (1H,m,H-8),1.80 (3H,s,CH3-15),1.77～1.67 (1H,m,H-2a),1.67～1.61 (2H,m,H-2b),1.57 (1H,m,H-8),1.32 (1H,m,H-9a),1.16 (3H,d,J=6.9 Hz,CH3-13),0.93 (3H,s,CH3-14);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 181.4 (C-12),131.1 (C-5),126.3 (C-4),84.5 (C-6),78.5 (C-1),54.4 (C-7),43.2 (C-10),42.0 (C-11),39.7 (C-9),34.5 (C-3),27.8 (C-2),25.2 (C-8),19.9 (C-15),18.9 (C-14),12.6(C-13)?；衔?0鑒定為草蒿素。

2.1.11化合物11亮黃色油狀。ESI-MS為 319.3 [M+K]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 7.38～6.83 (6H,m,Ar-H),5.99 (2H,m,H-8,8′),5.16～5.04 (5H,m,H2-9,9′,OH),3.88 (3H,s,OCH3),3.43 (2H,d,J=6.6 Hz,H2-7),3.35 (2H,d,J=6.6 Hz,H2-7′);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 157.4 (C-4),151.2 (C-2′),138.2 (C-8′),136.9 (C-8),132.5 (C-5′),130.9 (C-2),130.6 (C-6′),130.6 (C-5),129.4 (C-1),129.1 (C-3),128.6 (C-1′),128.3 (C-6),116.3 (C-9′),115.9 (C-9),115.8 (C-4′),111.3 (C-3′),55.9 (OCH3),39.8 (C-7′),34.6 (C-7)?；衔?1鑒定為4-O-和厚樸酚。

2.1.12化合物12無色蠟狀固體。ESI-MS為 395.3 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 7.54 (2H,d,J=8.6 Hz,H-6,6′),7.36 (2H,d,J=2.4 Hz,H-3,3′),7.13 (2H,dd,J=8.6,2.4 Hz,H-5,5′),1.34 (18H,s,H3-12～14,12′～14′),1.29 (18H,s,H-8～10,8′～10′);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 147.8 (C-1,1′),147.2 (C-4,4′),138.7 (C-2,2′),124.6 (C-3,3′),124.1 (C-5,5′),119.3 (C-6,6′),35.0 (C-7,7′) ,34.7 (C-11,11′),31.6 (C-12,13,14,12′,13′,14′),30.3 (C-8,9,10,8′,9′,10′)?；衔?2鑒定為2,2-氧雙(1,4)-二叔丁基苯。

2.1.13化合物13白色無定型粉末狀。ESI-MS為 501.2 [M+HCOO]-。1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)δ: 12.05 (1H,s,OH-28),4.65 (1H,d,J=2.1 Hz,H-29b),4.56 (1H,d,J=1.3 Hz,H-29a),1.63 (3H,s,CH3-30),0.94 (3H,s,CH3-27),0.88 (3H,s,CH3-26),0.87 (3H,s,CH3-23),0.77 (3H,s,CH3-25),0.66 (3H,s,CH3-24);13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 177.2 (C-28),150.3 (C-20),109.6 (C-30),76.8 (C-3),55.4 (C-17),54.9 (C-5),49.9 (C-10),48.5(C-19),46.6 (C-18),42.0 (C-14),40.2 (C-8),38.5 (C-1),37.6 (C-4),37.6 (C-13),36.7 (C-9),36.1 (C-22),33.3 (C-7),31.7 (C-16),29.5 (C-21),28.1 (C-15),27.5 (C-23),27.2 (C-2),26.5 (C-12),19.8 (C-11),18.9 (C-29),17.3 (C-6),15.9 (C-25),15.8 (C-24),15.7 (C-26),14.4 (C-27)?；衔?3鑒定為樺木酸。

2.1.14化合物14白色粉末。ESI-MS為 205.1 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 9.83 (1H,s,CHO),7.16 (2H,s,H-2,H-6),6.08 (1H,s,OH),3.98 (6H,s,OCH3);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 190.9 (-CHO),147.5 (C-3,C-5),140.9 (C-4),128.2 (C-1),106.8 (C-2,C-6),56.6 (OCH3)?；衔?4鑒定為4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛。

2.1.15化合物15淺黃色固體。 ESI-MS為127.2 [M+H]+。1H-NMR (CD3OD,600 MHz)δ: 9.54 (1H,s,-CHO),7.38 (1H,d,J=3.6 Hz,H-3),6.58 (1H,d,J=3.6 Hz,H-4),4.61 (2H,s,H2-6);13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 179.6(-CHO),163.4 (C-5),154.1 (C-2),125.1 (C-3),110.9 (C-4),57.8 (C-6)?；衔?5鑒定為5-羥甲基糠醛。

2.1.16化合物16淡黃色針狀結晶。ESI-MS為269.0 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ: 8.09 (1H,d,J=9.7 Hz,H-4),7.66 (1H,d,J=2.1 Hz,H-2),7.08 (1H,d,J=2.1 Hz,H-3),6.37 (1H,d,J=9.7 Hz,H-3),4.15 (3H,s,C5-OCH3),4.03 (3H,s,C6-OCH3);13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 161.0 (C-2),150.0 (C-9),145.6 (C-2′),144.6 (C-5),143.4 (C-7),140.1 (C-4),135.3 (C-6),114.3 (C-3),113.9 (C-8),109.6 (C-10),104.5 (C-3′),62.6 (C6-OCH3),61.4 (C5-OCH3)?；衔?6鑒定為茴芹內酯。

2.2 活性測試

化合物的抗HF活性測試結果(表1)表明,與空白對照比較,多數化合物對LX-2細胞的增殖有不同程度的抑制作用。其中,化合物2、8、9及11在考察的濃度范圍內可以更加有效抑制LX-2細胞的增殖,其IC50依次為14.86、51.09、47.23及40.84 μmol/L;從活性數據來看,愈創木烷型化合物的活性相對突出,其中的化合物2具有最為顯著的LX-2細胞增殖抑制作用;桉烷類倍半萜9雖然也表現出了一定的LX-2細胞增殖抑制作用,但該類結構中的其它化合物活性則相對較弱。

表1 不同濃度分離化合物對LX-2的細胞存活率及IC50 的影響Tab.1 Effect of different concentrations of isolated compounds on LX-2 cell survival rates and IC50

3 討論

HF是各種急慢性肝損傷引起的以炎癥反應和在肝臟中由于膠原累積形成過量細胞外基質(extracellular matrix,ECM)為主要損傷修復特點的病理過程[7]。目前抗HF的方法主要包含中醫療法、西醫療法、中西醫結合治療以及其它療法,中醫治療主要采用中藥復方(膈下逐瘀湯、鱉甲煎丸)、中藥單體(大黃素、五味子素)以及針灸療法,西醫治療采用抗HF治療、抗病毒治療(核苷類藥物、微生態制劑聯用及干擾素聯合抗病毒治療),雖然藥物品種繁多,但尚無有效根治HF的藥物[7]。

HF的形成機制比較復雜,涉及多種因素。其中,HSC增殖活化激活后并轉化為肌成纖維細胞是HF的中心環節[8];在正常生理條件下肝臟中HSC處于靜息狀態,當肝臟受到外界刺激時靜息的HSC會被激活,并表現出明顯的細胞增殖[8]。因此,抑制HSC的活化和增殖為抗HF藥物研發提供了思路。

人HSC株 LX-2細胞是從正常人的肝臟中分離出來并在低血清條件下進行培養而得來的HSC,與人體內激活的HSC極為相似,是抗HF藥物篩選的重要工具[8]。本課題組前期預實驗抗HF藥物篩選中發現,云木香的氯仿萃取物對人HSC株 LX-2細胞的增殖具有顯著的抑制作用,但是其抗HF活性物質尚未可知。本研究以抗HSC增殖的抑制活性為導向,對云木香的二氯甲烷部位進行了化學成分研究,從中分離得到了16個化合物,將分離化合物的波譜數據與國內外研究[9-24]分別比對最終確定化合物1～16的結構歸屬。其中化合物1～10為倍半萜類化合物(化合物8為二聚倍半萜),是其中的主要化合物;化合物13為三萜類化合物;化合物11和16為苯丙素類化合物;這些倍半萜類成分以桉烷型(化合物3、4、5、9及10)為主,并同時包括愈創木烷型(化合物2、7及8)、杜松烷型(化合物6)和吉瑪烷型(化合物1)倍半萜;在這些化合物中,化合物4、11、12及16為首次從云木香中分離得到;從16個化合物的LX-2細胞增殖抑制作用來看,化合物2、8、9及11活性相對突出,可能是云木香的主要抗HF活性成分;從化合物8的結構看,二聚體的存在似乎對愈創木烷類倍半萜的活性有利,這與二聚倍半萜的特殊作用相一致[25]。同時,不飽和環外雙鍵五元內酯環結構可能是該類結構中的化合物2活性最強的主要原因。在5個桉烷性倍半萜中,具有該類結構的化合物5和9均有不同程度的HSC增殖抑制活性,而無該結構的化合物4和10則沒有活性,說明該結構對此類化合物的HSC增殖抑制活性至關重要。另一方面,構效關系分析表明,相較于Δ3(15)雙鍵(化合物5),Δ3雙鍵(化合物9)對活性更有利。這些構效關系的發現對倍半萜抗HF的研究提供參考。有關這些化合物抗HF機制的研究對該類化合物抗HF的藥物研發也將產生重要影響。