病原菌血流感染對阿爾茨海默病小鼠記憶力和海馬錐體細胞的影響*

姚昌昊, 周曉明, 康穎倩*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 微生物學教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省普通高校病原生物學特色重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 3.貴州醫科大學 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 4.貴陽市婦幼保健院 質控科, 貴州 貴陽 550003)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)作為一種老年癡呆疾病,發病往往較為隱匿,呈緩慢進行性發展,早期以近記憶功能下降為主,隨病程的進展逐漸造成遠記憶功能受損,主要表現為記憶障礙、語言功能減退及視空間障礙為主[1];進而引起患者日常生活能力下降,中晚期出現幻覺、妄想、行為失常、睡眠障礙等神經精神癥狀,容易合并深部感染[2]。近年來,我國人群年齡結構出現老年人群占比越來越高的情況,因此AD患者人數也明顯增多,對患者家庭以及社會層面都帶來了巨大壓力[3-5]。有數據顯示,目前,全球有近5 000萬AD患者,并預判30年后將新增15 200萬AD患者,AD 已成為全球第5大死因[6-7]。AD模型小鼠的造模方法眾多,其中化學方法造模較為常見[8]。D-半乳糖(D-galactose)是一種還原性單糖物質,可致大腦出現認知功能和膽堿能功能障礙,原因是其可迅速升高大腦組織滲透壓,介導氧化應激及炎癥反應,因此通過腹壁皮下連續注射D-半乳糖可建立AD模型小鼠[9]。目前關于AD小鼠尾靜脈感染自AD患者來源的病原菌研究國內報道較少,因此,本研究擬探討AD患者合并感染的病原菌經尾靜脈注射AD模型小鼠形成血流感染后對其記憶和海馬結構的影響,為AD患者的治療提供實驗室參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物和菌株來源 2月齡、體質量18～22 g的C57BL/6J雄性小鼠50只,購于成都達碩實驗動物有限公司[SCXK-(川)2020-030],采用SPF級輻照維持飼料(北京科澳協力飼料有限公司)飼養于SPF級標準動物房中,確保食物和飲水供應充足,飼養于溫度20～26 ℃、濕度40%～50%的環境中,12 h晝夜交替照明,小鼠每日自由進食和飲水,飼養及使用程序均嚴格遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》要求規范,并獲學校實驗動物倫理委員會的批準(N2200384);成都某醫院綜合內科住院、確診為AD合并深部感染患者的痰液、血液及尿液中提取的5種數量較多并具有一定代表意義的病原菌,分別為大腸埃希菌(SYY001)、銅綠假單孢菌(SYY002)、肺炎克雷伯桿菌(SYY003)、金黃色葡萄球菌(SYY004)及白念珠菌(SYY005),5種菌株均保存于15%甘油管中并儲存于-20 ℃冰箱。

1.1.2主要試劑和儀器 D-半乳糖(南京都萊生物技術有限公司,純度99%,100 g/瓶),LB固體培養基、營養瓊脂、麥康凱瓊脂培養基、血平板及沙氏瓊脂培養基(北京索萊寶生物科技有限公司);SW-CJ-IF型超凈工作臺(上海一恒科學儀器有限公司),Morris水迷宮系統(諾達思北京信息技術有限公司),高壓蒸汽滅菌鍋(上海醫療設備廠),DHP-9902型電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司),AUW220型電子天平(日本島津儀器有限公司),震蕩切片機(上海之信儀器有限公司),KH-TK型組織脫水機(湖北闊海醫療科技有限公司),PBM-A型病理組織包埋冷凍臺(常州普瑞斯星醫療設備公司),RM2125型輪轉式切片機(上海徠卡儀器有限公司),ECLIPSE Series型普通光學顯微鏡(日本尼康公司),數字切片掃描儀Pannoramic 2503DHISTECH(Hungary),KH-01型麥氏比濁儀(北京海富達科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠造模及體質量測定 50只C57BL/6J雄性小鼠第1周適應性飼養,第2周開始使用D-半乳糖按200 mg/(kg·d)腹部皮下注射造模[10]。D-半乳糖溶液配置方法為生理鹽水7 mL加D-半乳糖0.2 g于燒杯中,玻璃棒攪拌均勻,倒入試劑瓶;取無菌生理鹽水3 mL沖洗燒杯及玻璃棒,沖洗液全部倒入試劑瓶中;每天使用醫用無菌注射器腹壁皮下注射配制好的D-半乳糖液0.2 mL,注射時間為8周[11]。造模期間每周觀測小鼠的一般狀態及體質量。

1.2.2菌株復蘇 造模結束后,將大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌及白念珠菌統一復蘇后傳至第2代備用。其中,大腸埃希菌使用LB固體培養基進行復蘇培養,銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯桿菌使用麥康凱瓊脂培養基進行復蘇培養,金黃色葡萄球菌使用血平板進行復蘇培養,白念珠菌使用SDA培養基進行復蘇培養。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第4版要求進行[12]。

1.2.3小鼠分組及體質量、體溫測定 取“1.2.2”項下傳至第2代的5種病原菌,使用麥氏比濁儀配置菌液為0.5麥氏濃度(1.5×1011CFU/L)后備用,此為原始濃度。因課題組前期預實驗5種病原菌菌液原始濃度為1.5×1011CFU/L時感染AD模型小鼠死亡,而5種病原菌菌液濃度為1.5×108CFU/L時感染AD小鼠觀察14 d后仍存活。為避免小鼠死亡,按照參考文獻[13-16]方法將5種病原菌的菌液濃度稀釋為1.5×109CFU/L(高濃度)、1.5×108CFU/L(中濃度)及1.5×107CFU/L(低濃度)進行實驗,每種病原菌菌液有3個濃度,每個濃度3只小鼠重復。5組病原菌感染組的小鼠注射相應菌液,對照鼠小鼠注射無菌生理鹽水,且每只小鼠均采用尾靜脈注射法注射相應液體0.2 mL;5個病原菌感染組分別是大腸埃希菌組(9只)、銅綠假單孢菌組(9只)、肺炎克雷伯桿菌組(9只)、金黃色葡萄球菌組(9只)及白念珠菌組(9只),且同一菌株按前述濃度分為高濃度組、中濃度組及低濃度組;觀察14 d,分別于注射后第1、2、3天及第1、2周測定各組小鼠的體質量及體溫[17]。

1.2.4水迷宮實驗 取“1.2.3”項下實驗結束時各組小鼠進行Morris水迷宮實驗。實驗開始前將所有小鼠置于水迷宮系統實驗室,以便小鼠適應實驗室環境,避免受驚。前5 d為定位航行實驗,其主要用來評價小鼠的學習記憶功能;第2～5天,將平臺置于水平面下1 cm位置,其余操作同第1天;定位航行實驗結束 24 h 后,撤除水下平臺,任選 1 個入水點將小鼠面向池壁放入水中,各組小鼠必須在同一入水點,記錄小鼠在120 s 內第1次跨越平臺時間、跨越平臺次數等指標[18]。

1.2.5海馬組織學特征觀察 取“1.2.4”項下實驗結束時各組小鼠禁食12 h,稱取空腹體質量;脫頸處死各組小鼠,冰上解剖,取頭顱、剪開皮膚暴露顱骨、鑷子夾住兩側眼眶用眼科剪稍減除顱骨中線,清晰可見后全腦組織,使用無菌眼科鑷去除腦膜和血管,竹簽從嗅球處向下取出全腦[18];腦組織移至冰上切割,使用無菌眼科鑷及玻璃分針緩慢的將一側大腦皮層撥開,暴露出海馬組織,取出兩側海馬,4 ℃的0.9%生理鹽水清洗,定性濾紙吸干海馬表面的生理鹽水;采用10%多聚甲醛溶液固定過夜,石蠟包埋、切片后常規蘇木精-伊紅(HE)染色,普通光學顯微鏡下觀察海馬CA1及CA3區(200倍),用數字切片掃描儀掃描后采圖。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

造模到第8周時,50只模型小鼠活動度逐漸減慢、觸須脫落,毛色枯黃、光澤度下降,皮膚松弛,體質量開始下降,進食減少,且精神狀況較造模初期明顯下降。見圖1。

圖1 D-半乳糖干預小鼠8周的體質量變化Fig.1 Changes in body mass of mice treated with D-galactose for 8 weeks

2.2 體質量及體溫變化

隨著觀察時間的延長,對照組與各病原菌感染組小鼠的體質量均有所增加,其中對照組小鼠體質量增加速度最快;5種病原菌感染組小鼠體質量增加速度均低于對照組;5種病原菌感染組的小鼠體溫前3 d呈輕度上升趨勢;第1周,除肺炎克雷伯菌組小鼠體溫仍有輕度上升,其余各組小鼠體溫均呈下降趨勢;第2周各組小鼠體溫值變化不大,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組AD小鼠體質量和體溫的變化

2.3 水迷宮實驗

隨著訓練天數的增加,對照組小鼠的逃避潛伏期于第2 天輕度上升,第3～5天均表現為逐漸下降的趨勢;與第4 天相比,第5天5種病原菌低、中及高濃度感染組小鼠的逃避潛伏期時間均縮短(P<0.05,圖2);第1～5天肺炎克雷伯菌高濃度組小鼠隨著訓練天數的增加,游泳速度逐漸減慢。與對照組相比,第5天該菌高濃度組小鼠游泳速度顯著下降(P<0.01,圖3);5組病原菌中濃度感染組小鼠游泳速度整體比較,差異無統計學意義(P>0.05,圖3)。與第4天相比,第5天金黃色葡萄球菌中濃度感染組小鼠游泳速度明顯提高(P<0.01,圖3);5組病原菌低濃度感染組小鼠游泳速度比較,差異無統計學意義(P>0.05,圖3);各組小鼠120 s穿越平臺次數整體比較,差異無統計學意義(P>0.05,圖4)。

圖2 各組小鼠水迷宮實驗的平臺逃避潛伏期變化Fig.2 Water Maze experimental platform escapes incubation period

圖3 各組小鼠水迷宮實驗的游泳速度變化Fig.3 Changes in swimming speed in water maze test of mice in each group

圖4 各組小鼠水迷宮實驗120 s的穿越平臺次數Fig.4 Times of crossing the platform of each group in water maze experiment for 120 s

2.4 海馬組織學特征

HE染色結果顯示(圖5),對照組小鼠海馬CA1和CA3區海馬錐體細胞形態規則、排列整齊、細胞間隙未見明顯異常,金黃色葡萄球菌組和大腸埃希菌組小鼠海馬CA1和CA3區部分海馬錐體細胞排列紊亂、細胞間隙增寬、胞體深染,銅綠假單胞菌組和肺炎克雷伯菌組小鼠海馬CA1和CA3區海馬錐體細胞有少許顆?？张葑冃?白念珠菌組小鼠海馬CA1和CA3區見海馬錐體細胞凋亡。

圖5 各組小鼠海馬CA1和CA3區組織學特征(HE,×200)Fig.5 Histological characteristics of hippocampal CA1 and CA3 regions in each group of mice(HE,×200)

3 討論

D-半乳糖腹壁皮下注射小鼠造模是一種成熟的化學造模方法,因操作較為方便且成本較低而被廣泛應用,其原理是D-半乳糖能夠使大腦正常神經細胞的代謝功能受到抑制,從而導致小鼠癡呆[19-20]。研究顯示,D-半乳糖引起細胞代謝紊亂,是由于其所產生的代謝產物半乳糖醇能夠引起細胞代謝紊亂,產生大量的活性氧,造成多器官、多系統功能衰退[21]。此外,D-半乳糖還可以引起大腦組織炎癥因子釋放增加。本研究采用D-半乳糖[200 mg/(kg·d)]腹壁皮下注射小鼠,結果顯示注射8周后小鼠毛發脫落光澤度下降、皮膚松弛、體質量開始下降,小鼠活動情況較造模之初明顯遲緩。

本研究將臨床AD患者來源的病原菌經尾靜脈注射AD小鼠并觀察14 d后,對各組小鼠進行了水迷宮實驗,結果顯示,銅綠假單胞菌組、肺炎克雷伯菌組、金黃色葡萄球菌組及白念珠菌組小鼠逃避潛伏期較對照組有所延長,同一種病原菌感染組小鼠中有的表現為高濃度組小鼠游泳速度較對照組更慢,有的表現為低濃度組小鼠逃避潛伏期較對照組更長。潛伏期時間的長短與小鼠尾靜脈注射感染的病原菌種類有關,與病原菌的濃度無明確的相關性,提示不同類型的病原菌均能夠產生相應的毒力,從而對AD小鼠的學習記憶能力產生一定的影響。水迷宮實驗120 s時,各組AD小鼠穿越平臺次數無差異,提示病原菌感染種類的不同對AD小鼠穿越平臺的次數無影響。相關研究認為,血腦屏障中控制大分子物質進出大腦的通道由微血管內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞組成,對中樞神經系統起到一定的保護[22]。本研究結果提示,臨床AD患者來源的病原菌通過尾靜脈注射AD小鼠后,可經血腦屏障進入中樞神經系統,對小鼠的學習記憶功能產生損害。

注射病原菌菌液后觀測各組小鼠的體溫情況,結果顯示,5種病原菌感染組小鼠及對照組小鼠的體溫值均在正常范圍內波動,大腸埃希菌組小鼠的體溫值波動較大;5種病原菌感染組小鼠體質量的波動情況較對照組低1～2 g,分析可能原因是AD患者來源的病原菌可產生相應毒力及致病因子,從而引起小鼠體溫升高及飲食減少。相關研究發現,某些特定的細菌和真菌感染可引起中樞系統感染,部分細菌入侵大腦是通過穿越血腦屏障實現的[23]。感染期間,中樞神經系統的損傷引起炎癥介質的釋放和免疫系統的激活,炎癥介質可透過損傷的血腦屏障及受損的細胞膜,進一步導致大腦內氧化應激損傷,加重神經退化[24]。近些年來,AD患者中的真菌感染也受到越來越多學者的關注[25-26]。

本研究選用臨床來源的5種AD患者合并深部感染常見的病原菌。其中,白念珠菌的致病機理尚不明確;銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌,其毒力主要與鞭毛和菌毛、Ⅲ型分泌系統、群體感應系統等因素相關[27];肺炎克雷伯桿菌多與其自身存在的毒力因子及毒素密切關聯;大腸埃希菌的毒力主要是與細胞粘附、生物被膜、鐵攝取相關以及毒素類致病因子等;金黃色葡萄球菌的毒力則包括凝集因子A、胞外分泌型蛋白、血漿凝固酶及金黃色葡萄球菌腸毒素等,這些毒素可造成人體多器官損害,危及生命[28-29]。

本研究中AD模型小鼠海馬組織學結果顯示,部分病原菌感染組小鼠海馬CA1及CA3區出現錐體細胞排列紊亂和顆?？张葑冃?推測錐體細胞變性程度可能與小鼠感染病原菌的種類有關,提示不同的病原菌因各自的毒力不同,從而對海馬組織神經元細胞產生不同的影響;白念珠菌組中部分小鼠海馬錐體細胞有凋亡的表現,推測毒力越強的病原菌對小鼠海馬組織的影響更大。近年有研究提示,學習記憶功能減退與腦內神經元數目減少及神經元突觸的可塑性變化有關[30]。

本研究結果表明,病原菌血流感染可以引起AD小鼠學習記憶功能下降,可能是病原菌的毒力及致病因子加重了神經細胞損害,從而加速了AD小鼠的癡呆進程。因此,臨床上要加強對AD患者病原菌感染的預防和重視,降低患者合并感染的機會,延緩疾病進展。