組蛋白乙酰轉移酶P300和去乙?；窼IRT2在乳腺浸潤性導管癌中的表達*

段彥林, 金柔, 梅思思, 田世維, 黃玉鑫, 徐澍**

(1.貴州醫科大學附屬醫院 病理科, 貴州 貴陽 550004; 2.黔南州中醫醫院 病理科, 貴州 黔南 558000)

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥,目前我國乳腺癌的發病率有逐年上升趨勢[1]。表觀遺傳學發現,乙?；д{可導致癌癥的發生,組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙?；阜謩e催化乙?；腿ヒ阴；^程,兩者的高度動態平衡維持著正常的生理機能[2-3],組蛋白乙酰轉移酶P300是一種具有乙?；钚缘霓D錄共激活子,可乙?；喾N組蛋白和非組蛋白,P300對非組蛋白的乙?；饔每梢栽鰪娕c相應啟動子的結合,從而激活轉錄活性[4],組蛋白去乙?；窼IRT2是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸去乙?；?在生物的代謝、凋亡和基因轉錄等生命活動中起著重要作用[5]。目前關于P300和SIRT2蛋白在乳腺癌中的研究鮮有文獻報道,本研究通過免疫組化的方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中P300和SIRT2蛋白的表達情況,探討P300和SIRT2蛋白與乳腺癌臨床病理特征的關系,以發現其在乳腺癌中可能存在的發病機制,為研究乳腺癌治療新靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 隨訪病理科2012年1月1日—2017年12月31日診斷的乳腺癌患者,完善患者年齡、月經情況、腫瘤最大徑等相關臨床資料,最終選取確診前未經放化療且有足夠組織蠟塊的385例患者做為病例組,收集同期癌旁2 cm以上乳腺組織蠟塊36例作為對照組。385例乳腺癌患者齡27～84歲、平均50歲,患者隨訪時間最長者為113個月、平均隨訪時間62個月,隨訪期間無復發患者339例(88.1%)、有復發患者46例(11.9%),無轉移患者379例(98.4%)、有轉移患者6例(1.6%),生存患者358例(93%)、死亡患者27例(7%)。提取病例組病理診斷存檔切片,由兩位乳腺病理專業主任醫師根據《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2021年版)》[6],采用雙盲法對乳腺癌病理診斷和病理組織學分級進行復診,重新判讀乳腺癌分子分型。

1.1.2主要試劑 兔抗人多克隆抗體KAT3B/P300(型號ab275379)、兔抗人單克隆抗體SIRT2(型號ab19388)、HRP多聚體二抗,均購自英國Abcam公司;一抗稀釋液,PBS磷酸鹽緩沖液均購自北京中杉金橋公司;酒精、蘇木素、二甲苯、3%過氧化氫均購自貴州永博鑫公司。

1.2 研究方法

1.2.1組織芯片及免疫組化 組織蠟塊對照存檔切片中選定位置進行定位,用打孔器套出蠟塊中組織柱,選取高度相近的組織柱按編號順序,經修整、包埋制成組織芯片[7]。組織芯片經切片、烤片、脫蠟、水化后采用En Vision二步法進行免疫組化染色[8]。EDTA(pH 8.0)120 ℃高壓修復3 min,冷卻后PBS沖洗3次,每次5 min,滴加3%過氧化氫孵育30 min,PBS沖洗3次,每次3 min,滴加一抗(KAT3B/P300檢測滴度為1∶300,SIRT2檢測滴度為1∶6 000),37 ℃溫箱孵育1 h后PBS沖洗3次,每次5 min;加二抗溫箱孵育1 h,PBS沖洗后DAB顯色3 min,經蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明后封固。

1.2.2結果判讀 P300和SIRT2在胞核和(或)胞漿中出現粗顆粒狀、片狀黃色或棕黃色著色為陽性。由兩位病理醫師按雙盲法隨機選取10個高倍視野,計數1 000個上皮細胞,以染色強度(無表達為0分,點狀淡黃色為1分,粗顆粒狀和片狀黃色為2分,棕黃色為3分)和陽性細胞百分比(<1%為0分,1%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分)的乘積為免疫組化結果評分(IRS)[8]。P300:IRS≤8分為低表達,>8分為高表達[9];SIRT2:IRS≤3分為低表達,>3分為高表達[10]。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統計分析,計數資料以n(%)表示,率的比較采用χ2檢驗,相關性分析采用Spearman相關性進行檢測,運用 Kaplan-Meier和Log rank test統計學方法分析P300和SIRT2蛋白與乳腺癌預后的相關性,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P300和SIRT2蛋白在病例組及對照組中的表達

病例組中P300蛋白的低表達率高于對照組,SIRT2蛋白的低表達率低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

注：A為P300蛋白低表達,B為P300蛋白高表達,C為SIRT2蛋白高表達,D為SIRT2蛋白低表達。

表1 P300和SIRT2蛋白在病例組和對照組中的表達[n(%)]Tab.1 Expressions of P300 and SIRT2 proteins in case group and control group[n(%)]

2.2 病例組患者P300蛋白表達及其與臨床病理特征的關系

病例組組織中P300蛋白表達結果顯示:腫瘤最大徑>5 cm的低表達率明顯高于≤5 cm組(P<0.001),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的低表達率高于Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴結轉移的低表達率高于無淋巴結轉移、Ki67高表達的低表達率高于Ki67低表達,差異有統計學意義(P<0.05);P300蛋白表達在患者年齡、月經情況、組織學分級中比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。P300蛋白在LuminalB型中的低表達率高于三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 P300和SIRT2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系[n(%)]Tab.2 Relationship between P300 and SIRT2 proteins expression and clinicopathological

表3 P300蛋白表達與乳腺癌分子分型的關系[n(%)]Tab.3 Relationship between P300 protein expression and molecular subtypes of breast cancer[n(%)]

2.3 病例組患者SIRT2蛋白表達及其與臨床病理特征的關系

病例組組織中SIRT2蛋白表達結果顯示:在組織學分級3級中的低表達率低于1～2級、腫瘤最大徑>5 cm的低表達率低于≤5 cm、Ki67高表達的低表達率低于Ki67低表達,差異有統計學意義(P<0.05);SIRT2蛋白表達在患者年齡、月經情況、TNM分期和淋巴結轉移中的比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。SIRT2蛋白在LuminalA型和LuminalB型中的低表達率低于HER2陽性型和TNBC,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 SIRT2蛋白表達與乳腺癌分子分型的關系[n(%)]Tab.4 Relationship between SIRT2 protein expression and molecular subtypes of breast cancer[n(%)]

2.4 病例組P300和SIRT2蛋白表達的相關性

病例組中P300和SIRT2蛋白的表達呈負相關,差異有統計學意義(r=-1.77,P<0.001)。

2.5 病例組患者P300和SIRT2蛋白表達及其與預后的關系

應用 Kaplan-Meier和Log-rank test統計學方法,分析P300和SIRT2蛋白表達與病例組患者無病生存期(disease-frec survival,DFS)和總生存時間(overll survival,OS)的關系,結果顯示,P300蛋白低表達比高表達DFS短,總體無病生存率低,差異有統計學意義(P<0.05);SIRT2與乳腺癌患者預后無關(P>0.05)。見圖2。

圖2 P300和SIRT2蛋白乳腺癌預后的關系Fig.2 Relationship between P300 and SIRT2 protein in prognosis of breast cancer

3 討論

根據2021年國際癌癥研究機構發布的最新全球癌癥報告顯示,2020年全球185個國家新發乳腺癌2 261 419例,約占新發癌癥總數的11.7%,首次超過肺癌成為最常見的癌癥[1]。近年來,表觀遺傳學變化已公認為是導致乳腺癌進展的主要原因,表觀遺傳學中組蛋白乙?；窃诤诵慕M蛋白尾部結構域內的賴氨酸殘基末端添加乙?；糠?中和了正電荷,減少DNA和組蛋白之間的靜電吸附作用形成松弛的染色質,使轉錄因子更易與DNA結合,從而促進基因轉錄[2]。相反,組蛋白去乙?；纬闪酥旅艿娜旧|,使DNA啟動子上的轉錄蛋白不可接近而導致轉錄失活。組蛋白的乙?；磻芙M蛋白乙?；D移酶和組蛋白去乙?；缚刂?在腫瘤發生過程中,精細調節的乙?；癄顟B受損,使正常細胞的增殖、分化和凋亡發生變化,進而轉化為惡性細胞,同時通過降低細胞的粘附、促進細胞遷移、侵襲和血管生成導致癌癥的進一步發展[2]。除此之外,組蛋白去乙?；高€可以對負責細胞分化和周期調控的抑癌基因進行沉默,使細胞缺乏分化,增殖失控,從而導致腫瘤的發生[8]。組蛋白乙?；D移酶和組蛋白去乙?；副碛^遺傳調控的可逆性使其成為治療癌癥的誘人靶點[2]。

P300蛋白是由EP300基因編碼的組蛋白乙?；D移酶,可以乙?；S多組蛋白和非組蛋白,以調節與細胞生長、發育和腫瘤發生有關的許多信號通路,包括鈣信號、缺氧應激、Notch信號和NF-κB信號通路等[11]。在乳腺癌中,BRCA1是當前研究比較成熟的腫瘤抑制基因,BRCA1蛋白在細胞周期調控、DNA 損傷修復、基因轉錄激活、抑制細胞生長等方面發揮著作用[12];P53蛋白是對細胞凋亡和細胞周期調節基因起調控作用的腫瘤抑制因子,P53的激活可以促進依賴性細胞凋亡[13],P300可促進BRCA1和P53這兩個真正的腫瘤抑制因子發揮腫瘤抑制作用,使細胞周期保持正常,保證DNA受損后可以程序化凋亡[14]。在乳腺和結直腸原發性腫瘤和細胞系中,發現P300基因失活與癌癥的發生相關[15]。在口腔癌和宮頸癌細胞系中也發現P300基因突變,在引入正常的P300基因后,細胞增殖減少[16],這些研究都提示P300具有腫瘤抑制功能。在本研究中,對比癌旁組織,乳腺癌組織中P300蛋白低表達(P<0.05);P300蛋白在腫瘤直徑大、TNM分期高、有淋巴結轉移和Ki67高表達的乳腺浸潤性導管癌中低表達(P<0.05),P300蛋白低表達的乳腺癌患者DFS短(P<0.05),表明P300蛋白可能抑制乳腺乳腺浸潤性導管癌的發生、發展。

SIRT2是Sirtuins蛋白家族成員之一,Sirtuins家族參與一些重要的生理過程,如參與調節細胞代謝、增殖、凋亡、DNA損傷修復、細胞應激、基因表達調控等。SIRT2作為組蛋白去乙?；?通過使不同的底物蛋白去乙?；?發揮其生理和病理作用的重要功能。SIRT2可以使P53去乙?；?降低其轉錄活性,并導致阻斷P53依賴性凋亡以響應DNA損傷,促進細胞增殖,SIRT2基因敲除可誘導P53的積累并促進癌細胞凋亡[13]。叉頭框蛋白O3(forkhead box protein O3,FOXO3)是一種腫瘤抑制因子,參與細胞周期控制以及抗氧化和DNA損傷修復途徑,SIRT2對FOXO3的去乙?；瘜е缕浞核鼗碗S后的降解,從而促進細胞周期進展并促進癌癥的發生[17]。SIRT2可以促進線粒體代謝,抑制E-鈣蛋白途徑,從而促進癌細胞的侵襲[18];SIRT2使微管蛋白去乙?；?促進細胞運動[19];另有研究發現,SIRT2可以增強腫瘤細胞突破基底膜的能力,使腫瘤細胞獲得高侵襲能力[20];SIRT2在基底樣型乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)樣本中被擴增并高度表達,它與Slug蛋白相互作用并使其脫乙?；?并促進蛋白酶體降解Slug,從而促進癌細胞的侵襲[21];通過促進乳腺癌小鼠模型中的C-MYC泛素化和降解,抑制SIRT2也顯示出抗癌作用[22]。在以往的研究發現,SIRT2在胃癌、結直腸癌、干細胞樣腎細胞癌細胞中高表達[5]。在本研究中,與癌旁組織相比,SIRT2蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中的低表達率低(P<0.05),在組織學分級高、腫瘤直徑大和Ki67高表達組織中的低表達率低(P<0.05),表明SIRT2可能促進乳腺浸潤性導管癌的發生、發展。SIRT2在Luminal型中的低表達率,低于其在HER2陽性型和TNBC中的低表達率(P<0.05)。Luminal型乳腺癌特征是ER/PR的表達,SIRT2作為一種組蛋白去乙?；缚赡軙绊懶约に厥荏w在乳腺癌中的表達[23],進一步表明SIRT2高表達是乳腺癌發生的一個危險因素,但具體作用機制仍待更多的研究證明。P300和SIRT2作為組蛋白乙?；D移酶和去乙?；?兩者的高速動態平衡維持著細胞的正常生理功能,本實驗中SIRT2和P300呈負相關,表明兩者在乙?；瘷C制中互相拮抗,與以往研究一致。

綜上所述,P300和SIRT2蛋白可能與乳腺浸潤性導管癌的發生、發展相關,P300蛋白低表達可能提示乳腺浸潤性導管癌患者預后較差。