哮喘兒童ORMDL3基因多態性及基因與環境交互作用的分析*

段樸英, 熊妍 , 蒙文娟, 李波, 楊俊, 吳靜, 朱曉萍,***

(1.貴州醫科大學附屬醫院 兒科呼吸, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 兒科學院, 貴州 貴陽 550025; 3.六枝特區人民醫院 兒科, 貴州 六枝 553400)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種異質性疾病,其癥狀及呼氣氣流受限是可變的[1]。以氣道慢性炎癥及高反應性為特征,具有慢性、異質性和波動性特點[2]。多項研究顯示血清類黏蛋白1樣蛋白3(orosomueo id 1-like protein 3,ORMDL3)基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與兒童哮喘患病風險有關,且rs7216389位點SNP與兒童哮喘關聯性最強[3-4]?；蚺c環境的綜合作用促進兒童哮喘的發生發展[2]。發生在生命早期的基因環境相互作用尤為重要,可影響成熟的免疫系統[5]。許多危險因素,包括早期致敏、母親吸煙、早期病毒感染等,已被證明可持續影響肺功能及哮喘的發展[2]。目前,國內對ORMDL3基因與環境交互作用的研究較少。本研究旨在探討ORMDL3基因SNP與兒童哮喘患病風險及該基因與環境相互作用的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究采用病例對照研究,選取2021年7月—2022年8月就診的哮喘兒童102例為哮喘組,其中男74例、女28例,0～14歲、平均(4.57±0.22)歲,均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》的診斷標準[6]。選取同期于兒童保健門診健康體檢的無家族哮喘史及過敏史的兒童54例為對照組,其中男38例、女16例,0～14歲、平均(5.46±0.45)歲。所有入組兒童均無自身免疫性疾病及其他慢性疾病,近4周無上呼吸道感染史、全身糖皮質激素及抗過敏藥物史。收集一般資料,濕疹史、家族過敏史、被動吸煙史、分娩及喂養方式等;兩組兒童在性別、年齡構成上均差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經貴州醫科大學倫理委員會批準(2020倫審第208號),所有研究對象監護人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1血清特異性IgE檢測 選用吸入性及食物性過敏原特異性 IgE 抗體檢測試劑盒(國械注進20182402469,A211124AU/A220114AA),采用歐蒙印跡法,操作步驟嚴格按說明書進行,使用EUROLineScan軟件判讀結果。吸入性變應原:樹組合(柳樹/楊樹/榆樹)、普通豚草、艾蒿、塵螨組合(屋塵螨/粉塵螨)、屋塵、貓毛、狗上皮、蟑螂、霉菌組合(點青霉/分枝孢霉/煙曲霉/交鏈孢霉)、律草;一種及以上吸入性過敏原陽性判定為特應性陽性,對應的特異性IgE≥0.7 KU/L。

1.2.2ORMDL3基因分型 采用EDTA-K2抗凝管采集入組研究對象外周血2 mL,DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取DNA;Primer6設計引物(上海捷瑞生物公司合成),對ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位點分別進行PCR擴增,rs7216389位點上游引物為5′-CCTGCCTCCAAAAC

CTAGCA-3′,下游引物為5′-GCAGTTCTGTCGCTGTTGTT-3′,產物253 bp;rs12603332位點上游引物為5′-GCTTGAGTGTCTGGCATA-3′,下游引物為5′-CTAGGTCTACAGGAGTTGAG-3′,產物228 bp;PCR反應總體積為20 μL,其中DNA模板5 μL、2×TaqPCR預混試劑Ⅱ 10 μL、上下游引物各0.5 μL,雙蒸水4 μL。PCR反應條件均為(94 ℃、3 min預變性,94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35 個循環;最后72 ℃延伸5 min);4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠(含GeneRed核酸染料0.1 ml/L)120 V 30 min對PCR產物進行電泳,經凝膠成像儀系統(Syngene G:BOX EF2)處理后保存結果。ABI 3730型基因分析儀對產物進行測序,rs7216389、rs12603332位點測序峰圖見圖1、圖2,箭頭所指即為基因型所在位置,單峰為純合型,套峰為雜合型。

圖1 rs7216389位點測序峰Fig.1 Peak pattern of rs7216389 locus

圖2 rs12603332位點測序峰Fig.2 Peak pattern of rs12603332 locus

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件,計數資料采用n(%)描述,計量資料為非正態分布采用M(P25,P75)描述,采用χ2檢驗,對比分析組間的計數指標差異情況;Mann-WhitneyU檢驗分析組間非正態指標差異;采用logistic回歸分析ORMDL3基因與兒童哮喘患病風險的關系,Haploview軟件進行連鎖不平衡及單倍型分析,D為連鎖不平衡系數,D>0.8 為強連鎖不平衡,廣義多因子降維法(generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)進行ORMDL3基因-環境的交互分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本的Hardy-Weinberg平衡檢驗

對rs7216389、rs12603332在兩組的分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗,顯示符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),說明本次抽樣具有群體代表性。rs7216389位點對照組(P=0.084)、哮喘組(P=0.230),rs12603332位點對照組(P=0.084)、哮喘組(P=0.580)。

2.2 ORMDL3基因多態性與兒童哮喘易感性的分析

rs7216389位點等位基因頻率在兩組間的分布比較,差異無統計學意義(P>0.05);哮喘組TT基因型頻率高于對照組,TC基因型頻率高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);以CC基因型作為參照,攜帶TT、TC基因型的兒童患哮喘的風險分別是攜帶CC基因型的7.000倍(95%CI為1.372～35.711)、8.312倍(95%CI為1.555～44.446),差異有統計學意義(P<0.05);rs12603332等位基因、基因型頻率在兩組間分布比較,差異無統計學意義(P>0.05);以AA作為參照,攜帶AG基因型兒童哮喘患病風險為AA基因型兒童的4.266(95%CI為1.096～16.608),差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ORMDL3基因兩位點基因型、等位基因比較及患病風險[n(%)]Tab.1 Comparison of genotypes and alleles at two locus of ORMDL3 gene and risk to disease[n(%)]

2.3 ORMDL3基因兩位點連鎖不平衡及單倍型

ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位點D為1,r2為0.91,兩位點間為強連鎖不平衡(圖3)。TG、CA 、TA 3種單倍型在組間分布比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位點單倍型頻率比較Tab.2 Comparison of haplotype frequencies at rs7216389 and rs12603332 of ORMDL3 gene

圖3 連鎖不平衡熱圖Fig.3 Linkage disequilibrium plot

2.4 ORMDL3基因兩位點間的交互作用分析

應用GMDR分析rs7216389、rs12603332位點間的交互作用,結果顯示rs7216389、rs12603332位點交叉一致性為100%,為最佳模型,兩位點間顯著性檢驗差異有統計學意義(P<0.05),表明rs7216389、rs12603332間交互作用較強,這種交互對兒童哮喘發病風險可能具有重要影響。見表3。

表3 ORMDL3基因兩位點間的交互作用GMDR分析結果Tab.3 MDR analysis results of ORMDL3 gene interaction between two loci

2.5 ORMDL3基因與環境交互作用分析

采用GMDR分析rs7216389位點與特應性、濕疹史、家族過敏史、母乳喂養、被動吸煙、剖宮產分娩的交互作用,其中三、四、五及七階模型交叉一致性均為10/10,但七階模型檢驗樣本準確性(0.882)低于三、四、五階模型(0.946),故選三、四、五階模型為最佳模型,且其交互作用差異有統計學意義(P<0.05)。而基于GMDR樹形圖中,rs7216389位點、濕疹史、家族過敏史、特應性都分布在同一主樹杈上,有較強的交互作用,因此最佳模型為4因子模型。見圖4、表4。

表4 ORMDL3基因rs7216389位點與環境交互作用GMDR分析結果Tab.4 GMDR analysis results of ORMDL3 gene rs7216389 locus interacting with environment

圖4 rs7216389與環境交互GMDR樹形圖Fig.4 GMDR dendrogram of rs7216389 interacting with the environment

3 討論

哮喘的發病率逐年增加,造成了巨大的疾病負擔[7]。哮喘控制不佳是一個公共衛生問題,也是兒童缺課或住院的主要原因[8]。因此對兒童哮喘規范診治以減輕疾病負擔尤為重要[9]。哮喘是遺傳和環境綜合作用下的異質性疾病,基因是致敏傾向的基礎,而暴露于危險因素可能會改變哮喘的嚴重程度[10]。既往研究報道了多種危險因素與兒童哮喘之間的關聯,但本質上觀察性研究因果關系很難得到證實[11]。ORMDL3位于染色體17q21上,已有較多研究證實了ORMDL3基因SNP與兒童哮喘易感性有關,ORMDL3 基因某些位點的SNP使ORMDL3的轉錄表達增加,同時與哮喘相關的細胞因子變化有關[4]。研究發現ORMDL3主要調控內質網應激、胞內Ca2+平衡、激活未折疊蛋白反應,參與自噬、凋亡等[12]。

本研究中哮喘組ORMDL3基因rs7216389的TT、TC基因型頻率高于對照組(P<0.05),兩組間等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)。logistic回歸分析顯示TT和TC基因型兒童哮喘患病風險分別為CC基因型兒童的7.000、8.312倍;表明ORMDL3基因rs7216389位點的SNP與兒童患哮喘風險相關,rs7216389位點TT、TC基因型是兒童患哮喘的風險因子,與之前的研究一致[13-14],但與陽愛梅等[15]研究不一致,考慮與遺傳背景不同有關。雖然rs12603332等位基因、基因型頻率在兩組間分布差異均無統計學意義(P>0.05),但logistic回歸分析顯示AG基因型兒童哮喘患病風險為AA基因型的4.266倍(P<0.05),表明rs12603332位點AG基因型是兒童哮喘患病的風險因子。其等位基因、基因型頻率在兩組間分布差異無統計學意義,考慮與本研究樣本量偏小有關,增加樣本量可能提供更準確的結果,表明rs12603332位點的SNP可能與兒童哮喘易感性有關,這與Afzal等[16]研究rs12603332多態性與巴基斯坦人群哮喘易感性有關的結果一致,而與Zeinaly[17]等人在伊朗西北部阿塞拜疆人的研究結果不一致,可能的原因為不同地域其遺傳背景不同有關。

連鎖不平衡即在一條染色體中,存在著不同基因位點的等位基因的機會,是一個群體遺傳力量的敏感指標[18]。連鎖不平衡在17q基因座的 SNP 之間是非常強的[19],本研究中rs7216389與rs12603332的連鎖不平衡D′為1,顯示強連鎖不平衡,這種連鎖不平衡結構導致變異之間的高度相關性,但由于本研究樣本量偏小,可能造成連鎖不平衡被高估。單倍型即單條染色體上共存的一系列遺傳變異位點的組合[20],單倍體等位基因可能與因果變異連鎖不平衡更近,單倍型本身可能是具有重要意義的因果變異[21],本研究中TG、CA、TA 3種單倍型在兩組間分布差異無統計學意義(P>0.05),提示這3種單倍型可能與兒童哮喘易感性無關聯?；蚺c環境的交互可增加哮喘的患病風險[22]。對過敏原敏感的17%的兒童在8歲時患哮喘的風險比未致敏的人高12倍[23]。然而有研究顯示不管致敏狀態如何,出生時接觸變應性致敏與哮喘風險降低有關[24]。表明單一危險因素不足以導致哮喘,需要其他危險因素綜合作用。染色體17q21上的遺傳性多態現象被發現可以預測兒童期發作的哮喘,并且早期暴露于間接吸煙的風險進一步增加[3]。本研究中rs7216389、rs12603332兩位點存在交互作用,提示兩位點交互對兒童哮喘患病風險可能有重要影響。rs7216389與濕疹史、家族過敏史、特應性的交互作用有統計學意義,提示該位點與濕疹史、家族過敏史、特應性交互可能是兒童哮喘患病的風險因素。我們推測rs7216389位點TT或者TC基因型的易感兒童,有濕疹史、家族過敏史和(或)吸入性過敏原陽性者,患哮喘的風險可能會增加。王冰潔[25]的研究結果表明ORMDL3基因rs12603332位點與哮喘家族史、呼吸道病毒感染史極易共同增加廣東兒童患哮喘的風險。環境在調節遺傳效應中起著重要作用[26],有研究分別表明哮喘相關基因絲聚蛋白(filaggrin,FLG)與母乳喂養、變應原接觸、寵物接觸及城市居住地有交互作用,腺苷酸環化酶9(adenglyl cyclase IX,ADCY9)與變應原接觸有交互作用[27-28]。

綜上,兒童哮喘是一種多基因遺傳性疾病,其基因-環境交互作用在兒童哮喘的發生發展中發揮重要作用?；蚨鄳B性及基因-基因、基因-環境的交互分析可為兒童哮喘的早期預測、干預提供依據。