安順地區受檢婦女中高危型人乳頭瘤狀病毒的檢出及單核苷酸多態性特征 *

席敏, 李小多, 孫廣, 張海龍, 謝南子, 周琴,, 蔣紅梅, 張云東*

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院, 貴州 貴陽 550000; 2.安順市人民醫院 醫學檢驗科, 貴州 安順 561000; 3.安順市人民醫院 病理科, 貴州 安順 561000)

宮頸癌(cervical cancer, CC)是女性常見的惡性腫瘤,其發病率與死亡率在全球女性腫瘤中排名第4[1]。在中國,CC發病率在女性腫瘤中位居第2,每年約有新發病例13萬,占世界CC新發病例的28%[2]。雖然我國占全世界CC的比例有的下降,但因人口基數大、篩查普及率低,CC仍然嚴重威脅著我國女性健康[3]。CC的發生、發展與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染、多個性伴侶等因素有關[4],但其中HPV病毒感染是引起宮頸病變的最重要因子。根據致癌潛力,將HPV病毒分為高危型和低危型[5],流行病學與分子證據表明,高危型HPV(high risk HPV, HR-HPV)持續性感染是宮頸高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)及CC主要致病因素[6]。女性一生均有機會感染HPV,當免疫力低下時,機體不容易清除病毒,會造成持續性感染,從而進展為宮頸病變,導致HPV分型檢測、液基薄層細胞學(thinprep cytologic test, TCT)、陰道鏡及組織病理學活檢均可能有異常病理現象[7]。HPV感染有地域性特點,有薈萃分析顯示,我國HPV感染最常見的類型HPV16、HPV18、HPV52、HPV53及HPV58[8];Chen等[9]研究結果顯示貴州省HPV感染的類型依次為HPV52、HPV16、HPV58、HPV53及HPV39;約70%的CC由HPV16、HPV18型感染引起[10]。但在中國,CC前病變及CC中常見的類型為HPV16、HPV52及HPV58[11]。因此,HPV52和HPV58型感染在宮頸病變地位逐漸凸顯出來。流行病學研究表明,HPV病毒突變在不同的地理位置和人群不同[7, 12],HPV52型有A、B、C及D四個譜系,B譜系主要分布在亞洲,C系在美洲和亞洲相對較多,D系在亞洲和非洲較少[13]。HPV不同譜系與不同突變導致宮頸病變的風險不同,HPV52型B系與宮頸高級別病變相關[14]。HPV的E6、E7區是主要的致癌因子,目前研究主要集中于HPV16和HPV18型E6、E7區核苷酸多態性,HPV52、HPV58主要分布于中國[15],但目前關于HPV52和HPV58型E6、E7區單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)情況研究較少。本研究通過分析貴州省安順地區HPV流行病學特征及HPV52、HPV58型的E6、E7區的SNP,以期為本地區HPV的感染防治、高級別宮頸病變篩查與診斷及針對性的疫苗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1標本來源 選取2020年6月—2021年12月醫院門診、住院及體檢患者中行HPV分型檢測者,要求采樣前24 h無性生活、非月經期及采樣前3 d未沖洗陰道與陰道內用藥。共納入檢測者10 774例,年齡15～86歲、平均(41±10.94)歲,取所有受檢者宮頸脫落細胞作為細胞標本來源,取其中HR-HPV陽性且有組織病理學活檢指征的298例受檢者的宮頸組織為組織標本來源。本研究獲得醫院倫理委員會批準(〔2022〕專6號)。

1.1.2主要試劑與儀器 HR-HPV分型核酸測定試劑盒(深圳亞能生物有限公司);實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司),HPV雜交儀(深圳亞能生物有限公司),干式金屬浴恒溫器(西安天隆科技有限公司),漩渦振蕩器(江蘇康健醫療用品有限公司),高速離心機(美國Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1HPV DNA提取 專業婦科醫生使用專用樣本刷取所有檢測者宮頸脫落細胞,保存于專用細胞保存液樣本管中,標本采集后保存于2～8 ℃,24 h內完成檢測。使用漩渦振蕩器充分震蕩搖勻標本細胞保存液,使宮頸脫落細胞充分混勻于細胞保存液中,一次性吸管吸取液體0.5 mL轉移至 1.5 mL EP 管中,13 000 r/min離心10 min;吸掉上清液,沉淀物中加 HPV-DNA裂解液50 μL,充分混勻,100 ℃金屬浴10 min;13 000 r/min離心10 min,保留上清液待用。

1.2.2聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增 HPV反應試劑取出恢復室溫,取出PCR擴增試劑,900 r/min離心10 s,移液槍轉移至PCR儀配套的8聯管中,做好標記,加HPV DNA上清液5 μL,每次實驗各設置1個陰性質控與陽性質控,900 r/min離心10 s,進行PCR擴增。擴增條件設置:50 ℃ 15 min、 95 ℃ 10 min、 94 ℃ 30 s 、42 ℃ 90 s、 72 ℃ 30 s ,72 ℃ 5 min ,共循環40次。

1.2.3變性、雜交及結果判讀變性 95 ℃預變性10 min,轉入冰水混合物中放置5 min,置于2～8 ℃冰箱中備用。擴增產物變性之后在按照HPV雜交儀標準操作程序完成,基本步驟:雜交→洗膜→孵育→搖洗→洗膜→顯色→判讀。陰性對照膜條的內標(internal control,IC)出現藍色斑點,陽性對照膜條在相應HPV基因型位點與IC點均出現藍色斑點,以及標本對應的每一張膜條IC位點出現藍色斑點,表明本次實驗有效?？蓹z測17種高危型:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73及HPV82;6種低危型:HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV81、HPV83。

1.2.4組織病理學活檢 取HR-HPV陽性且有組織病理學活檢指征受檢者的宮頸組織標本進行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,HE)。閱片由2位中級以上臨床病理醫師共同閱片,按照2014年WHO女性生殖系統腫瘤標準分為正?；蚵匝装Y、子宮頸低級別鱗狀上皮內瘤變[low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL,即原宮頸上皮內瘤變1(cervical intraepithelial neoplasia,CIN1)]、HSIL(原CIN2 和部分 CIN3)及 CC(鱗癌、腺癌)[16]。

1.2.5基因測序 取“1.2.1”項下已提取好的HPV52、HPV58型DNA,低溫冰凍運輸至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。使用 Snapgene 將測序獲得的 HPV52、HPV58型單一陽性樣本E6基因和 E7基因序列與HPV52、HPV58 參考序列(HPV52 GenBank 登錄號NC_001592;HPV58 GenBank 登錄號 D90400.1)進行比對,分析序列突變情況與氨基酸變異情況。采用 MEGA11軟件的 Align by ClustalW 對本研究中獲得的 E6/E7 基因變異組序列與 HPV52 E6/E7變異譜系的參考基因組序列進行比對,參數設置為默認值。HPV52參考基因組序列:A1為X74481,A2為HQ537739,B1為HQ537740,B2為HQ537743,C1為HQ537744,C2為HQ537746,D為HQ537748[17]。HPV58型參考基因組序列:A1為D90400.1;A2為:HQ537752,A3為HQ537758,B1為537762,B2為537764,C為537774,D1為537768,D2為537770[17]。鄰接法構建系統發育樹,參數設置選擇 Kimura2-parameter 模型,Bootstrap 值為1 000,其他參數設置為默認值。PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線預測氨基酸序列二級結構。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0對數據進行統計分析,計數資料用例數(百分比)[n(%)]表示。

2 結果

2.1 HR-HPV感染的一般特點

HPV分型檢測患者中HR-HPV感染陽性2 194例,陽性率為20.36%(2194/10774);以單一感染為主(14.0%,1509/10774),混合感染占6.36%(685/10774);HR-HPV感染亞型分布結果顯示(圖1),由高到低依次為HPV52(6.11%)、HPV16(3.59%)、HPV58(3.04%)、HPV53(2.31%)及HPV51(1.95%)。

圖1 HPV分型檢測者的HR-HPV亞型分布Fig.1 HR-HPV subtype distribution of HPV typed tester

2.2 HR-HPV感染的年齡特點

HR-HPV分型檢測者中年齡≤20歲組HR-HPV感染陽性率最高(36.36%),其次是年齡>61歲組(32.30%)。見表1。

表1 HPV分型檢測者中HR-HPV感染分布的年齡特點Tab.1 Age characteristics of the distribution of HR-HPV infection in HPV testing

2.3 HR-HPV感染的宮頸病變類型特點

選取同時行HPV分型檢測與組織病理活檢的檢測者298例,宮頸病變中HR-HPV陽性最多的為HPV16型94例(CC 46例、HSIL 43例及LSIL6例),依次為HPV52型49例(CC 8例、HSIL 33例及LSIL8例)、HPV58型34例(CC 5例、HSIL 23例及LSIL3例)及HPV18型18例(CC 8例、HSIL 9例及LSIL8例)。見表2。

表2 HPV分型檢測者中 HR-HPV感染的宮頸病變類型特點Tab.2 Characteristics of cervical lesion types of HR-HPV infection in HPV typing subjects

2.4 HPV52型E6、E7區的基因序列分析

根據測序結果,與 HPV52 型參考序列(NC_001592)比對結果顯示,HPV52 E6/E7 基因突變率為 100.00%(30/30)。根據 E6/E7 基因序列突變差異性分組,30條序列被分為 6 個不同的變異組(52AS01～52AS06),52AS01基因突變組分布頻數最高66.67%(20/30),其次是52AS02基因突變組20%(6/30)。E6基因共有7個單核苷酸突變,A125T、A294G是新的突變位點,A294T(M65G)、A378G、置前(K93G)、A379G(K93R)是非同義突變,其余突變位點是同義突變,突變位點最高的是G350T、A379G,突變率為100.00%(30/30);E7基因共有3個單核苷酸突變,均為同義突變,其中突變頻率最高的位點是C751T、A801G ,突變率為100.00%(30/30),T666C是一種新的突變。E6、E7序列氨基酸二級結構未發生突變。見表3。

表3 HPV52 E6/E7 核苷酸突變及氨基酸二級結構預測分析Tab.3 Analysis of HPV52 E6/E7 nucleotide mutations and amino acid secondary structure prediction

2.5 HPV58型 E6、E7區基因序列分析

根據測序結果,與 HPV58型 參考序列(D90400.1)比對結果顯示,有6例HPV58型序列未發生突變,HPV58 E6/E7 基因突變率為 72.72%(16/22)。根據 HPV58型E6/E7 基因序列突變差異性分組,22條序列被分為 7 個不同的變異組(58AS01～58AS06),58AS01基因突變組分布頻數最高37.5%(6/16),其次是58AS02基因突變組18.75%(3/16)。E6基因共有3個單核苷酸突變,C321T、A388C是非同義突變,突變位點最高的是C307T,突變率為62.5%(10/16);E7基因共有8個單核苷酸突變,C632T、G694A、G760A、G761A、T803C、G806A為非同義突變,其中突變頻率最高的位點是T744G突變率為81.25%(13/16),其次是G694A、G761A突變率為37.5%(6/16)。E6、E7序列氨基酸二級結構未發生改變。見表4。

表4 HPV58 E6/E7 核苷酸突變分析及氨基酸二級結構預測分析Tab.4 Analysis of HPV58 E6/E7 nucleotide mutations and predicted amino acid secondary structure

2.6 系統進化樹

基因序列系統發育樹結果表明(圖2),安順地區 HPV52型 E6/E7 基因突變序列均分布于B譜系,未檢測到 A、C及D譜系;安順地區 HPV58 型E6/E7 基因突變序列均分布于A譜系,未檢測到 B、C 及D譜系。

注：圓點表示HPV52、HPV58突變不同序列,其余為相應不同的參考序列。

3 討論

CC的發生發展是由CC前病變逐漸演變而來,由癌前病變發展大約10年時間,這個時間窗為早期篩查和臨床干預提供了黃金時機[18]。約99%的CC合并HR-HPV感染[19]。大量隊列研究已證實,HPV-DNA分型檢測是用于細胞學階段主要的篩查手段[20]。

本研究結果顯示,本地區HR-HPV感染以單一感染為主,感染陽性率20.36%,較本省HPV感染率15.37%偏高[9]?？赡芘c本研究納入的人群主要是門診患者有關。HPV感染頻數依次為 HPV52、HPV16、HPV58、HPV53及HPV51,與本省的HPV感染優勢型別HPV52、HPV16、HPV58、HPV53、HPV59基本一致[9],提示本地區CC疫苗接種應以覆蓋這幾型為主。HR-HPV感染年齡感染呈U字形分布,陽性率最高的為≤20歲組,可能與該年齡免疫系統尚未完全建立,以及性生活過早導致一過性感染;其次>60歲組,可能與該階段患者免疫能力下降,對HPV病毒清除能力下降?？紤]該年齡階段免疫狀況,所以該年齡階段女性需要加強篩查。

本地區檢測者HR-HPV基因型主要是HPV16、HPV52、HPV58及HPV18型。HPV16型是宮頸病變的最主要致病亞型,HPV52、HPV58型是宮頸病變中次之的優勢型別,這與貴陽地區其他研究結果基本一致[21]。王麗等[22]也報道HPV16、HPV52、HPV58型感染與宮頸病變密切相關。美國陰道鏡病理學會建議,HPV16、HPV18型陽性者直接轉入陰道鏡檢查,而HPV52、HPV58型陽性者結合TCT檢查異常時,被建議轉入陰道鏡檢查并取組織活檢進行病理診斷,因此,對于HPV52、HPV58型既是本地區感染的優勢型別同時又是宮頸病變的危險型別,建議本地區HPV52、HPV58型感染人群應作為重點關注人群,加強篩查管理,避免漏診及延緩診斷。

HPV16、HPV18型是已經明確了的CC的主要致病因子,因此,本研究只選取安順地區流行的HPV52和HPV58型病例樣本進行E6/E7基因測序,期望找到其在本地區致癌力強的原因。結果顯示,HPV52型E6區的A125T、A294G 是新發現的突變,最常見的突變A379G(K93R)是非同義突變,其K93R與宮頸高級別病變有關[23-24],而E7區的T666C也是一個新發現的突變位點。HPV58型的E6、E7區均未發現新的突變位點,但是其突變的頻率較高,16例發現突變位點,共發現11個核苷酸突變位點。其中HPV58型在E7區,非同義突變C632T(T20I)/G760A(G63S)會導致較高風險患CC[25]。HPV基因突變序列有地域性差異,本地區HPV52型突變序列均屬于B2系,未發現A、C、D系,HPV58型基因序列均分布于A系,亦有研究表明,與A系相比,B系會增加罹患CC的風險[26]。因此,本地區HPV52和HPV58型導致CC風險較高,可能與本地區HPV52、HPV58 E6/E7區單核苷酸突變有關。

本研究HPV52、HPV58型基因測序樣本量少,雖不能完全代表本地區SNP與流行株的譜系分布,但能一定程度上體現本地區HPV基因多態性,后續研究中還需要收集大量樣本進行測序,為本地區的HPV感染防治和CC的預防提供幫助。