QuEChERS-超高效液相串聯質譜法同時測定蜂蜜中硝基咪唑類藥物殘留

劉蘭霞 解迎雙 寇宗紅 王波

為了治療和預防孢子蟲病在蜜蜂群體間的傳播，降低蜜蜂的死亡率，硝基咪唑類藥物曾被廣泛應用于蜜蜂養殖過程中。但硝基咪唑類藥物的違用、濫用和誤用現象導致蜜蜂體內產生藥物殘留，并以蜂蜜為媒介進入人體，對人體造成致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性損害，因此各國已相繼禁止硝基咪唑類藥物在動物源性食品中的使用。

目前，檢測硝基咪唑類藥物殘留的方法主要有氣相色譜質譜法、液相色譜法等。本研究建立了QuEChERS-超高效液相串聯質譜法，以檢測蜂蜜中多種硝基咪唑類藥物的殘留，對維護食品安全、保障消費者身體健康具有重要意義。

一、儀器與方法

1.儀器與設備。高效液相色譜儀，美國沃特世公司；多管渦旋振蕩器，深圳逗點生物技術有限公司；低溫冷凍高速離心機，德國Sigma公司。

2.試劑與材料。甲醇、乙腈、甲酸、氨水（色譜純），德國默克公司；丙基乙二胺（PSA）粉末、十八烷基鍵合硅膠（C18）粉末、石墨化炭黑（GCB）粉末，美國安捷倫公司；無水硫酸鎂、無水氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；超純水，本實驗室純水儀制備；32種硝基咪唑類化合物（純度＞99%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；蜂蜜，購自當地農貿市場或超市，于-20℃冷凍保存，待用。

3.標準溶液配置。（1）標準儲備液（濃度100mg/L）。精密稱取32種硝基咪唑類化合物0.01g，用甲醇溶解后，定容至100mL容量瓶內，配制成質量濃度為100mg/L的單標準儲備溶液，置于-20℃冰箱中保存6個月。

（2）混合標準工作液（濃度1mg/L）。精密量取濃度為100mg/L的上述標準溶液100μL于100mL容量瓶中，用甲醇-水（8∶2）定容，于4℃保存。

4.樣品前處理。（1）提取。準確稱取5.00g（精確至0.01g）蜂蜜樣品于50mL具塞離心管中，加入5mL水，渦旋5min，使其充分混勻。加入10mL 0.1%氨水-乙腈，渦旋提取5min，超聲提取10min。加入2g氯化鈉渦旋1min，加入4g無水硫酸鎂渦旋3min，于4℃、12000r/min離心5min。準確移取上清液5.00mL于另一15mL離心管中，于30℃氮氣吹濃縮至近干，待復溶，凈化。

（2）凈化。加入1.00mL乙腈復溶，依次加入50mg PSA、50mg C18、150mg MgSO4渦旋混合1min，以12000r/min離心5min，取上清液于30℃下氮氣吹至近干，加入1.00mL 80%甲醇-水溶液復溶，渦旋混合1min，過0.22μm濾膜于進樣瓶中，上機檢測。

5.儀器條件。（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（100mm×2.1mm 2.7μm）；柱溫：25℃；流速：0.2mL/min；進樣量：5μL；流動相：A為甲醇溶液，B為水溶液；梯度洗脫程序：0-5min（5%-10% A），5-20min（10%-40% A），20-25min（40%-90% A），25-26min（90%-5% A），26-30min（5% A）。

（2）質譜測定條件。離子源：ESI源；采集模式：正離子模式；掃描方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：3.2kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流速：500L/Hr；錐孔氣流速：50L/Hr；碰撞氣（氮氣）流速：10μL/min；其他MRM參數見表1。

二、結果與討論

1.樣品提取方式的選擇。本實驗在考察了稱取樣品后，采用了直接加提取試劑提取、用水溶解后再提取試劑兩種方法對蜂蜜樣品進行預處理。結果表明：采用第一種方法，硝基咪唑類化合物的回收率較低，在45%-60%；第二種方法的回收率較高，為70%-110%。

2.提取溶劑的選擇。本實驗考察了乙酸乙酯、0.1%乙酸乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.1%氨水乙腈（V/V）4種提取溶劑的提取效果，見圖1。根據圖1可知，選用乙酸乙酯作提取溶劑時，后期鹽析效果較差，會影響實驗的回收率，甲硝唑、哌莫硝唑、帕硝唑、卡硝唑、非昔硝唑的回收率均小于40%；選用0.1%乙酸乙腈作為提取溶劑時，帕硝唑、非昔硝唑的回收率小于30%；選用0.1%甲酸乙腈作為提取溶劑時，哌莫硝唑、帕硝唑、特尼噠唑、非昔硝唑的回收率均小于20%，米索硝唑的回收率高達140%；選用0.1%氨水乙腈作為提取溶劑時，硝基咪唑類化合物的回收率在71.90%-105%，符合方法學考察的要求，因此本研究選擇0.1%氨水乙腈作為提取溶劑。

3.提取條件的選擇與優化。本實驗采用超聲提取法、渦旋法、超聲提取法與渦旋法組合提取三種方式進行對比實驗。實驗條件分別為：超聲提?。?min、10min、15min；渦旋：3min、5min、10min；超聲與渦旋組合方式：5+3min、5+5min、5+10min、10+3min、10+5min、10+10min、15+3min、15+5min、15+10min。以硝基咪唑類化合物的回收率為指標，選擇最優實驗方案，實驗結果見圖2。根據圖2可知，單一的超聲、渦旋提取方式下硝基咪唑類化合物的回收率均小于組合式。在超聲+渦旋的組合方式中，蜂蜜在超聲5min時易產生大量泡沫，會影響下一步實驗的準確性及最終結果的回收率；隨著超聲時間的增加，泡沫會逐漸減少。最后以渦旋5min、超聲提取10min為組合的提取方式為最優實驗方案，硝基咪唑類化合物的回收率在72%-110%。

三、結論

本實驗通過對色譜柱、流動相等色譜條件進行優化，以0.1%氨水乙腈為提取溶劑，采用渦旋震蕩-超聲聯合提取法進行提取，使用PSA、C18、GCB、MgSO4進行凈化，建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS法，同時檢測了蜂蜜中多種硝基咪唑類藥物的殘留。該方法簡單、快速、準確，靈敏度高、準確性好，有效降低了目標化合物的基質干擾，增加了同時檢測硝基咪唑類原藥的數量，可為蜂蜜樣品的質量評價研究提供理論基礎。

基金項目：甘肅省市場監督管理局科技計劃項目：“基于機器學習算法對靖遠羊肉元素的分析及風險評估模型的建立”（SSCJG-SP-A202306）。

作者簡介：劉蘭霞（1968-），女，漢族，甘肅白銀人，大學本科，研究方向為食品安全檢測。

*通信作者：王波（1982-），男，漢族，甘肅隴南人，博士，研究方向為食品安全檢測和藥物學分析。