慢病毒介導長鏈非編碼RNA XLOC_015548基因編輯的C2C12細胞模型建立

翁鑒，齊天天，魏懿浩，于斐

骨骼肌是生物體內含量最豐富的組織之一，主要負責運動的維持、形態的維持和分泌功能的執行[1-2]。骨骼肌肉的正常結構和功能完整性依賴于神經的支配，肌細胞內正常的神經傳導和神經沖動，以及肌細胞內正常的代謝過程[3-4]。越來越多的證據表明，骨骼肌受損或發育不良與多種機體的疾病狀態有關，包括失神經肌萎縮、癌變惡疾、內分泌代謝系統疾病等[5-8]。骨骼肌的形成是一個多步驟及復雜的過程，包括募集生肌前體、細胞增殖、細胞融合、肌管分化等[9-11]。目前的研究認為，在骨骼肌中存在多種非編碼RNA，包括長度超過 200 bp 的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA），參與成肌調控的過程[12-13]。在細胞質和細胞核中，研究者們相繼發現了LincMD1、LincYAM1、LncMUNC、LncMyoD及LncMg 等成肌分化相關的特異性調節因子，并且通過體內體外實驗，驗證了其對于肌源性標志物的影響[14-17]。這些研究結果預示著，LncRNA 在機體的成肌過程中發揮著重要作用。

圖1 感染不同滴度XLOC_015548基因慢病毒的C2C12細胞

本研究團隊的前期利用小鼠的周圍神經損傷后失神經腓腸肌萎縮模型，結合RNA-seq 技術，分析了骨骼肌萎縮過程轉錄組中LncRNA 的生物學作用。根據表達差異及表達豐度，共發現73 個LncRNA 在肌萎縮過程中具有統計學差異。其中，XLOC_015548（Lnc000280）在測序結果中表現出理想的表達豐度及最顯著的表達差異[18]。因此，猜測XLOC_015548可能是肌萎縮相關的靶點之一。

慢病毒載體是一類對多種細胞均有感染能力的病毒載體，在細胞實驗中應用廣泛。這類病毒能夠穩定地將目的基因整合到細胞的基因序列中，從而構建子代細胞，能夠穩定地表達目的基因。綜上所述，鑒于LncRNA 在成肌調控中的重要作用，結合前期工作中通過RNA-seq 技術得到的結果，本研究將通過慢病毒載體技術在體外誘導XLOC_015548感染C2C12 成肌細胞，構建能穩定遺傳XLOC_015548 的成肌細胞模型，為進一步探究XLOC_015548 對失神經肌萎縮等骨科相關疾病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 設計

體外細胞學實驗，樣本之間采用獨立樣本t檢驗分析。

1.2 時間和地點

實驗于2021年11月至2022年3月在北京大學深圳醫院中心實驗室、北京大學深圳醫院骨科生物材料國家地方聯合工程研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗細胞

小鼠成肌細胞系C2C12 購自中國武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3.2 主要試劑

慢病毒載體由上海漢恒生物科技有限公司構建；總RNA 提取試劑盒購于中國貝貝生物科技有限公司；引物及測序由上海漢恒生物科技有限公司及廣州銳博生物科技有限公司提供及完成；Myogenin抗體、GFP 抗體購于Abcam 公司；Vinculin 抗體、Myod 抗體購于菲恩生物公司；β-actin 抗體購于abclonel 公司；DMEM 培養基、胎牛血清、0.25% Trypsin-EDTA 購于Gibco 公司；Millex-HV 0.45 μm PVDF filters 購于美國Millipore 有限公司；cDNA 逆轉錄試劑盒、SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ購于Takara 公司；蛋白裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購于碧云天生物科技有限公司；ECL 超敏型化學發光底物試劑盒購于中國北京白鯊生物科技有限公司。

1.3.3 主要儀器

離心機購自德國艾本德生命科學公司；共聚焦顯微鏡TCS SP8購自德國徠卡微系統有限公司；電泳儀購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；凝膠化學發光成像系統購自上海勤翔科學儀器有限公司；實時熒光定量PCR 儀購自美國賽默飛公司；生物安全柜購自新加坡藝思高科技有限公司；CO2培養箱購自上海力申科學儀器有限公司。羅氏480 實時定量PCR系統購自上海凱來儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 C2C12細胞的培養

將小鼠成肌細胞系C2C12（普諾賽生命科技有限公司，武漢，中國）進行常規復蘇，接種于10 cm 培養皿中。細胞的增殖培養條件為體積分數10%胎牛血清+1%鏈霉素、青霉素+DMEM 的完全培養基，并將細胞置于37℃、體積分數5%的CO2細胞培養箱中，每隔48 h 更換新鮮培養基，待細胞增殖融合度達到80%左右時，按照1∶3 的比例傳代。傳代后的C2C12細胞按照上述培養條件繼續增殖培養。

1.4.2 XLOC_015548 過表達及敲低慢病毒載體系統的構建及轉染

根據XLOC_015548 的基因序列[18]設計慢病毒。使用pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO 干擾載體，構建病毒載體HBLV-m-Lnc000280-shRNA1-ZsGreen-PURO。 使 用 pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro 載體，構建HBLV-m-Lnc000280-Null-ZsGreen-PURO 過表達載體。使用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ兩個限制性內切酶位點，引物退火后合成雙鏈DNA，使用T4DNA連接酶將雙酶切載體和退火后的雙鏈DNA轉化入感受態細胞。同時利用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）鑒定陽性克隆。質粒經測序提取，鑒定合格后用于后續實驗。轉染293T細胞5 d，在熒光顯微鏡下觀察各病毒稀釋液中的熒光細胞。收集包裝好的慢病毒顆粒，其測定滴度（TU/mL）=細胞數×陽性克隆百分比×感染復數×病毒稀釋倍數×103。將C2C12 細胞分為陰性對照組、XLOC_015548敲低組、陽性對照組、XLOC_015548過表達組。然后分別以1、2、5、10、20、30 的感染復數（multiplicity of infection, MOI）轉染。孵育12～24 h后，更換新鮮增殖培養基，培養72 h后進行第一次傳代，并加入2 mg/mL嘌呤霉素進行篩選穩定轉染株。培養72 h后，在熒光顯微鏡下照相并采集細胞，進行后續實驗。

1.4.3 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的觀察

為了分析XLOC_015548過表達及敲低慢病毒載體系統是否能夠成功轉染靶細胞，使用熒光顯微鏡觀察慢病毒轉染24～96 h的GFP的表達。

1.4.4 RNA提取及實時熒光定量RT-qPCR

在慢病毒處理細胞3 d 后收集細胞，使用RL solution（貝貝生物科技有限公司，河北，中國），依照說明書中的實驗流程提取總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒（Takara，遼寧，中國）對1 μg RNA進行逆轉錄。將合成后的cDNA以1∶5的稀釋度進行稀釋，再應用快速實時聚合酶鏈反應系統進行實時RT-qPCR。根據制造商的說明，使用SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ（Takara，遼寧，中國）及使用羅氏480 實時定量PCR系統測定RNA 的相對豐度。使用以下溫度設置：95℃ 持續30 s，然后95℃和60℃ 分別進行40 次循環，每次循環5 s和30 s。在10 μL反應混合物中進行每個實時PCR反應，用于實時PCR的引物見表1。以GAPDH 作為內參基因，用2-ΔΔCt法計算基因相對mRNA表達水平。

表1 PCR引物

1.4.5 蛋白質免疫印跡分析

在慢病毒處理細胞3 d 后，使用蛋白裂解緩沖液RIPA（碧云天生物技術有限公司，上海，中國）、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑進行裂解，經超聲波震蕩并在12 000g和4 ℃下離心30 min 后收集上清液，使用BCA 法進行蛋白質定量。按照35 μg 蛋白進行電泳上樣，經10% SDS-PAG 電泳后轉PVDF 膜。用TBST配置的5% BSA 低速搖床封閉45～90 min，放入GFP抗體（Abcam，ab290，1∶1 000）、Myod 抗體（FINE Biotech，FNab05511，1∶2 000）、Myogenin 抗體（Abcam，ab124800，1∶1 000）或Vinculin 抗體（FINE Biotech，FNab09799，1∶1 000）中4℃過夜孵育。將一抗孵育后的膜與辣根過氧化物酶偶合的二抗孵育1 h，用TBST 洗凈。用ECL 超敏型化學發光底物試劑盒檢測蛋白質條帶（中國北京白鯊生物科技有限公司）。以β-actin 或Vinculin 作為內參基因，目的蛋白的灰度值表示目的蛋白的表達量。

1.5 統計學方法

使用SPSS 21.0 軟件進行統計分析，使用Graphpad Prism 9.0 進行圖片制作。所有數據均以均值±標準差表示，并通過t檢驗進行比較。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 XLOC_015548基因相關慢病毒感染條件篩選

為了選用合適的MOI，分別以1、2、5、10、20、30的MOI 為條件對C2C12 成肌細胞進行轉染。以敲低空載對照組為例，不同的MOI感染細胞后，在熒光倒置顯微鏡下，每組細胞都有不同強度的綠色熒光表達。按照說明書提示，轉染72 h后，不同感染條件的細胞呈現最明顯的綠色熒光（圖1）。當MOI為20及30時，綠色熒光的表達水平相當，且較其他組數量更多（圖2）。因此，本研究用于后續實驗的感染條件為MOI=20。

圖2 感染不同滴度XLOC_015548基因慢病毒的C2C12細胞的感染效率統計圖

2.2 XLOC_015548基因編輯細胞模型成功構建

為了確認轉染是否成功，在慢病毒轉染72 h 后，評估GFP 水平。敲低空載對照組、XLOC_015548 敲低慢病毒組、過表達空載對照組、XLOC_015548過表達慢病毒組在熒光倒置顯微鏡觀察下均可見明顯綠色熒光（圖3A～3D），敲低組和過表達組之間的綠色熒光相對強度比較，差異無統計學意義（圖3E）。Western Blot 實驗中，各組均有GFP 的表達（圖4A），GFP 的蛋白表達量差異無統計學意義（圖4B）。此外，進行RT-qPCR 用以評估XLOC_015548 以及肌源性分化因子Myod的mRNA 表達水平，與各自對照組相比，XLOC_015548 敲低慢病毒組中細胞mRNA 表達量較低，XLOC_015548 過表達慢病毒組中細胞RNA 表達量較高（P＜0.05，圖5）。肌源性分化因子Myod 的mRNA 表達量的變化趨勢與XLOC_015548升高及降低趨勢一致，差異具有統計學意義（P＜0.05）。同時，Western Blot 用以評估肌源性分化因子Myod、Myogenin 蛋白表達水平，與各自對照組相比，XLOC_015548 敲低慢病毒組中Myod、Myogenin 蛋白表達量下降，XLOC_015548 過表達慢病毒組中Myod、Myogenin 蛋白表達量，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖6）?；谝陨嫌^察，本研究驗證了靶基因成功轉染到C2C12 成肌細胞中，并且初步驗證了肌源性分化因子Myod、Myogenin 表達與XLOC_015548具有相關性。

圖3 感染復數為20的XLOC_015548基因慢病毒的C2C12細胞

圖4 慢病毒載體綠色熒光蛋白表達水平

圖5 細胞中XLOC_015548和Myod的RNA表達水平

圖6 細胞中Myod和Myogenin的蛋白表達水平

3 討論

在骨骼肌萎縮相關疾病中，以去神經化肌肉為例，損傷神經末梢的靶肌會發生結構、生化、生理等方面的變化，造成肌質的流失，最終導致肌細胞的凋亡和肌肉的萎縮。隨著時間的推移，由于肌纖維壞死，結締組織增生，同時肌細胞再生能力衰竭，肌細胞數量大量流失，使神經末梢肌肉對再生運動軸突失去接受能力[19-20]。在本研究的前期工作中，通過RNA-seq 檢測分析失神經化后的小鼠萎縮腓腸肌。在這一過程中，73 個LncRNA 檢測到差異表達。其中，發現了一種在萎縮腓腸肌中的下調的長鏈非編碼RNA XLOC_015548（Lnc000280）。目前尚無報道XLOC_015548 的相關研究，為了后續實驗進一步探索XLOC_015548 在肌萎縮過程的作用，本研究利用慢病毒載體技術，在C2C12 成肌細胞系中構建XLOC_015548相關基因編輯細胞模型。

目前已有多項研究證實，在骨骼肌中存在多種非編碼RNA，包括長度超過200 bp 的LncRNA，參與成肌調控的過程，對肌肉發育中起到重要作用[12-13]。細胞質中的Linc-MD1 是第一個被發現可用于正性調節成肌分化的肌肉特異性LncRNA[14]。而與YY1相關的Linc-YAM1 是一個被證實為重要的負性調控肌生成的長鏈非編碼RNA，其可存在于肌原細胞的細胞核和細胞質[15]。在C2C12 肌細胞和肌管內的YAM1 敲除可導致多個肌原性標記物的增加，下調YAM1 可以克服轉錄因子YY1 對肌原分化的抑制作用[16]。其他的LncRNA，例如MUNC，可作為肌生成的正調控因子，通過不同的機制調控成肌分化，直接增強了內源性肌分化因子Myod、Myogenin、Myh3 基因的表達[21]。同樣，位于MYOD1 基因上游的LncMyod 也可促進肌生成及肌分化[22]。這些發現預示著，LncRNA 在機體的成肌過程中發揮著重要作用。綜上所述，鑒于LncRNA在成肌調控中的重要作用，或許可以利用LncRNA 調控肌源性調節因子，以達到存留肌肉、改善肌萎縮程度的目的。

本研究中，通過轉染XLOC_015548 的敲低及過表達慢病毒進入成肌細胞C2C12 中，第一次成功構建出XLOC_015548基因編輯細胞模型。PCR和測序結果表明，敲低和過表達的病毒載體中的序列與目的序列保持一致，并且成功地插入了該載體。感染病毒后，可在熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體所表達的綠色熒光，感染條件為MOI=20，同時利用嘌呤霉素2 mg/mL 進行篩選，結果發現轉染后細胞形態良好，生長良好，可供后續實驗研究使用。

本研究也存在著諸多局限性與不足，首先僅從細胞生物學上通過觀察熒光表達以及RT-qPCR 檢測XLOC_015548 的RNA 含量來確定轉染成功，而沒有收集各組別細胞再次通過測序及基因克隆來驗證XLOC_015548 在細胞內的轉染效率和情況。其次，所使用的細胞為C2C12 成肌細胞系，與原代肌細胞存在差異。除此之外，對于肌源性分化因子與XLOC_015548 相關性探索，也僅使用RT-qPCR 來驗證。而且，基因研究不但需要細胞實驗，未來還將構造動物模型，配合動物實驗提高說服力。因此，后續需要通過更多的分子生物學的方法，在本研究所構造的細胞模型中去驗證XLOC_015548與其他成肌分化相關因子的相關性和探索二者之間存在機制。

4 結論

綜上所述，本研究構建出LncRNA XLOC_015548 基因慢病毒，并成功感染C2C12 成肌細胞，檢測細胞中XLOC_015548 及肌源性分化因子Myod、Myogenin 的mRNA 及蛋白表達量。未來，將利用所構建出的XLOC_015548 基因編輯細胞模型，通過進一步細胞實驗，探索其在成肌分化中的作用，為以后進一步探究XLOC_015548對失神經肌萎縮等骨科相關疾病提供初步實驗基礎。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突