??不同遺傳背景的轉Cry1C基因玉米品系的室內抗蟲性鑒定

曾強 周偉 郭歡樂 曹鐘洋 彭明 周虹 湯彬 陳志輝

摘要：以轉Cry1C基因的轉基因玉米C492為供體，通過回交轉育的方式將目標基因分別導入不同遺傳背景的玉米自交系，獲得轉基因玉米自交系C492/N-76、C492/N202、C492/S273、C492/DH1901和C492/DH1904，采用室內離體組織生測的方法研究各品系對玉米螟和草地貪夜蛾的抗蟲性。結果表明：轉基因玉米C492和5個不同遺傳背景自交系均表現出高抗玉米螟，雖對草地貪夜蛾的抗性有一定差異，但接蟲6 d后幼蟲死亡率均達到80%以上。這說明轉基因玉米C492和5個不同遺傳背景自交系可用于抗蟲轉基因玉米新品種培育，具有較好的商業化應用前景。

關鍵詞：轉基因玉米；亞洲玉米螟；草地貪夜蛾；回交轉育；室內生測

中圖分類號：S513.034.3文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2024）02-0001-05

Insect Resistance Identification of Transgenic Maize with Cry1C Gene from

Different Genetic Backgrounds in Laboratory

ZENG Qiang1，ZHOU Wei2，GUO Huan-le1，CAO Zhong-yang1，PENG Ming1，

ZHOU Hong1，TANG Bin1，CHEN Zhi-hui1

（1. Hunan Crop Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. Agriculture and Rural Bureau of Wangcheng District，?Changsha 410203， PRC）

Abstract： The transgenic maize C492 carrying the Cry1C gene was used as the donor， and the target gene was introduced into inbred lines of maize with different genetic backgrounds by backcross breeding. The inbred lines of transgenic maize， namely C492/N-76， C492/N202， C492/S273， C492/DH1901， and C492/DH1904 were obtained. The insect resistance of the inbred lines to Ostrinia furnacalis and Spodoptera frugiperda was studied through in vitro tissue bioassay in the laboratory. The results show that transgenic maize C492 and the five inbred lines with different genetic backgrounds are highly resistant to O. furnacalis. Although there is a difference in their resistance to S. frugiperda， a larval mortality rate of over 80% can be achieved after insect infestation for six days. This indicates that transgenic maize C492 and the five inbred lines with different genetic backgrounds can be used for the breeding of new insect-resistant transgenic maize varieties and have good prospects for commercial application.

Key words： transgenic maize; Ostrinia furnacalis; Spodoptera frugiperda; backcross breeding; bioassay in laboratory

玉米作為我國三大糧食作物之一，是當今世界重要的糧食作物，也是飼料工業和畜牧業的重要原料，玉米產業健康發展對于保障我國糧食安全以及農產品有效供給意義重大[1]。蟲害是影響玉米產量和品質的主要因素，有效防治害蟲取食是實現玉米穩產增產的重要環節。玉米螟是玉米生長發育過程中的主要害蟲，在心葉期和穗期的危害較大，初孵幼蟲爬入心葉為害，葉片展開后，形成排孔，造成“花葉”，而穗期的初孵幼蟲主要蛀食莖稈、穗軸、雄穗，形成“隧道”，破壞植株養分和水分的運輸，使莖稈容易折斷或倒伏[2]。草地貪夜蛾作為世界性的重大農業害蟲，具有食性雜、食量大、暴發性和遷飛性等特點，其低齡幼蟲啃食玉米葉片可造成“窗孔”形癥狀，高齡幼蟲還可為害葉片、雄穗和果穗等部位，甚至造成玉米植株死亡。草地貪夜蛾2019年1月首次入侵我國，隨后迅速擴散至20多個省份[3]，2022年我國草地貪夜蛾的發生面積達到4 000萬hm2。

利用轉基因技術培育具有抗蟲性狀的玉米被認為是控制害蟲的有效途徑[4]，既可減少人工成本，又可降低對環境的影響，更重要的是，對非靶標生物的風險降低[5]。Cry1C蛋白作為有效的Bt（Bacillus thuringiensis）轉基因蛋白之一，其蛋白質的表達量和抗蟲性呈正相關，但在不同回交轉育品系中Bt蛋白的表達量同時受到多種因素的影響，例如：外源基因啟動子的選擇、密碼子偏好性選擇、基因在基因組中的插入位置以及回交受體的遺傳背景等[6]。因此，研究不同遺傳背景下Bt轉基因抗蟲效果的穩定性，對轉Bt抗蟲基因作物的推廣和應用具有重要意義。

筆者以轉Cry1C基因玉米C492及其回交轉育獲得的5個轉基因玉米自交系為試驗材料，采用室內玉米離體組織生測的方法研究其對玉米螟和草地貪夜蛾的抗蟲效果，以期為抗蟲轉基因玉米新品種選育和抗蟲防治提供可利用的種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米品種：轉Cry1C基因的抗蟲轉基因玉米C492（綜31背景），完成回交轉育的轉基因玉米自交系C492/N-76（PA亞群）、C492/N202（PB亞群）、C492/S273（蘇灣亞群）、C492/DH1901（溫熱種質）和C492/DH1904（溫熱種質），非轉基因對照玉米為綜31（自330亞群）。所有試驗材料均由湖南省作物研究所玉米研究室培育和保存。

試蟲材料：亞洲玉米螟和草地貪夜蛾的蟲卵均購買自浩康生物科技有限公司。蟲卵置于人工氣候箱（28℃）孵化。所有初孵幼蟲作為供試蟲源用于室內玉米離體組織生測試驗。

1.2 試驗設計

所有試驗材料均種植于湖南省作物研究所轉基因育種溫室大棚，分小區種植，隨機排列，每個自交系種植4行，行長為5 m，株距為0.2 m，行距為0.6 m。2023年4月25日播種，一次性施用宜施壯玉米配方肥（N–P2O5–K2O=24–7–7）750 kg/hm2作為底肥，其他管理同當地大田生產。

1.3 室內抗蟲性鑒定

取生長至5～8葉期玉米植株地上部分帶回室內，取幼嫩心葉，用消毒剪刀剪成2～3 cm大小，放在24孔細胞培養板中，用毛筆輕挑玉米螟和草地貪夜蛾初孵幼蟲放于接蟲板中，每孔接1頭初孵幼蟲。每塊板為1次重復，每個處理設重復4次。接蟲后將培養板放置在溫度為28℃，光周期為16 h光照、8 h黑暗，相對濕度為70%～80% 的人工氣候培養箱中培養。隔天更換相同來源的新鮮組織，6 d后記錄死亡幼蟲數，并進行拍照。以蟲體癱軟發黑，不能移動判為死亡。死亡率=死亡幼蟲數/總幼蟲數×100%。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2010軟件進行數據匯總，利用SPSS 17.0軟件進行方差分析，使用最小顯著差異（Least Significant Difference，LSD）方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同轉基因玉米品種對玉米螟的抗性差異

為了比較轉基因抗蟲玉米C492及其回交轉育獲得的5個轉基因玉米自交系對玉米螟抗性的差異，取5～8葉期玉米心葉進行室內玉米螟抗蟲性鑒定，接蟲6 d后統計玉米螟死亡情況。室內玉米離體組織生測結果（圖1）表明，Bt基因在不同遺傳背景下對玉米螟的抗性存在顯著差異，但是轉基因玉米C492和5個轉基因自交系均表現出高殺蟲活性，供試玉米螟死亡率均在90%以上。

其中，C492，C492/DH1904，C492/S273，C492/N-76

在接蟲后第6天玉米螟死亡率都達到100%，蟲子體型較小且均已死亡，葉片未見明顯損傷（圖2B）；而非轉基因對照玉米綜31上玉米螟死亡率低于10%，蟲子體型明顯增加且可正?；顒?，葉片明顯被咬食（圖2A）。

2.2 不同轉基因玉米品種對草地貪夜蛾的抗性差異

進一步比較轉基因抗蟲玉米C492及其回交轉育獲得的5個轉基因玉米自交系對草地貪夜蛾抗性的差異，取5～8葉期玉米心葉進行室內草地貪夜蛾抗蟲性鑒定，接蟲6 d后統計草地貪夜蛾死亡情況。室內玉米離體組織生測結果（圖3）表明，Bt基因在不同遺傳背景下對草地貪夜蛾的抗性存在顯著差異，但是轉基因玉米C492和5個自交系均表現出較高殺蟲活性，供試草地貪夜蛾死亡率均在80%以上。

其中，C492，C492/N202，C492/N-76的草地貪夜蛾死亡率在接蟲后第6天都達到了90%以上，

葉片上的蟲體大小相對較小，葉片未見明顯損傷（圖4B），而C492/DH1901和C492/DH1904對草地貪夜蛾的抗性相對較差；非轉基因對照玉米綜31上草地貪夜蛾死亡率均低于15%，葉片啃食嚴重，幾乎完全被啃食（圖4A）。

3 小結與討論

隨著生物工程技術的不斷發展，轉基因抗蟲玉米商業化種植為控制害蟲危害和延緩害蟲抗性提供了新的技術途徑[7]。自1996年開始，轉基因抗蟲玉米開始大規模商業化種植，目前已有200個以上具有抗蟲性狀的轉基因玉米轉化事件被批準商業化生產[8]。在轉基因玉米產業化過程中，回交轉育是導入目標基因最主要方法，因此，優良的轉化體及其回交轉育育成的新材料都極為可貴。外源基因在不同回交轉育材料中是否能夠穩定表達，仍然需要對不同轉化體和回交轉育材料進行表型鑒定，積累更多更可靠的數據，為轉基因玉米產業化的安全應用提供參考。Venkatesh等[9]分別將抗蟲玉米 MON 89034、抗旱玉米 MON 87460、耐草甘膦玉米NK603回交轉育至6個玉米自交系，通過全基因組序列分析發現不同自交系與受體親本基因型相似性為93.7%～99.35%。由此可見，通過回交轉育的方法可以在導入供體親本目標基因的同時保持其他遺傳背景與受體親本基因型基本一致。該研究將轉Cry1C基因的抗蟲轉基因玉米C492回交轉育到5個不同遺傳背景的自交系，這些材料適合研究不同遺傳背景對Bt基因抗蟲效果的影響。

轉基因抗蟲玉米的目標性狀是否突出，能否在大田生產中對靶標害蟲產生殺蟲毒性，是評價其育種利用價值和商業化前景的關鍵。研究表明，Bt蛋白對鱗翅目害蟲具有較高的殺蟲毒性，美國孟山都公司育成的第一代Bt轉基因玉米Mon810對歐洲玉米螟和亞洲玉米螟表現出較高的田間抗蟲性[10]。張爽等[11]研究表明，轉基因玉米CM8101心葉、雌穗尖、雄穗、花絲及籽粒對玉米螟均表現出較高的抗性，各組織飼喂3 d后，玉米螟死亡率均達75%以上。

對已有抗蟲基因進行改造，可以提高殺蟲毒性、延緩害蟲抗性。李國平等[12]研究發現，Cry1Ab、Cry1F、Vip3A和Cry2Ab蛋白對草地貪夜蛾都表現出明顯的致死作用。張丹丹等[13]發現，草地貪夜蛾取食轉Cry1Ab+Vip3Aa基因的玉米后，矯正死亡率為53.02%～100%。該研究以轉Cry1C基因的抗蟲轉基因玉米C492為供體，通過回交轉育將抗蟲基因導入5個不同遺傳背景的自交系中，發現C492及其5個自交系均對玉米螟表現為高抗，飼喂6 d后玉米螟死亡率均達到90%以上，對草地貪夜蛾也表現出較高的抗性，飼喂6 d后草地貪夜蛾死亡率為80.21%～92.71%，說明Cry1C基因在不同遺傳背景的自交系中均能穩定遺傳和表達，但是不同轉Cry1C基因的自交系對玉米螟和草地貪夜蛾的抗性存在顯著差異。作為轉基因育種中間材料的C492/N-76和C492/N202均對玉米螟和草地貪夜蛾表現出良好的控制效果，為后續抗蟲轉基因玉米新品種選育提供了重要基礎材料，將有助于穩步、有序推進湖南省轉基因玉米產業化研究的進程。

參考文獻：

[1] 崔愛民，張久剛，張虎，等. 我國玉米生產現狀及發展變革[J]. 中國農業科技導報，2020，22（7）：10-19.

[2] 王月琴. 亞洲玉米螟對不同Bt毒素的抗性演化規律研究[D]. 北京：中國農業大學，2018.

[3] 徐國力，王澤宇，王奎，等. 蘇云金芽胞桿菌防治草地貪夜蛾的研究和應用進展 [J/OL]. 中國生物防治學報， https：//kns.cnki.net/kcms2/article/abstract？v=1fhXvtqifPK6MpAN1Nn-tgzwqcrY7gd_elxgf5wf0JLKCfcz0OMV9xWKIYti39BhveNIBCXmAom_c1FgXZVWN0-L98PNFxUXfEd7ijklXkO6hw4ysIXbSA==&uniplatform=NZKPT，2023-12-25.

[4] 李鵬程，張明俊，王銀曉，等. 轉基因玉米HGK60在不同遺傳背景下抗蟲性鑒定及農藝性狀分析[J]. 生物技術通報，2023，39（1）：40-47.

[5] DIVELY G P，VENUGOPAL P D，BEAN D，et al. Regional pest suppression associated with widespread Bt maize adoption benefits vegetable growers[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2018，115（13）：3320-3325.

[6] 盧美貞，崔海瑞，姚艷玲，等. 影響蘇云金芽孢桿菌基因在轉基因植物中表達的因素[J]. 細胞生物學雜志，2005（5）：509-513.

[7] 梁晉剛，張旭冬，畢研哲，等. 轉基因抗蟲玉米發展現狀與展

望[J]. 中國生物工程雜志，2021，41（6）：98-104.

[8] 賈倩，鄭懷國，趙靜娟. 全球轉基因抗蟲玉米專利布局及對我國的發展建議[J]. 世界科技研究與發展，2023，45（5）：647-660.

[9] VENKATESH T V，COOK K，LIU B，et al. Compositional differences between near-isogenic GM and conventional maize hybrids are associated with backcrossing practices in conventional breeding[J]. Plant Biotechnology Journal，2015，13（2）：200-210.

[10] 王冬妍，王振營，何康來，等. Bt玉米殺蟲蛋白含量的時空表達及對亞洲玉米螟的殺蟲效果[J]. 中國農業科學，2004，37（8）：1155-1159.

[11] 張爽，魯鑫，張嘉月，等. 轉Cry1Ab-Ma基因玉米CM8101對亞洲玉米螟抗性研究[J]. 玉米科學，2020，28（1）：59-64.

[12] 李國平，姬婷婕，孫小旭，等. 入侵云南草地貪夜蛾種群對5種常用Bt蛋白的敏感性評價[J]. 植物保護，2019，45（3）：15-20.

[13] 張丹丹，吳孔明. 國產Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米

對草地貪夜蛾的抗性測定[J]. 植物保護，2019，45（4）：54-60.

（責任編輯：張煥裕）