?山銀花中酚類物質提取工藝優化及其成分初鑒?

高煒 李浪 余蓮芳 丁慧娟 丁勝華

摘要： 以自然干燥山銀花為原料，采用超聲波輔助乙醇溶劑提取法，通過單因素試驗，結合響應面對山銀花多酚的提取工藝進行優化，并用超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）基于植物廣泛靶向數據庫對其多酚物質進行定性定量初鑒。結果表明，山銀花總酚提取量的最佳工藝條件為：料（g）液（mL）比10∶1，乙醇濃度57%，超聲功率70 W，提取溫度60℃，提取時間11 min，此條件下山銀花總酚提取量為71.08 mg/g；山銀花酚酸以綠原酸同分異構體為主，黃酮以川陳皮素、木犀草苷和香葉木苷為主。

關鍵詞： 山銀花；總酚；超高效液相色譜串聯質譜；響應面法；酚類物質

中圖分類號：R282.71; R284.1文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2024）02-0074-07

Optimization of Extraction Process and Preliminary Component Identification of Phenolic Substances from Lonicerae flos

GAO Wei1，LI Lang2，YU Lian-fang3，DING Hui-juan3，DING Sheng-hua1

（1. Agricultural Product Processing Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 2. Yueyang Academy of Agricultural Sciences， Yueyang Branch Center of New Plant Varieties Testing of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Yueyang 414000， PRC; 3. Yueyang Inspection and Testing Center， Yueyang 414000， PRC）

Abstract： The natural dry Lonicerae flos was used as raw material. Ultrasonic-assisted ethanol solvent extraction method was adopted to optimize the extraction process of polyphenols from Lonicerae flos through a single factor experiment combined with the response surface method， and UPLC-MS/MS was utilized to conduct a preliminary qualitative and quantitative identification of its phenolic substances based on the plant's extensive target database. The results show that the optimal process conditions for the extraction of total phenols from Lonicerae flos are as follows： solid-liquid ratio of 10∶1 g/mL， ethanol concentration of 57%， ultrasonic power of 70 W， extraction temperature at 60°C， and extraction time of 11 min. The amount of extracted total phenols from Lonicerae flos is 71.08 mg/g; the phenolic acid of Lonicerae flos is mainly chlorogenic acid isomers， and the flavonoids are mainly tangerine， luteolin， and diosmin.

Key words： Lonicerae flos; total phenols; UPLC-MS/MS; response surface method; phenolic substances

根據2020年版《中國藥典》，山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花。湖南山銀花主栽品種為灰氈毛忍冬，其花呈棒狀而稍彎曲，花梗集結成簇，花冠裂片，外觀黃色或黃綠色，又名五彩山銀花。山銀花主要含有酚酸、黃酮類等化合物[1]，已有研究表明酚類物質具有抗菌[2]、抗氧化[3-4]、提高免疫力等作用[5]。因此，山銀花被用作藥材，具有清熱解毒、疏散風熱等功效[6-7]。湖南隆回是山銀花種植、加工和集散地，實現了道地藥材產業融合，打造了“湘九味”藥材品牌。

目前，國內外專家對山銀花中總黃酮、總酚酸、綠原酸進行了深入研究，如Duan等[8]研究了萃取法對山銀花酚酸提取率的影響；Yang等[9]研究了近紅外光譜監測山銀花提取過程中成分的變化；史穎珠等[10]建立了山銀花中5種黃酮苷液相色譜/質譜檢測法，Wu [11]、劉秀敏[12]和郝夢超[13]等結合微波或超聲波等輔助提取，可高效提取山銀花中活性成分。同時，劉欣等[14]還研究分析了水提法、醇提法、酶解法、超聲波法和微波法等提取山銀花中綠原酸的差異，綜合評價了不同提取方法的優劣，認為超聲波法提取率高，處理時間短，比微波提取法更為普遍。同時，山銀花的提取工藝研究多集中對單一對象指標的優化、抗氧化能力評價、不同產地山銀花成分含量對比、檢測方法的建立，未對山銀花提取物成分組成進行深入研究。如李潔等[15]優化了山銀花總酚酸提取工藝為：提取時間50 min，固液比1∶50，超聲波功率300 W，綠原酸提取率達到88.8 mg/g；周峰等[16]初步鑒定山銀花甲醇提取物中有機酸和皂苷類成分可能是山銀花具抗炎、抗氧化活性的主要物質基礎。肖作為等[17]研究了不同產地山銀花中綠原酸、總黃酮的提取工藝為：提取溫度65℃，超聲提取30 min，綠原酸用60％乙醇溶液，料液比1∶20提取，總黃酮用60％甲醇溶液，料液比1∶10提??；Zhang等[18]采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜篩選鑒定了山銀花中綠原酸；史穎珠等[19]采用液相色譜-串聯質譜法建立了山銀花中14種黃酮類化合物的測定方法?？偡影怂蟹宇愇镔|，植物廣泛靶向代謝組學數據庫也是近年許多學者關注的熱點，該數據庫整理建立了超過5 800種酚類物質的檢測、鑒定的質譜參數。然而，基于植物廣泛靶向數據庫對山銀花多酚物質的研究鮮有報道。因此，筆者對山銀花總酚提取工藝進行響應面法優化，并基于UPLC-MS/MS和植物廣泛靶向數據庫對其多酚物質進行定性定量初鑒，以其為高值化利用山銀花活性物提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山銀花原材料：購自湖南隆回縣小沙江鎮。甲醇、乙腈（色譜純）：美國默克（Merck）公司；無水乙醇（分析純）：鄭州派尼化學試劑廠；Folin酚：合肥博美生物有限公司；無水碳酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機：FW-100型，北京市永光明醫療儀器有限公司；數控超聲波清洗器：KQ-700DE型，昆山市超聲儀器有限公司；Avanti J-26XP冷凍離心機：美國Beckman公司； UV-1800紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；ExionLC? AD型超高效液相色譜串聯質譜儀（配電噴霧離子源ESI）：美國SCIEX公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取液的制備 將去雜后的山銀花自然晾干，在粉碎機中粉碎過60目篩收集樣品。精確稱取樣品1.0 g于50 mL離心管，按料液比加入適量濃度的乙醇，在固定提取時間內，控制好提取溫度，在一定功率的超聲波輔助下提取，離心收集上清液。重復提取2次，合并上清液后，再用60%乙醇定容至50 mL，渦旋離心，0.22 μm濾膜過濾，用于總酚的測定。取提取液200 μL，加入200 μL 60%乙醇內標提取液，渦旋離心，0.22 μm濾膜過濾，用于酚類物質檢測。

1.3.2 總酚的測定 總酚：采用Folin-Ciocalteus[20]法。取提取液0.4 mL，加入2 mL稀釋10倍的Folin酚試劑后混合均勻，5 min后加入10%的碳酸鈉溶液3 mL，混合均勻常溫放置1 h，于765 nm處測定吸光值，以60%乙醇為對照。樣品中的總酚提取量以每克干重含沒食子酸當量表示（mg/g）。

1.3.3 單因素試驗 按1.3.1試驗操作，分別對影響超聲波輔助提取山銀花總酚過程中的5個因素料液比、乙醇濃度、超聲功率、提取溫度和時間進行單因素試驗，具體見表1。

1.3.4 響應面試驗設計 在5 種單因素試驗基礎上，以料液比、乙醇濃度、超聲功率和提取時間為自變因素，進行四因素三水平L9（34）的正交試驗，結合Design-Expert軟件中Box-Behnken中心組合試驗設計原理，得出山銀花總酚提取量的最佳工藝條件，響應面試驗因素水平見表2。

1.3.5 酚類物質的測定 基于植物廣泛靶向數據庫鑒定和定量的新集成方法測定[21-22]。色譜參數：色譜柱：Agilent SB-C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm；流動相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；梯度洗脫程序（見表3）；流速0.35 mL/min；柱溫40℃；進樣量2 μL。質譜參數：離子源：電噴霧離子源（ESI）溫度500℃；掃描模式：正負離子掃描；監測方式：多反應監測（MRM）；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負離子模式）；去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進一步優化，完成各個MRM離子對的DP和CE。

1.4 數據統計與處理

采用Excel 軟件統計分析試驗數據，計算標準偏差。單因素顯著性分析，采用t檢驗，當P＜0.05時，表示差異顯著，最后用Origin 8軟件作圖。響應面試驗設計，采用Design Expert V 8.0.6軟件處理分析數據；對回歸方程進行顯著性分析，*表示顯著（P＜0.05），**表示極顯著（P＜0.01），***表示高度顯著（P＜0.000 1）。

2 結果與分析

2.1 單因素對山銀花總酚提取量的影響

由圖1可知，當單因素變量料（g）液（mL）比10∶1，提取時間10 min，乙醇濃度60%，超聲功率70 W，提取溫度60℃時，山銀花總酚提取量均最高，分別為66.66、70.28、67.64、65.85、66.59 mg/g。料液比、提取時間或乙醇濃度低于或高于其條件時，總酚提取量均呈現顯著性下降趨勢，直至趨于穩定。這說明溶劑用量過少、提取時間短、乙醇濃度低不利于總酚充分溶解，過多溶劑用量、提取時間長、乙醇濃度高可能會提取出雜質，破壞總酚物質結構、降低總酚濃度，從而影響總酚的提取[7-8，15]。設備超聲功率限值100 W，在低于功率70 W時總酚提取量呈現顯著性提高，高于功率70 W時總酚提取量變化不顯著，可能是超聲輔助提取總酚既有增加樣品與溶劑接觸的正作用，又有破壞總酚物質結構的負作用[6-7]。設備溫度限值80℃，在低于50℃時總酚提取量呈現極顯著性提高，高于50℃時總酚提取量變化不顯著。有研究表明物質的溶解度與溫度呈正相關，在達到一定溫度后，溶解度趨于穩定[17]；再有設備控溫不精準，僅單因素試驗結果60℃作為總酚提取量的最佳工藝條件。

2.2 響應面試驗設計結果、顯著性及交互作用分析

通過表4中的總酚提取量進行響應面回歸分析，可知回歸方程：Y= 71.989+0.931A-0.301B+0.172C+0.564D+2.705AB+0.317AC+1.969AD-0.364BC-1.814BD-0.194CD-3.22A2-0.783B2-2.029C2-3.033D2。

對回歸方程進行顯著性分析（見表5），得出此回歸方程P＜0.000 1，高度顯著，失擬P值為0.792 7＞

0.05，不顯著。且該模型總決定系數R2=0.995 6，調整決定系數R2adj=0.991 2。綜上結果，說明了該模型擬合度好，誤差小，可以用此回歸方程對試驗數據進行分析和預測。由F值可知，各因素對總酚提取量的影響依次為：A＞D＞B＞C。由表5還可得出，模型中因素A、D均為高度顯著，因素B為極顯著，因素C為顯著，且二次項AB、AD、BD、A2、B2、C2、D2均為高度顯著；BC為極顯著；AC為顯著。這說明各個因素對總酚提取量的影響并非簡單的線性關系[15]。

從圖2中響應面圖可以明顯看出兩兩因素交互作用對總酚提取量的顯著性影響。其中AB、AD和BD響應曲面向下彎曲程度大、坡度陡，BC和AC次之，表明兩兩因素交互作用對總酚提取量的影響比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；CD兩兩因素交互作用對總酚提取量的影響比較差異無統計學意義（P＞0.05），這與周珠法[23]研究分析的交互作用顯著性一致。

結合Design-Expert 12 軟件分析結果與實驗室條件驗證最佳工藝條件如下：料液比10∶1（mL/g），乙醇濃度57%，超聲功率70 W，提取時間11 min，結果表明山銀花總酚提取量平均為71.08 mg/g，與理論值72.14 mg/g相對誤差為1.47%<5%，說明構建的模型是有效的。

2.3 山銀花酚類物質初步鑒定

圖3A為負離子模式下混樣質控樣品質譜分析總離子流圖，圖3B為正離子模式下多物質提取的離子流譜圖，共檢測到775個酚酸和黃酮類物質，物質鑒定匹配得分為0.7分以上有195個，取相對含量峰面積前24個物質信息列出（見表5）。從表5可以得出，異綠原酸B、隱綠原酸、綠原酸、新綠原酸、川陳皮素 、木犀草苷、香葉木苷、咖啡酸、桔皮素、異綠原酸C等提取物與宋偉峰等[24]、Cai 等[25]、Zhang等[18]、Zhang [26]和史穎珠等[10]研究中綠原酸、異綠原酸、新綠原酸、木犀草苷、咖啡酸等成分基本一致。該次相對含量峰面積不能決定物質含量高低，與物質響應強度、儀器參數等因素有關，還與提取中酚類物質本身代謝能力的差異性有關，但都可以說明其是山銀花提取的主要成分[21，27]。利用響應面法優化，超聲輔助提取山銀花多酚酸、黃酮類物質與吳寒秋[27]和姚桃女[1]等研究的提取方法和檢測成分結果相當，山銀花提取液中酚酸以綠原酸同分異構體為主，黃酮以川陳皮素、木犀草苷和香葉木苷為主；二咖啡?；Р菟岬忍崛∥锱cZhao等[28]鑒定山銀花中成分構成同分異構體；其他物質成分初鑒結果及相對含量的差異可能與基于植物廣泛靶向數據庫的不同而略有不同[29]。同時研究結果也表明，山銀花提取物在負離子模式下掃描監視比正離子模式要更有廣泛靶向性。

3 結論

通過單因素試驗，結合響應面優化山銀花多酚的提取工藝，最佳工藝條件如下：料液比10∶1 （mL/g），

乙醇濃度57%，提取溫度60℃，超聲功率70 W，提取時間11 min，結果表明山銀花總酚提取量平均為71.08 mg/g，與理論值相對誤差為1.47%<5%，說明構建的模型是有效的。UPLC-MS/MS定性定量初鑒共檢測到775個酚酸和黃酮類物質，物質鑒定匹配得分為0.7分以上有195個，主要是異綠原酸B、二咖啡?；Р菟?、隱綠原酸、綠原酸、棕矢車菊素-7-O-葡萄糖苷、鳶尾甲苷A、新綠原酸、5，7，4'-三羥基-6，8-二甲氧基異黃酮-7-O-半乳糖苷、高車前素-7-O-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-半乳糖苷、甲基山柰酚-3-O-葡萄糖苷、川陳皮素 、木犀草苷、香葉木苷、鄰苯二甲酸酐、咖啡酸、4，5-二咖啡?？鼘幩峒柞?、桔皮素、異綠原酸C、苜蓿素-7-O-新橙皮糖苷、依蘭酚酸、洋薊酸、香葉木素-7-O-新橘皮糖苷、3'，4'，5'，5，7-五甲氧基黃酮等物質。同時研究結果也表明，山銀花提取物在負離子模式下掃描監視比正離子模式要更有廣泛靶向性，這也為進一步高值化利用山銀花提了供理論依據。

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（責任編輯：張煥裕）