調控絲素蛋白膜的力學性能研究進展

劉海宇 梁文安 王葉元 胡豆豆 孫京臣

Research progress in regulating the mechanical properties of silk fibroin films

摘要：作為一種潛在的生物材料，以絲素蛋白制備的膜材料越來越多地應用到生物醫學領域。絲素蛋白膜的力學性能是一個重要的表征參數，對其后續的體外體內應用有較大的影響。本文先簡述絲素蛋白的多級結構與力學性能的關系；然后總結制備工藝對絲素蛋白膜力學性能的影響，闡述不同的處理方式對絲素蛋白膜微觀結構的影響及由此所致的力學性能的變化。絲素蛋白膜的制備工藝包括絲素蛋白溶液的制備（先脫膠再溶解絲素）、成膜工藝（按結構形式分為致密膜、多孔膜和多層膜），以及成膜后處理（有機溶劑浸泡、水蒸氣退火和外力作用）等。此外，討論復合絲素蛋白膜中不同改性方法導致的結構變化與力學性能的關系。最后，展望絲素蛋白膜材料的發展趨勢，為不同需求下的絲素蛋白膜的發展提供借鑒和參考。

關鍵詞：絲素蛋白；薄膜；力學性能；調控方法；復合材料；“結構性能”關系

中圖分類號：TS102.54;TB324

文獻標志碼：A

文章編號：10017003（2024）04005012

DOI：10.3969j.issn.1001-7003.2024.04.007

收稿日期：20230706;

修回日期：20240309

基金項目：廣州市基礎研究計劃基礎與應用基礎研究項目（SL2023A04J00039）

作者簡介：劉海宇（2001），女，碩士研究生，研究方向為蠶絲仿生材料。通信作者：胡豆豆，副教授， ddhu@scau.edu.cn。

早在五千多年前，桑蠶絲就已被人們用于制成織品。19世紀20年代，研究人員使用ZnCl2、Mg（NO3）2和磷酸成功將絲素纖維溶解，至19世紀30年代出現Na2CO3脫膠法及LiBr溶解法［1］。絲素蛋白溶液的出現打破了蠶絲只能以纖維形式應用的限制，拓寬了蠶絲的應用范圍。絲素蛋白憑借其良好的生物相容性、可控降解性等特性已成為生物醫用材料中的有力競爭者，在藥物遞送［2］、組織工程［3］、柔性材料［4］等應用中極富發展潛力。

絲素蛋白材料的形式多樣，相較于其他形式，絲素蛋白膜制備與表征簡單、研究廣泛。其中，絲素蛋白膜主要通過溶液澆鑄法或旋轉涂布法制得［5-6］。然而，與天然桑蠶絲相比，絲素蛋白材料的力學性能往往較差。通過溶液澆鑄法制備的純絲素蛋白膜拉伸強度和斷裂伸長率都較小，因其脆性而缺乏實際應用的可能［5］。通過旋轉涂布法或逐步沉積法制備的納米級超薄膜極限拉伸強度優異，但是其彈性較差［7］。這樣的力學性能無論是要求柔而韌的創傷敷料或是要求具備一定支撐能力的人工耳膜中都不適用。

絲素蛋白材料的力學性能具有結構依賴性。改變加工方法能調控絲素蛋白的結構［8］。因此，通過改變加工方法調控絲素蛋白材料的結構，使其力學性能得到改善具有現實可能性。力學性能的可調控性使絲素蛋白材料靈活多變，可適于不同應用場景。

本文首先介紹絲素蛋白的結構及影響力學性能的結構參數，然后總結絲素蛋白膜制備條件對力學性能的影響及其作用機制。在膜制備工藝的部分，討論了從溶液制備到成膜后處理中各種方法對力學性能的影響；在復合絲素蛋白膜制備的部分，討論了混合、增塑或交聯處理對其力學性能的變化及變化機理。最后，對絲素蛋白膜的力學性能改善方法和應用進行了展望。

1? 絲素蛋白的結構及其與力學性能的關系

1.1? 絲素蛋白的結構

絲素纖維由蠶繭脫膠而得，約占蠶絲蛋白總量70%。絲素纖維被溶解后，絲素蛋白的氨基酸組成和序列不會改變。絲素蛋白的重鏈基因編碼5 263個氨基酸殘基，其中包括甘氨酸（45.9%）、丙氨酸（30.3%）、絲氨酸（12.1%）、酪氨酸（5.3%）、纈氨酸（1.8%）及15種其他氨基酸（4.7%）［9］。重鏈的氨基酸序列可分為N端頭部和C端尾部，相間排列的12個疏水的重復序列和11個親水的非重復序列，如圖1［8］所示。

絲素蛋白重鏈的氨基酸序列為形成規整的二級結構和聚集態結構奠定基礎。絲素蛋白二級結構的構象主要有四種：無規卷曲、α螺旋、β折疊和β轉角。重復序列中，甘氨酸與某些氨基酸逐個交替連接成六肽，通過分子間或分子內的相互作用力形成反平行β折疊。其中，丙氨酸在β折疊的一側形成疏水面。絲氨酸的存在可使相鄰β折疊間的結合更緊密，增加結晶區的硬度和強度［10］。重復序列中的甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸四肽形成β轉角，打斷結晶性。親水的非重復序列中含有帶電荷基團或帶大側鏈基團的氨基酸殘基，不能形成β折疊，但其中的脯氨酸可形成環狀結構，促進反平行β折疊形成。

絲素蛋白的聚集態結構主要分為Silk I和Silk II。Silk I中包括α螺旋及其他非β折疊結構，不穩定且易溶于水。在固態核磁共振法研究中，Silk I被認為是II型β轉角結構［11］。β轉角中央的兩個氨基酸殘基能與水形成氫鍵，因此Silk I的親水性好。Silk II主要為反平行β折疊結構，反平行β折疊能量上處于最低狀態，穩定且不溶于水。

Qiu等［8］提出的絲蛋白材料五級介觀多級結構認為絲素蛋白各級形成關系為：在重復序列中每6個氨基酸為一個β股（一級結構）；β股間以氫鍵相互作用維持穩定的β折疊（二級結構）；β折疊間以疏水相互作用和范德華力連接，形成β微晶（三級結構）；β微晶通過無定形鏈連接形成納米微纖（四級結構）；納米微纖間相互作用纏結形成納米微纖網絡（五級結構），如圖2所示。

納米微纖實際上由交叉-β構象構成，是廣義上的Silk II。通常認為絲素蛋白材料的強度和剛度由Silk II決定，而延展性和柔韌性由Silk I控制。在納米微纖中，β微晶作為物理交聯點在拉伸過程中承擔主要拉力，而無定形鏈的存在又賦予其柔性。這種無定形鏈連接β微晶節點形成的拓樸網絡結構，使得納米微纖擁有比自然界其他物質更柔韌、堅固的力學性能。

1.2? 影響絲素蛋白材料力學性能的結構參數

絲素蛋白材料宏觀上優異的力學性能歸因于其特定的結構。從二級結構中β折疊的含量，三級結構中β微晶的尺寸和含量，到四級結構中β微晶的密度和取向度，都是對力學性能至關重要的結構參數。

絲素蛋白各級結構間相互關聯，上一級結構是下一級結構形成的基礎，逐層遞進對宏觀力學性能產生影響。具體來說，高含量分子間反平行β折疊有利于形成β微晶。β微晶尺寸僅介于幾納米時比更大尺寸時有更高的強度、剛度和韌性［12］。β微晶含量越高，密度越大，取向性越一致，納米微纖網絡的力學穩定性越強。

各級結構對力學性能變化有協同關系。通常認為，二級結構中β折疊含量越高，絲素蛋白材料脆性越大。然而，水退火處理的絲素蛋白膜和甲醇處理的絲素蛋白膜中β折疊含量差異較大，但在水的作用下二者力學性能趨同［13］。有研究認為水能使β股間的氫鍵作用變弱（二級結構），又在無定形鏈間起增塑作用（聚集態結構），這使材料柔韌性增強［14］。

絲素蛋白材料制備的過程，歸根到底是絲素蛋白自組裝的過程。因此，絲素蛋白自身與自組裝過程相關的屬性對力學性能均有影響，如質量濃度［15］和相對分子質量［16］的增加伴隨著拉伸強度的增加。在絲素蛋白材料制備過程中，改變制備條件能改變自組裝路徑，從而影響絲素蛋白的結構，賦予絲素蛋白材料廣泛適應于多種功能的力學性能。

2? 制備工藝對絲素蛋白膜力學性能的影響

絲素蛋白膜的制備通?？煞譃橐韵氯剑?）溶液制備：先脫膠再溶解絲素纖維，獲得絲素蛋白溶液；2）成膜工藝：按結構形式分為致密膜、多孔膜和多層膜；3）成膜后處理：有機溶劑浸泡、水蒸氣退火和外力作用等。

2.1? 溶液制備

制備絲素蛋白膜的第一步是獲得絲素蛋白溶液，即先去除繭殼的絲膠蛋白，再溶解絲素纖維。絲素蛋白材料與天然蠶絲在力學性能上的差異，通常歸因于脫膠和溶解過程中絲素蛋白相對分子質量減小和天然蠶絲中多級結構的缺失。相對分子質量的降低使絲素蛋白無法形成連續的原纖維［17］。

2.1.1? 脫? 膠

脫膠是指去除繭殼中絲膠蛋白的過程。在脫膠時既完全去除絲膠蛋白，又不破壞絲素蛋白的結構是制備出符合應用要求的絲素蛋白的關鍵。脫膠時可以控制脫膠溶劑的種類及質量濃度、脫膠的溫度、時間及次數。脫膠主要通過改變絲素蛋白分子量影響膜的力學性能［18-19］。具有高相對分子質量的絲素蛋白溶液制備的絲素蛋白膜拉伸強度更高，而徹底的脫膠往往導致絲素蛋白降解［18，20］。例如，Allardyce等［18］通過控制脫膠溫度、時間和次數及脫膠溶液的種類和質量濃度，改變脫膠過程中的降解程度。輕柔的脫膠條件下，如較低的溫度、較短的時間、較少的重復次數、較溫和的脫膠試劑，制得的絲素蛋白膜強度為8.9 MPa，比強烈的脫膠條件下的絲素蛋白膜大4.6 MPa。不完全脫膠時，殘留的絲膠蛋白（0.6%）有助于形成β微晶，且輕柔的脫膠使分子量的降低稍小，從而使拉伸強度和模量增加［19］。在脫膠率相近的條件下，使用沸水長時間脫膠所制膜的斷裂伸長率和強度仍比使用Na2CO3溶液脫膠所制膜顯著提高，說明烈性脫膠試劑如Na2CO3的使用會加劇分子量降低，導致力學性能減弱［20］。

2.1.2? 溶解絲素

溶解絲素纖維需要破壞其氫鍵和疏水相互作用。目前用于溶解絲素纖維的溶劑有無機鹽體系、有機鹽體系、有機溶劑體系及離子液體等。溶解過程中可控的條件有溶劑種類及摩爾濃度、溶解的時間和溫度，它們可通過改變絲素蛋白分子量及分子的穩定性［21］等影響膜的力學性能。

不同溶劑體系對絲素纖維溶解能力不同，絲素蛋白的水解程度也不同，從而導致絲素蛋白膜結構和力學性能的差異［22］。用水、甲酸和三氟乙酸分別作溶劑發現，使用三氟乙酸溶解會促進絲素蛋白降解，使絲素蛋白膜力學性能較水和甲酸溶解體系要差［23］。使用離子液體［Bmim］OAc溶解獲得的絲素蛋白膜拉伸強度約是LiBr溶液溶解的兩倍，但斷裂伸長率略低［24］。

2.2? 成膜工藝

絲素蛋白膜按結構形式可以分為致密膜、多孔膜和層狀膜。多孔膜經去除分散在絲素蛋白中的成孔劑后形成。致密膜相較于多孔膜而言，幾乎不存在人為微孔。層狀膜由兩種或兩種以上不同材料相互交疊而成。結構形式不同，制作方法也有差異，可控條件也不同。

2.2.1? 致密膜

致密膜的主要制備方法有溶液澆鑄法和旋轉涂布法。致密膜的制備是多孔膜和層狀膜制備的基礎，例如，通過在溶液中加入成孔劑，經過溶液澆鑄后制成多孔膜；通過旋轉涂布法將多層致密膜堆疊結合制成層狀膜。

溶液澆鑄法是最常用且最簡易的成膜方法，只需將制備好的溶液澆鑄在基材上，溶劑完全揮發后即得到透明的薄膜。在這一過程中干燥速率可通過影響絲素蛋白分子微觀結構從而調控膜的力學性能［25］。緩慢的干燥速率使絲素蛋白分子有足夠的時間與水分子相互作用，β折疊含量降低。緩慢干燥制備的絲素蛋白膜與水蒸氣退火處理的膜相比，模量和強度分別降低了5.9 MPa和1.7 MPa，但斷裂伸長率增加了60%［25］。垂直沉積法制得的絲素蛋白膜與緩慢干燥的相比含有更高的β折疊結構，表現出更高的拉伸模量［26］。

旋轉涂布法指將要涂布的稀溶液加到平面底板上，底板旋轉產生的離心力使底板上的稀溶液涂布成薄膜。Jiang等［7］首次使用旋轉涂布法和自旋輔助層層組裝法制作多層絲素蛋白超薄膜，并用脹形實驗測量超薄膜的力學性能。在超薄膜中，Silk II晶體能形成物理交聯網絡，使絲素蛋白膜的模量增加到6～8 GPa，韌性增加到328 kJm3。然而超薄膜厚度小，絲素蛋白鏈受空間限制，無法通過滑移對自身再取向，無法全面地延展變形，導致斷裂伸長率下降至0.5%。

2.2.2? 多孔膜

絲素蛋白膜孔結構的形成方法很多，常見的有凍干法［27］和鹽浸法［28］。適當的孔結構可以增強透氣透水性，促進細胞遷移和黏附，為膜提供形變能力，但是過多過大的孔會使應力集中，導致強度和斷裂伸長率降低［15］。因此，適當的孔徑大小、孔密度及孔分布對形成優良的力學性能十分重要。

Liu等［29］對絲素蛋白溶液進行高壓滅菌誘導絲素納米顆粒的形成，經溶液澆鑄、甲醇處理及水洗后，納米顆粒溢出使膜中成孔。制得的多孔膜不僅保留了傳統致密膜的拉伸模量（13.10±1.65 MPa vs. 16.27±3.81 MPa，p>0.05），且獲得了遠高于致密膜的滲透性（34.85%±2.12% vs. 6.14%±1.87%， p<0.05）。不同于Liu等從去除溶質的角度來制孔，Zhang等［30］從去除溶劑的角度出發制孔。相較于溶液澆鑄法中水無序蒸發的脫水方法，單向納米孔脫水的方法能引導水分子有序去除，使絲素蛋白能定向積累，形成穩定的Silk I結構，絲素蛋白膜獲得了更強的延伸能力，斷裂伸長率達665.23%。Sun等［15］使用磷酸溶液溶解纖維，硫酸銨溶液作凝固浴，制作出孔徑可調節的絲素蛋白膜。高質量濃度凝固浴意味著更快的凝膠化，從而形成大孔。因此，隨硫酸銨溶液質量濃度增加，絲素蛋白膜的拉伸強度和斷裂伸長率先增加，后降低。

2.2.3? 多層膜

多層膜的力學性能除前述的相關因素，還與層間結合緊密程度有關。這主要通過測試膜的抗彎性能來評價。在旋轉涂布法中，使用適當的方法或引入合適的材料能有效增強層間相互作用，從而改善力學性能。層層自組裝法可通過交替堆疊絲素蛋白溶液和其他材料來實現絲素蛋白膜力學性能的增強。例如，Hu等［31］用自旋輔助層層組裝法引入氧化石墨烯，使絲素蛋白與氧化石墨烯層間形成致密網絡，絲素蛋白膜的彈性模量由10 GPa增加到145 GPa。Yin等［32］用動態自旋輔助層層組裝法拉伸絲素蛋白分子，增強其與氧化石墨烯的相互作用，從而制出極限強度（300 MPa）、模量（170 GPa）和韌性（3.4 MJm3）相平衡的薄膜。另外，水蒸氣退火［33-34］和交聯劑［35］的加入也常被用于增強層間相互作用。

2.3? 成膜后處理

相較于從絲腺中直接提取的絲素蛋白溶液，由絲素纖維溶解的絲素蛋白溶液在制成材料后通常易溶于水。因此，為了實現水不溶性和力學性能的平衡，調控結晶度在成膜后處理過程中就格外重要。

成膜后處理中，最簡易常用的是有機溶劑浸泡。早在20世紀末甲醇就被用于浸泡絲素蛋白膜，但所得絲素蛋白膜脆性大［36］。丁醇分子較大，誘導結晶的能力較甲醇弱。丁醇處理的絲素蛋白膜中無規卷曲結構較甲醇處理多，膜的斷裂伸長率由甲醇誘導得到的1.1%提高到2.7%［37］。有機溶劑浸泡雖然能使無規卷曲結構轉變為β折疊結構，但可調整空間?。?8］。

水蒸氣退火通過調整溫度能更精細地調控β折疊結構含量。在60℃、95℃下形成的絲素蛋白膜β折疊含量較高，使膜的彈性模量、拉伸強度和屈服強度顯著的提高［39］。進一步研究水蒸氣退火時濕度的影響發現，在相同溫度下，濕度對絲素蛋白膜的拉伸強度有顯著影響，但對延展性影響不大。濕度越高，改變絲素蛋白膜二級結構所需的溫度越低［40］。就多層膜的制備而言，水蒸氣退火能有效增強層間相互作用。對于旋轉涂布法制備層層組裝的超薄膜，水蒸氣退火處理可以使絲素蛋白膜填充密度增加，絲素蛋白分子取向更一致，從而使氧化石墨烯-絲素蛋白納米膜的模量和硬度分別由22.1±7.1 GPa和0.8±0.2 GPa提高到45.5±4.8 GPa和2.3±0.6 GPa［33］。Xu等［34］利用水蒸氣退火塑化制出“磚泥結構”中的“泥”，有效加強了薄層間相互作用，不進行水蒸氣退火強度只有20%。

外力作用對絲素蛋白膜力學性能的影響也不可忽略。外力作用的方式有拉伸［41-43］、機械訓練［44-45］及壓力［46］，使絲素蛋白膜的強度和模量增大。圖3（b）是仿生介觀自組裝薄膜（Biomimetic Meso-assembling Films， BMAFs）中絲素蛋白在機械訓練前后的結構示意，在4 h的機械訓練中，絲素蛋白中的無規卷曲經過交聯網絡的形成與重塑，無規卷曲轉變為β折疊，分子鏈高度取向，增加了結晶度和取向度。由圖3（a）可見，與重組絲蛋白（Reconstituted Silkworm Silk Fibroin， RSSFs）相比，隨著機械訓練時間的增加（0～4 h），BMAFs的強度和模量增加，表現出延展性。經4 h訓練后，膜的強度、剛度、延展性和韌性平衡完美，模量相比未訓練膜提高60倍［45］。

表1總結了絲素蛋白膜制備過程中涉及的改性方法及其力學改性機制。

3? 添加物改性絲素蛋白膜

添加物改性絲素蛋白膜有利于滿足實際應用中苛刻的力學性能要求。多數情況下，絲素蛋白與添加物間形成特定的分子間相互作用使力學性能改變。分子間相互作用是絲素蛋白形成β折疊和β微晶的主要物理驅動力。部分添加物可降低成核壁壘，增強分子間相互作用，從而使膜中更易產生物理交聯點（添加交聯劑產生化學交聯）［8］。因此，在復合絲素蛋白膜中，添加物通過增強分子間相互作用改變結構，達到改善力學性能的效果。共混、增塑和交聯是常見的添加物改性方法。

添加混合物、增塑劑或交聯劑對絲素蛋白膜改性是常用的改善絲素蛋白膜力學性能的方法。

3.1? 共? 混

天然高分子、合成高分子和無機材料等都可用于與絲素蛋白共混。共混可實現力學性能的增強，同時還可實現絲素蛋白膜的不溶性并保留其生物相容性和生物可降解性。共混物或先制成溶液再與絲素蛋白溶液混合，或與絲素纖維共同溶解于溶劑中［47］。根據共混物與絲素蛋白的相互作用強度，互作類型大致分為相分離、強相互作用和形成網絡結構。

相分離的情況下，兩種材料的相互作用弱，使拉伸模量和強度降低，斷裂伸長率增加［48-49］。適當的混合方法對復合膜分散度、均勻性至關重要。為了避免相分離導致的力學性能減弱，混合物間須存在一定的相互作用［50］。增塑劑［51］或交聯劑［52］的添加能通過增強界面相互作用，實現絲素共混膜力學性能的提高。

強相互作用的情況較為常見。納米纖維作增強相時往往相互作用較強，能增加絲素蛋白膜的拉伸模量和強度［53-55］。絲素蛋白和纖維素在分子水平上有很強的氫鍵相互作用。隨纖維素百分比增加，絲素蛋白和纖維素間形成的氫鍵比例增加，使分子取向更佳［54］。

形成網絡結構時，力學性能往往最優［56-57］。適當的混合比例能使復合材料間形成獨特的網絡結構，有效增強力學性能。在添加氧化石墨烯的研究中發現，微量的添加可使石墨烯均勻分布，而大量的添加使石墨烯堆疊成團，介于中間的最適比例可以使石墨烯在絲素蛋白間形成均勻的插層，從而使其相互作用達到最大，實現模量的顯著提升［58］。其他納米復合物的添加也呈現類似的效果［59］。

3.2? 增? 塑

增塑劑廣泛用于提高聚合物的加工性能、柔韌性和延展性。純絲素蛋白膜在干態下硬且脆，斷裂伸長率低，添

加增塑劑能有效改善這種情況。增塑劑通常與其他處理配合起效，表2總結了與增塑劑相關的處理對力學性能改善的研究。

3.2.1? 甘? 油

甘油（Glycerin，Gly）是最常用的增塑劑。無論在干態或濕態下，添加甘油的絲素蛋白膜比水蒸氣退火處理或甲醇浸

泡的絲素蛋白膜延展性高。圖4（a）是甘油分子與絲素蛋白作用的示意，甘油分子的氫鍵與絲素蛋白的羥基相互作用能破壞絲素蛋白鏈間的相互作用。當甘油含量增加到12%時，絲素蛋白鏈間的相互作用變弱，無定形結構域中絲素蛋白鏈移動，促使絲素蛋白膜形成β折疊結構，使結晶度增加［65］。當甘油含量增加到22%時，結晶度變化不顯著。結構的變化在力學性能上體現為：隨甘油含量的增加，絲素蛋白膜的斷裂伸長率和韌性分別由1.80%和0.65 MJm3增加到364.42%和32.19 MJm 楊氏模量由2.85 GPa下降至0.07 GPa；當甘油含量大于16%時，結晶度增加到達極限，極限強度穩定在13 MPa左右（圖4（b））［65］。

3.2.2? 水

水在絲素蛋白膜中通常也起增塑作用。絲素蛋白膜存放的濕度環境對其力學性能有不可忽略的影響。在97%的相對濕度環境下絲素蛋白膜的斷裂伸長率和韌性大大提高（圖5（a）（b））。與甘油類似，在相對濕度較高的環境下，水分子以結合水存在，會破壞絲素蛋白鏈間的分子內聚力，降低空間位阻，促進非結晶區的鏈運動，誘導β折疊結晶（圖5（c））。但是，高濕下（97%）水誘導的結晶度增大中形成的微晶較大，這使絲素蛋白膜保留了彈性［66］。

3.2.3? Ca2+

除了甘油和水分子，Ca2+也是一種常見的增塑劑。溶解絲素蛋白時使用含Ca2+的試劑或溶解后額外添加CaCl2都可引入Ca2+。Ca2+的添加還涉及電導率、黏彈性的變化，在電子皮膚、傳感器中應用較多。Ca2+一方面與絲素蛋白相互

作用，另一方面能配位捕獲空氣中的水分子，從而發揮增塑作用，影響絲素蛋白膜的力學性能。

Ca2+通過螯合作用和電荷相互作用與絲素蛋白結合。在使用CaCl2甲酸溶解絲素蛋白時，Ca2+作為增塑劑使絲素蛋白形成以分子內β折疊為主，而非以分子間β折疊晶體為主的結構，得到的絲素蛋白膜彈性模量為2.573 GPa、斷裂伸長率為79.72%［67］。隨絲素蛋白與Ca2+的質量比從90∶10改變到70∶3 絲素蛋白膜的斷裂伸長率從約1%增加到約200%［68］。Ca2+捕獲水的能力很強，通常1個Ca2+能配位6～8個水分子。濕度對含Ca2+的絲素蛋白膜影響極大。Chen等［62］通過分子動力學模擬分析Ca2+的塑化機理，認為Ca2+與環境的相對濕度共同作用影響水含量（圖6（c））。Ca2+含量越高，相對濕度越高，絲素蛋白膜的水含量越高，模量越低（圖6（a）（b））［62］。

3.3? 交? 聯

交聯常用于突破生物材料的局限性?；瘜W交聯和酶促交聯能在分子間形成共價連接，增大相對分子質量，提供更優的力學性能和水穩定性。酶促交聯具有更好的生物相容性和更溫和的反應條件，辣根過氧化物酶和酪氨酸酶都利用絲素蛋白中的酪氨酸進行交聯，從而提高膜的強度［69-70］。紫外線照射［71］及超聲波處理［72］等方法也可形成物理交聯。

絲素蛋白膜改性常用的是化學交聯，常用的交聯劑有環氧樹脂、戊二醛、京尼平、二醛淀粉、乙二醛和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亞胺N-羥基丁二酰亞胺（EDCNHS）等?；瘜W交聯一方面破壞絲素蛋白鏈間原有的相互作用，使鏈段間可以相互滑移，從而使絲素蛋白膜表現出較高的斷裂伸長率；另一方面又使絲素蛋白形成網絡結構，增強鏈段滑移后的可恢復性，從而使膜表現出較好的彈性并增加強度，如環氧樹

脂［73-74］。圖7（a）為絲素蛋白與環氧樹脂交聯結構示意，隨著絲素蛋白占比增大，環氧樹脂與絲素蛋白的化學交聯點增多。這種化學交聯點的增多會限制絲素蛋白鏈的運動，阻礙絲素蛋白中物理交聯點β微晶的形成。絲素蛋白與環氧樹脂以7∶3混合加熱產生的膜物理交聯與化學交聯相平衡，具有強網絡結構，有效提高膜的強度和斷裂伸長率（圖7（b））［74］。

3.4? 其? 他

除上述三種改性方法外，其他改性方法如接枝也可能會對力學性能產生影響。丙氨酸接枝使膜的強度和模量降低，斷裂伸長率增大。這是由于側基接枝后阻礙相鄰分子鏈間的連接，使結晶結構減少，鏈間作用力減小，強度下降；使分子鏈疏松卷曲，受外力拉伸易于伸長，去除外力易于回彈，使斷裂伸長率增大［75-76］。因此，在對絲素蛋白膜接枝改性附加其他性能時要注意控制其對力學性能的影響。

4? 結? 語

天然絲素蛋白中“晶區非晶區”的嵌段分子結構賦予蠶絲纖維優異的強度和韌性。在再生重塑過程中，絲素蛋白的多級結構使其在材料制備過程中能對各級結構進行調控。除了絲素提取過程對絲素蛋白分子結構的影響外，成膜工藝、成膜后處理、復合其他材料及物理化學修飾均會影響絲素蛋白膜的力學性能。因此，利用絲素蛋白的結構特性有望制備出力學性能優異的絲素蛋白膜，以期滿足不同領域的需求，如組織修復與再生、柔性電子器件等。

盡管已有很多方法用于調控絲素蛋白材料的力學性能，但進一步提高和精確調控力學性能的方法還需要繼續創新。首先，從絲素蛋白分子鏈的角度，高相對分子質量絲素蛋白的獲取對于提高膜的力學性能至關重要。然后，對絲素蛋白膜結構與力學性能間關系的厘清能為改性方法的創新提供理論指導。對于非纖維狀的絲素蛋白材料，納米微纖以近乎隨機的方式排布，這種無序排布不利于增強絲素蛋白膜的力學性能。若能從微觀角度更精確地控制納米微纖的排列，使納米微纖解纏結并規整排列，非纖維狀的絲素蛋白材料也能在某個方向上獲得纖維狀般的力學性能。最后，精準調控絲素蛋白膜的力學性能，有利于研究不同力學性能的絲素蛋白膜對細胞、組織生命活動的影響。盡管目前能夠制備出不同力學性能的材料，但是材料的其他性能如潤濕性、拓撲結構和表面特性等可能也隨力學性能的改變而變化。因此，制備出單一力學屬性梯度的絲素蛋白膜是研究力學性能對細胞命運調控的關鍵。隨著對絲素蛋白結構和性能的深入了解，具有優異力學性能的絲素蛋白膜將會在多種領域發揮重要作用。

參考文獻：

［1］HOLLAND C， NUMATA K， RNJAK-KOVACINA J， et al. The biomedical use of silk： Past， present， future［J］. Advanced Healthcare Materials， 2019， 8（1）： 1800465.

［2］CHEN Y P， LYU R， WANG J， et al. Metal-organic frameworks nucleated by silk fibroin and modified with tumor-targeting peptides for targeted multimodal cancer therapy［J］. Advance Science， 2023， 10： 2302700.

［3］WANG J， WU Y， WANG Y C， et al. Graphene oxide-coated patterned silk fibroin films promote cell adhesion and induce cardiomyogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］. Biomolecules， 2023， 13（6）： 1-11.

［4］LI J， YANG F， LIU D Y， et al. Graphene composite paper synergized with micronanocellulose-fiber and silk fibroin for flexible strain sensor［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2023， 240： 124439.

［5］DURN-REY D， BRITO-PEREIRA R， RIBEIRO C， et al. Development of silk fibroin scaffolds for vascular repair［J］. Biomacromolecules， 2023， 24（3）： 1121-1130.

［6］SARKAR L， SUSHMA M V， YALAGALA B P， et al. ZnO nanoparticles embedded silk fibroin： A piezoelectric composite for nanogenerator applications［J］. Nanotechnology， 2022，33： 265403.

［7］JIANG C， WANG X， GUNAWIDJAJA R， et al. Mechanical properties of robust ultrathin silk fibroin films［J］. Advanced Functional Materials， 2007， 17（13）： 2229-2237.

［8］QIU W， PATIL A， HU F， et al. Hierarchical structure of silk materials versus mechanical performance and mesoscopic engineering principles［J］. Small， 2019， 15（51）： 1903948.

［9］ZHOU C Z， CONFALONIERI F， JACQUET M， et al. Silk fibroin： Structural implications of a remarkable amino acid sequence［J］. Proteins， 2001， 44（2）： 119-122.

［10］ASAKURA T， OGAWA T， NAITO A， et al. Chain-folded lamellar structure and dynamics of the crystalline fraction of Bombyx mori silk fibroin and of Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly）n model peptides［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 164： 3974-3983.

［11］ASAKURA T. Structure of silk I （Bombyx mori silk fibroin before spinning）-type II β-turn， not α-helix-［J］. Molecules， 2021， 26（12）： 3706.

［12］KETEN S， XU Z P， IHLE B， et al. Nanoconfinement controls stiffness， strength and mechanical toughness of β-sheet crystals in silk［J］. Nature Materials， 2010， 9（4）： 359-367.

［13］LAWRENCE B D， WHARRAM S， KLUGE J A， et al. Effect of hydration on silk film material properties［J］. Macromolecular Bioscience， 2010， 10（4）： 393-403.

［14］CHENG Y， KOH L D， LI D C， et al. On the strength of β-sheet crystallites of Bombyx mori silk fibroin［J］. Journal of the Royal Society Interface， 2014， 11（96）： 20140305.

［15］SUN F C， XIAO D D， SU H， et al. Highly stretchable porous regenerated silk fibroin film for enhanced wound healing［J］. Journal of Materials Chemistry B， 2023， 11（7）： 1486-1494.

［16］WANG L P， LUO Z W， ZHANG Q， et al. Effect of degumming methods on the degradation behavior of silk fibroin biomaterials［J］. Fibers and Polymers， 2019， 20（1）： 45-50.

［17］KOEBLEY S R， THORPE D， PANG P， et al. Silk reconstitution disrupts fibroin self-assembly［J］. Biomacromolecules， 2015， 16（9）： 2796-2804.

［18］ALLARDYCE B J， RAJKHOWA R， DILLEY R J， et al. The impact of degumming conditions on the properties of silk films for biomedical applications［J］. Textile Research Journal， 2016， 86（3）： 275-287.

［19］LEE J H， SONG D W， PARK Y H， et al. Effect of residual sericin on the structural characteristics and properties of regenerated silk films［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2016， 89： 273-278.

［20］LI M， TIAN W， YU Y X， et al. Effect of degumming degree on the structure and tensile properties of RSFRSS composite films prepared by one-step extraction［J］. Scientific Reports， 2023， 13（1）： 6689.

［21］ZHENG Z Z， GUO S Z， LIU Y W， et al. Lithium-free processing of silk fibroin［J］. Journal of Biomaterials Applications， 2016， 31（3）： 450-463.

［22］CHENG G T， WANG X， TAO S J， et al. Differences in regenerated silk fibroin prepared with different solvent systems： From structures to conformational changes［J］. Journal of Applied Polymer Science， 2015， 132（22）： 41959.

［23］RAJKHOWA R， LEVIN B， REDMOND S L， et al. Structure and properties of biomedical films prepared from aqueous and acidic silk fibroin solutions［J］. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2011， 97（1）： 37-45.

［24］LI L， XIONG Y N， YU S T， et al. Facile preparation for robust and freestanding silk fibroin films in a 1-butyl-3-methyl imidazolium acetate ionic liquid system［J］. Journal of Applied Polymer Science， 2015， 132（47）： 42822.

［25］LU Q， HU X， WANG X Q， et al. Water-insoluble silk films with silk I structure［J］. Acta Biomaterialia， 2010， 6（4）： 1380-1387.

［26］SAGNELLA A， PISTONE A， BONETTI S， et al. Effect of different fabrication methods on the chemo-physical properties of silk fibroin films and on their interaction with neural cells［J］. RSC Advances， 2016， 6（11）： 9304-9314.

［27］WANG Y Y， SU L， HOU Y J， et al. A biomimetic composite bilayer dressing composed of alginate and fibroin for enhancing full-thickness wound healing［J］. Macromolecular Bioscience， 2022， 22（4）： 2100352.

［28］HIGA K， TAKESHIMA N， MORO F， et al. Porous silk fibroin film as a transparent carrier for cultivated corneal epithelial sheets［J］. Journal of Biomaterials Science， Polymer Edition， 2011， 22（17）： 2261-2276.

［29］LIU J， HUANG R， LI G， et al. Generation of nano-pores in silk fibroin films using silk nanoparticles for full-thickness wound healing［J］. Biomacromolecules， 2021， 22（2）： 546-556.

［30］ZHANG M， WANG H Y， ZHANG Y Q. Unidirectional nanopore dehydration induces a highly stretchable and mechanically robust silk fibroin membrane dominated by type II β-turns［J］. ACS Biomaterials Science & Engineering， 2023， 9（5）： 2741-2754.

［31］HU K， GUPTA M K， KULKARNI D D， et al. Ultra-robust graphene oxide-silk fibroin nanocomposite membranes［J］. Advanced Materials， 2013， 25（16）： 2301-2307.

［32］YIN Y， HU K S， GRANT A M， et al. Biopolymeric nanocomposites with enhanced interphases［J］. Langmuir， 2015， 31（39）： 10859-10870.

［33］CHO H， LEE J， HWANG H， et al. Mechanical properties of graphene oxide-silk fibroin bionanofilms via nanoindentation experiments and finite element analysis［J］. Friction， 2022， 10（2）： 282-295.

［34］XU Z P， WU M R， GAO W W， et al. A sustainable single-component “silk nacre”［J］. Science Advances， 2022， 8（19）： 1-7.

［35］KHARLAMPIEVA E， KOZLOVSKAYA V， WALLET B， et al. Co-cross-linking silk matrices with silica nanostructures for robust ultrathin nanocomposites［J］. ACS Nano， 2010， 4（12）： 7053-7063.

［36］MINOURAN， TSUKADA M， NAGURA M， et al. Physico-chemical properties of silk fibroin membrane as a biomaterial［J］. Biomaterials， 1990， 11（6）： 430-434.

［37］CHIAO Y H， HUNG W S. Separation performance of alcohol-induced silk fibroin membranes with homogeneous and heterogeneous microstructures［J］. Separation and Purification Technology， 2022， 293： 121004.

［38］ZHAO M H， QI Z Z， TAO X S， et al. Chemical， thermal， time， and enzymatic stability of silk materials with silk I structure［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（8）： 4136.

［39］HU X， SHMELEV K， SUN L， et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing［J］. Biomacromolecules， 2011， 12（5）： 1686-1696.

［40］WANG H Y， ZHOU S F， ZHANG M， et al. The post-processing temperature or humidity can importantly control the secondary structure and characteristics of silk fibroin films［J］. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2021， 110（4）： 827-837.

［41］YIN J W， CHEN E Q， PORTER D， et al. Enhancing the toughness of regenerated silk fibroin film through uniaxial extension［J］. Biomacromolecules， 2010， 11（11）： 2890-2895.

［42］ZHANG C C， SONG D W， LU Q， et al. Flexibility regeneration of silk fibroin in vitro［J］. Biomacromolecules， 2012， 13（7）： 2148-2153.

［43］YOSHIOKA T， TASHIRO K， OHTA N. Molecular orientation enhancement of silk by the hot-stretching-induced transition from α-helix-HFIP complex to β-sheet［J］. Biomacromolecules， 2016， 17（4）： 1437-1448.

［44］SHU T， L Z C， CHEN C T， et al. Mechanical training-driven structural remodeling： A rational route for outstanding highly hydrated silk materials［J］. Small， 2021， 17（33）： 2102660.

［45］ZHANG Y H， YE S S， CAO L T， et al. Natural silk spinning-inspired meso-assembly-processing engineering strategy for fabricating soft tissue-mimicking biomaterials［J］. Advanced Functional Materials， 2022， 32（27）： 2200267.

［46］YAZAWA K， HIDAKA K. Pressure-and humidity-induced structural transition of silk fibroin［J］. Polymer， 2020， 211： 123082.

［47］YUE W， ZHANG L H， DENG L L， et al. Co-dissolution of cellulose and silk fibroin in levulinic acid-derived protic ionic liquids for composited membrane and fiber preparation［J］. Green Chemistry， 2021， 23（23）： 9669-9682.

［48］CHEN W H， LI F， CHEN L， et al. Fast self-assembly of microporous silk fibroin membranes on liquid surface［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 156： 633-639.

［49］JIN H J， PARK J， VALLUZZI R， et al. Biomaterial films of Bombyx mori silk fibroin with poly（ethylene oxide）［J］. Biomacromolecules， 2004， 5（3）： 711-717.

［50］MORAES M A D， SILVA M F， WESKA R F， et al. Silk fibroin and sodium alginate blend： Miscibility and physical characteristics［J］. Biomaterials Advances， 2014， 40： 85-91.

［51］LI X F， ZHANG H J， HE L， et al. Flexible nanofibers-reinforced silk fibroin films plasticized by glycerol［J］. Composites Part B： Engineering， 2018， 152： 305-310.

［52］SERBAN M A， KLUGE J A， LAHA M M， et al. Modular elastic patches： Mechanical and biological effects［J］. Biomacromolecules， 2010， 11（9）： 2230-2237.

［53］HUANG J W， QIN J Z， ZHANG P， et al. Facile preparation of a strong chitosan-silk biocomposite film［J］. Carbohydrate Polymers， 2020， 229： 115515.

［54］LUO Z W， LI M Z， ZHANG Q， et al. Green preparation of silk fibroinbamboo-derived cellulose nanofibril nanocomposite films with high mechanical strength［J］. Journal of Materials Science， 2022， 57（20）： 9265-9276.

［55］LV L L， HAN X S， ZONG L， et al. Biomimetic hybridization of kevlar into silk fibroin：Nanofibrous strategy for improved mechanic properties of flexible composites and filtration membranes［J］. ACS Nano， 2017， 11（8）： 8178-8184.

［56］MA M B， DONG S Z， HUSSAIN M， et al. Effects of addition of condensed tannin on the structure and properties of silk fibroin film［J］. Polymer International， 2017， 66（1）： 151-159.

［57］WANG F， WU H， VENKATARAMAN V， et al. Silk fibroin-poly（lactic acid） biocomposites：Effect of protein-synthetic polymer interactions and miscibility on material properties and biological responses［J］. Biomaterials Advances， 2019， 104： 109890.

［58］WANG F， ARAVIND S S J， WU H， et al. Tunable green graphene-silk biomaterials： Mechanism of protein-based nanocom-posites［J］. Biomaterials Advances， 2017， 79： 728-739.

［59］REIZABAL A， CASTRO N， PEREIRA N， et al. Silk fibroin nanocomposites with indium tin oxide toward sustainable capacitive touch sensing applications［J］. ACS Applied Electronic Materials， 2022， 4（4）： 1901-1909.

［60］WANG Y Y， WANG X Y， SHI J， et al. Flexible silk fibroin films modified by genipin and glycerol［J］. RSC Advances， 2015， 5（123）： 101362-101369.

［61］LYU H， LI J H， YUAN Z C， et al. Supertough and highly stretchable silk protein-based films with controlled biodegradability［J］. Acta Biomaterialia， 2022， 153： 149-158.

［62］CHEN G， MATSUHISA N， LIU Z Y， et al. Plasticizing silk protein for on-skin stretchable electrodes［J］. Advanced Materials， 2018， 30（21）： 1800129.

［63］SRIVASTAVA C M， PURWAR R， KANNAUJIA R， et al. Flexible silk fibroin films for wound dressing［J］. Fibers and Polymers， 2015， 16（5）： 1020-1030.

［64］羅敏清. 小分子多元醇對絲素蛋白結構和性能的影響［D］. 蘇州： 蘇州大學， 2011.

LUO M Q. The Effects of Polyalcohol on the Structure and Properties of Silk Fibroin［D］. Suzhou： Soochow University， 2011.

［65］L H， SUN Z Y， LIU Y， et al. Processing-structure-properties relationships of glycerol-plasticized silk films［J］. Molecules， 2022， 27（4）： 1339.

［66］YAZAWA K， ISHIDA K， MASUNAGA H， et al. Influence of water content on the β-sheet formation， thermal stability， water removal， and mechanical properties of silk materials［J］. Biomacromolecules， 2016， 17（3）： 1057-1066.

［67］XUE Y， WANG F， TORCULAS M， et al. Formic acid regenerated mori， tussah， eri， thai， and muga silk materials： Mechanism of self-assembly［J］. ACS Biomaterials Science & Engineering， 2019， 5（12）： 6361-6373.

［68］BON S B， RAPI M， COLETTA R， et al. Plasticised regenerated silkgold nanorods hybrids as sealant and bio-piezoelectric materials［J］. Nanomaterials， 2020， 10（1）： 179.

［69］ZHOU B G， WANG P， CUI L， et al. Self-crosslinking of silk fibroin using H2O2-horseradish peroxidase system and the characteristics of the resulting fibroin membranes［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2017， 182（4）： 1548-1563.

［70］李新玥， 邢鐵玲. 基于酪氨酸酶的絲素蛋白膜的制備及其性能［J］. 絲綢， 2013， 50（10）： 24-29.

LI X Y， XING T L. Study on the preparation and performance of the tyrosinase based silk fibroin membrane［J］. Journal of Silk， 2013， 50（10）： 24-29.

［71］XIE C X， LI W J， LIANG Q Q， et al. Fabrication of robust silk fibroin film by controlling the content of β-sheet via the synergism of UV-light and ionic liquids［J］. Applied Surface Science， 2019， 492： 55-65.

［72］CAI B W， GU H L， WANG F， et al. Ultrasound regulated flexible protein materials： Fabrication， structure and physical-biological properties［J］. Ultrasonics Sonochemistry， 2021， 79： 105800.

［73］楊華. 絲素膜的共混改性研究［D］. 蘇州： 蘇州大學， 2004.

YANG H. Modification of Silk Fibroin Film by Blending［D］. Suzhou： Soochow University， 2004.

［74］YANG K， YAZAWA K， TSUCHIYA K， et al. Molecular interactions and toughening mechanisms in silk fibroin-epoxy resin blend films［J］. Biomacromolecules， 2019， 20（6）： 2295-2304.

［75］ZHOU B G， ZHOU Q， WANG P， et al. HRP-mediated graft polymerization of acrylic acid onto silk fibroins and in situ biomimetic mineralization［J］. Journal of Materials Science： Materials in Medicine， 2018， 29（6）： 1-14.

［76］張幼珠， 王朝霞， 吳徵宇， 等. 丙烯酸接枝絲素膜的結構及其性能研究［J］. 紡織學報， 2003（2）： 17-20.

ZHANG Y Z， WANG Z X， WU Z Y， et al. Study of the structure and properties of acrylic acid grafted silk fibroin films［J］. Journal of Textile Research， 2003（2）： 17-20.

Research progress in regulating the mechanical properties of silk fibroin films

LIU Haiyu， LIANG Wenan， WANG Yeyuan， HU Doudou， SUN Jingchen

（College of Animal Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract：Silk fibroin shows biocompatibility， biodegradability， and a lack of immunogenicity and allergenicity， possessing great potential in biomedical applications. In various forms of silk fibroin biomaterials， silk fibroin films are attracting increasing attention due to their easy processing. Among the physic-chemical properties of silk fibroin films， mechanical properties have great impact on their subsequent applications in vitro and in vivo. First， this paper briefly discussed the relationship between the hierarchical structures and mechanical properties of silk fibroin. Then， it summarized the influence of preparation parameters on mechanical properties， and the influence of different treatments on microstructure of silk films and the resulting changes in mechanical properties. Moreover， it discussed the relationship between structural changes and mechanical properties of silk fibroin films. Finally， it looked to the future to provide reference for the development of silk fibroin films to meet a variety of needs.

The mechanical properties of silk fibroin materials are structure dependent. Silk fibroin materials have five levels of hierarchical structures， in which the content of β-sheet in the secondary structure， the size and content of β-crystallites in the tertiary structure， and the density and orientation of β-crystallites in the quaternary structure are all critical parameters to the mechanical properties. The multi-level structure of silk fibroin can progressively influence the macroscopic mechanical properties step by step. In the aggregated state， it is generally accepted that the strength and stiffness of the silk fibroin material are determined by Silk II while ductility and flexibility are controlled by Silk I.

The rational design and reconstruction of silk fibroin structure can be implemented by controlling the preparation process. Pure silk fibroin films can be prepared in three steps： solution fabrication， film formation and post-treatment. Solution fabrication consists of degumming and silk fibroin dissolution， which will reduce the molecular weight of silk fibroin and therefore weaken the mechanical properties. As for film formation， solution casting or spin coating is often used to produce dense， porous， and lamellar films. The mechanical property of silk fibroin films fabricated via solution casting is controlled by controlling the drying rate， while films fabricated via spin-on method are limited by thickness. The pore size， pore density and pore distribution are important to mechanical properties for porous films， while the mechanical properties of lamellar films are related to the interlayer bond compactness. Post-treatments， such as organic solution immersion， water vapor annealing， external forces， and relative humidity in storage， can improve mechanical properties by changing crystallinity and orientation.

Additive modification is an effective way to improve the mechanical properties of silk fibroin films. Blending， plasticizing， and crosslinking are common additive modification methods. Mechanical properties are changed by forming specific intermolecular interactions between silk fibroin and additives. The interactions between blends and silk fibroin can be roughly divided into phase separation， strong interaction， and network formation. Among them， network formation needs an appropriate mixing ratio to form an excellent balance interaction. Crosslinkers form covalent links between molecules and increase the molecular weight. In this way， physical crosslinking and chemical crosslinking need to be balanced. Plasticizing can improve the flexibility and ductility of silk fibroin films. The commonly used plasticizers are glycerin， water， and Ca2+， and the combination of other additives gives silk fibroin films excellent comprehensive mechanical properties.

All in all， the hierarchical structures and the mechanic-structure dependence of silk fibroin materials make silk fibroin films adaptive to meet the applications requiring different mechanical properties. In the future， it is necessary to continue to expand the preparation methods of silk fibroin， and have an in-depth knowledge of the relationship between the structure and properties of silk fibroin， so as to accurately regulate the mechanical properties of silk fibroin films and further study the relationship between mechanical properties and other relevant properties. Mechanical property modification， functionalization and biocompatibility need to be considered together in the application studies of silk fibroin materials， so as to further expand the application range of silk fibroin materials.

Key words：

silk fibroin; film; mechanical properties; regulation method; composite materials; structure-property relationship