基于網絡藥理學的銀花甘草湯治療放射性肺炎的機制

傅燕紅,廖小文,潘丁龍

(福建醫科大學附屬第二醫院腫瘤放射治療科,福建 泉州 362000)

放射治療是惡性腫瘤重要的治療手段之一,特別在胸部腫瘤的全程治療中發揮著不可或缺的作用。然而,胸部放療引起的放射性肺炎是放療劑量限制的主要因素。據報道[1],肺癌行胸部放療后,放射性肺炎的發生率高達15%～40%,嚴重影響了治療效果及患者的生活質量。目前,放射性肺炎主要采用激素進行抗炎治療,但是激素的使用不僅具有免疫抑制作用,還有發生二重感染的風險,甚至因治療中斷導致腫瘤的進展。因此,在臨床上尋找高效、低毒的有效藥物顯得尤為重要。中醫藥是我國的傳統醫學,在某些疾病特別是慢性病的治療中發揮著重要的作用,與西藥相比,更具高效、低毒、經濟的優點,但因中醫藥理論自成一體,且中藥成分復雜,其對于疾病的治療的分子機制不清,因此,運用細胞及分子層面水平對中藥的作用機制進行闡述具有重要的意義。銀花甘草湯收載于《醫學心悟》,主要由金銀花和甘草兩味中藥組成,其具有清熱解毒的功效,兼具低毒、經濟的優點。中醫理論認為,放射線屬“火熱毒邪”,基于中醫理論及少量的文獻報道[2],認為銀花甘草湯在治療放射性肺炎方面具有一定療效。本研究采用網絡藥理學方法,獲取金銀花、甘草對治療放射性肺炎的主要成分及相應的作用靶點,構建成分-靶點網絡圖,并挖掘可能參與的生物學功能及作用的相關通路,從分子層面對其治療放射性肺炎的機制進行闡述。

1 材料與方法

1.1中藥化學成分的收集篩選:利用中藥系統藥理學分析平臺數據庫檢索金銀花、甘草的主要化學成分,以口服利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件,篩選出具有較高生物利用度及類藥性的化合物分子,并收集其相應的作用蛋白靶點,結合Uniport數據庫進行蛋白靶點Gene Symbol的標準化處理。

1.2中藥成分作用靶點的收集篩選:將篩選出的化合物在TCMSP數據庫中進行作用靶點的收集,并將收集到的靶點蛋白在Uniport數據庫中進行標準化處理,得到靶點蛋白相對應的Gene Symbol名稱。

1.3放射性肺炎靶點的檢索:以“Radiation Pneumonitis”為關鍵詞在GeneCards數據庫中進行放射性肺炎疾病靶點的檢索,并收集Gene Symbol數據。進而將疾病靶點與中藥活性成分靶點進行映射,得到銀花甘草湯治療放射性肺炎的潛在作用靶點。

1.4活性成分-藥物靶點的網絡構建:將篩選得到的中藥活性成分和映射得到的作用靶點導入Cytoscape軟件中進行活性成分-靶點網絡圖的構建,利用cytoHubba插件對構建好的網絡進行重要節點成分及關鍵靶點的篩選,并繪制核心活性成分-藥物靶點網絡圖。

1.5靶基因基因本體論(Go)富集和京都基因與基因百科全書(KEGG)通路分析:將篩選得到的關鍵靶點在Enrichr數據庫中進行Go生物學過程分析和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1銀花甘草湯化學成分及作用靶點篩選結果:以“金銀花”“甘草”分別為關鍵詞在TCMSP數據庫中檢索其化學成分,共檢索到516個化合物,其中金銀花236個、甘草280個。根據設定的篩選標準,共得到115個具有良好ADME(吸收、分布、代謝、排泄)性質的活性化合物,其中金銀花23個、甘草92個。將篩選得到的23個金銀花、92個甘草活性成分在TCMSP數據庫中進行蛋白靶點收集,共收集到483個金銀花作用蛋白靶點、1 773個甘草作用蛋白靶點,篩選去重后得到221個金銀花蛋白靶點、239個甘草蛋白靶點。將去重后得到的蛋白靶點在Uniprot數據庫中進行Gene Symbol標準處理,共得到362個,其中175個金銀花、187個甘草的基因名稱。見表1(OB值前10位的金銀花、甘草成分)。

表1 銀花甘草湯活性成分

2.2疾病靶點檢索結果:在GeenCards數據庫中以“Radiation Pneumonitis”為關鍵詞共檢索到559個放射性肺炎的相關靶點見表2(相關度得分排名前10位靶點蛋白)。

表2 放射性肺炎相關靶點

2.3有效成分-疾病靶點映射結果:將標準化處理后的金銀花、甘草作用靶點與放射性肺炎相關靶點采用韋恩圖進行映射,共得到PPARD、MMP2、HSPB1、HMOX1、NOS2等59個交集靶點。見圖1。

圖1 藥物-疾病靶點映射圖

2.4成分-靶點網絡構建:根據篩選得到的362個活性成分和韋恩圖篩選得到的59個作用靶點,利用Cytoscape軟件構建成分-靶點網絡圖,該網絡圖包括155個節點,495條邊。利用cytoHubba插件進行重要節點篩選,繪制核心成分-靶點網絡圖,共得到PTGS2、NOS2、AKT1、PRARG、MAPK14等5個核心作用靶點,得到MOL000422(山萘酚)、MOL000006(木樨草素)、MOL002773(β-胡蘿卜素)、MOL000098(槲皮素)、MOL004805{(2S)-2-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-8,8-dimethyl-2,3-dihydropyrano[2,3-f]chromen-4-one}、MOL000417(鈣黏蛋白)、MOL000392(刺芒柄花素)、MOL003896(7-甲氧基-2-甲基異黃酮)、MOL003656(黃羽扇豆魏特酮)、MOL000354(異鼠李素)、MOL000497(甘草查爾酮A)、MOL004328(柚皮苷)、MOL002311(甘醇)等13個重要中藥活性成分。見圖2。

圖2 核心成分-靶點網絡圖

2.5GO和KEGG富集結果:將篩選得到的5個核心靶點蛋白導入Enrichr數據庫進行GO生物學過程和KEGG通路富集分析。GO分析共富集到MAP激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、絲裂原活化蛋白激酶結合、氧化還原酶活性、磷酸二苯酯-3,4-雙磷酸二苯酯等13條P<0.05的生物學過程。見表3。KEGG分析共富集到VEGF信號通路、小細胞肺癌、C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、脂肪溶解的調控、松弛素信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路等61條P<0.01的相關通路。見表4(僅列出前20)。

表3 GO富集結果

表4 KEGG富集結果

3 討論

胸部放療不可避免的會對正常肺組織產生影響,放射性肺炎是其常見的早期并發癥,治療主要以激素為主,常缺乏特異性治療手段,若不能及時有效控制甚至有可能出現呼吸衰竭危及生命,部分長期存活的腫瘤患者晚期出現肺纖維化嚴重影響生活質量。本研究采用網絡藥理學方法,利用中藥數據庫篩選出銀花甘草湯的有效成分,結合疾病數據庫進行作用靶點篩選,并構建網絡圖,繼而對其生物學功能及參與的信號通路進行挖掘,對銀花甘草湯治療放射性肺炎提供分子層面的理論支撐。

本研究對TCMSP數據庫檢索到的銀花甘草湯有效成分進行分析發現,山萘酚、木樨草素、β-胡蘿卜素、槲皮素、鈣黏蛋白、刺芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等13個化合物是作用于放射性肺炎靶點重要的有效成分。山奈酚屬于黃酮類化合物,已有研究表明,山奈酚可以抑制NO和前列腺素E2的釋放,降低c-Jun和c-fos的轉錄活性,并抑制Src、syk、IRAK1和IRAK4等靶標分子的激活,從而起到抗炎活性,同時具有抗氧化和抗癌的作用[3-5]。王靜[6]研究發現,山奈酚可以清除放射線輻射產生的活性氧(ROS)和一氧化氮(NO),降低丙二醛(MDA)水平,增加超氧化物歧化酶(SOD)水平,對減少輻射誘導的氧化應激和細胞凋亡發揮防護作用。白細胞介素(IL)-31和IL-33是許多炎性反應和病理疾病中表達的細胞因子,在炎性反應發生、發展過程中發揮著重要的作用。研究表明,木犀草素可從mRNA和蛋白水平抑制IL-33刺激的HMC-1.2細胞中IL-31的表達,木犀草素還抑制IL-33刺激的HMC-1.2細胞培養液中IL-31的分泌。進一步的研究結果表明,木犀草素能抑制IL-33刺激的HMC.1.2細胞中ERK、JNK、p38和NF-κBp65的活化[7]。此外,木犀草素還阻止了p65的核轉位和與其DNA結合位點的結合?；谏鲜鼋Y果,木犀草素被認為可能是一種潛在的用于預防或治療與IL-31和IL-33相關的疾病。β胡蘿卜素是最豐富的類胡蘿卜素,具有潛在的抗炎作用。最新研究表明,β-胡蘿卜素通過抑制巨噬細胞中的NF-κB,JAK2/STAT3和JNK/p38 MAPK信號通路來減輕脂多糖誘導的炎性反應[8]。槲皮素最主要的效應是具有調節炎性反應的作用[9]。體外研究表明,槲皮素主要通過降低IL-1、IL-6、IL-10的表達量從而起到到抗炎的作用[10]。另外,槲皮素在脂肪細胞中也具有抗炎的作用,其機制主要與其通過AMPK/Sirt1途徑對IL-12和一氧化氮酶(iNOS)的表達量進行調節有關[11]。以上研究結果均表明,銀花甘草湯中的主要化學成分具有一定的抗炎作用。

本研究通過對核心靶點進行GO富集分析分析發現銀花甘草湯中的主要成分參與了MAP激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、絲裂原活化蛋白激酶結合、氧化還原酶活性、磷酸二苯酯-3,4-雙磷酸二苯酯等13個生物學過程,與放射性肺炎的發生、發展有著密切的關系。KEGG通路富集分析結果顯示相關靶點主要參與了血管內皮生長因子(VEGF)信號通路、小細胞肺癌、C型凝集素受體信號通路、TNF信號通路、脂肪溶解的調控、松弛素信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路等61條信號通路從而起到治療放射性肺炎的作用。VEGF是一種特異性的促VEGF,具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性等作用,阿昔替尼(AG-013736)是一類具有選擇性靶向VEGF信號通路的小分子受體酪氨酸激酶抑制劑,Hillman等[12]研究發現在小鼠肺癌模型中其與放療的結合具有減少肺炎、血管損傷及肺纖維化發生的作用。放射性肺腫瘤壞死因子α的產生與早期細胞凋亡和潛在肺功能損害有關,抑制肺TNFR1對肺有選擇性地放射保護作用,而不影響腫瘤的反應,這些發現支持了利用抑制腫瘤壞死因子-α途徑開發新的放射防護策略[13],提示腫瘤壞死因子(TNF)相關信號通路參與放射防護過程。IL17A是IL17家族中重要成員之一,郭雷鳴等[14]通過檢測肺癌患者放療前后血清IL-17A水平的變化情況發現放療后放射性肺炎組與非放射性肺炎組血清中IL-17A水平存在明顯差異,相關性檢驗發現IL-17A升高與放射性肺炎的發生呈正相關,提示IL-17A可能是較好的預測放射性肺炎的細胞因子,因此猜測IL17信號通路可能參與放射性肺炎的發生。綜上所述,銀花甘草湯中主要有效成分通過其核心靶點依靠VEGF信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路等發揮抗炎、放射防護的作用。

本研究采用新興的網絡藥理學研究方法對銀花甘草湯治療放射性肺炎的有效成分、活性靶點和可能的作用機制進行了初步的預測與探討,為后續基礎研究及臨床應用提供一定的理論支持。但是以上研究僅依靠生物信息學、相關數據庫挖掘及部分文獻數據支持,可能存在偏差,具有一定的局限性,對于銀花甘草湯治療放射性肺炎的作用機制及臨床推廣仍需進一步研究探討。