保幼激素環氧水解酶基因在蠋蝽滯育過程中的表達模式及其功能研究

王勝男 張茂森 周磊 井曉宇 張洪志 李玉艷 吳惠惠 張禮生

摘要：保幼激素（juvenile hormone，JH）缺乏是引發昆蟲生殖滯育的主要原因，保幼激素環氧水解酶（JHEH）作為JH的主要降解酶，通過調控JH滴度水平在昆蟲滯育中發揮重要作用。為研究JHEH在蠋蝽生殖滯育中的調控功能，克隆獲得了蠋蝽JHEH基因（AcJHEH），該基因編碼452個氨基酸，具有典型環氧水解酶結構特征，無跨膜結構域，存在1個信號肽位點。同源性及系統進化分析結果表明，AcJHEH在不同物種間具有較高保守性，與茶翅蝽（Halyomorpha halys）的JHEH相似性較高，達65.46%。利用RT-qPCR 技術測定了AcJHEH在蠋蝽不同組織及滯育不同時期的表達量，發現AcJHEH表達量在滯育誘導期先下降后升高，滯育誘導20 d時表達量最低；滯育初期（誘導 40 d）表達量最高，滯育維持期（誘導50～60 d）的表達量穩定在較高水平，與成蟲初羽化時水平接近。AcJHEH在滯育蠋蝽的頭部表達量最高，其次是中后腸和脂肪體，在卵巢中表達量最低。利用RNAi敲降蠋蝽初羽化成蟲的JHEH基因表達后，雌蟲體內的卵黃蛋白原（vitelliogenin，Vg）基因表達量上升，卵黃沉積明顯，推測滯育誘導期高表達的JHEH基因可能通過抑制Vg基因的表達，抑制卵黃蛋白沉積和卵巢發育，從而促進蠋蝽的生殖滯育。本研究結果為解析JHEH在生殖滯育中的調控作用提供了參考依據。

關鍵詞：蠋蝽；生殖滯育；保幼激素環氧水解酶；基因表達模式；基因功能

中圖分類號：S476.2；S433? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0043-09

收稿日期：2023-05-04

基金項目：國家煙草總局重大專項[編號：110202001032（LS-01）]；貴州省煙草公司項目（編號：201937、201941）。

作者簡介：王勝男（1997—），女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向為農業昆蟲與害蟲防治。E-mail：3221905868@qq.com。

通信作者：吳惠惠，博士，助理研究員，研究方向為農業昆蟲與害蟲防治，E-mail：wuhuihui@tjau.edu.cn；張禮生，博士，研究員，研究方向為害蟲生物防治，E-mail：zhangleesheng@163.com。

蠋蝽（Arma chinensis Fallou）因其具有適應性強、捕食范圍廣等優點^[1-2]，在對包括草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）在內的入侵害蟲也有較高的捕食能力，因此在生物防治中具有較高應用價值^[1-9]。在蠋蝽的生產應用中，產品足量穩定供應和批量釋放是影響其控害效果的關鍵因素，研究蠋蝽的大量擴繁、儲存及釋放應用對促進其產業化發展具有重要意義^{[2，10-16]}。自然條件下，部分昆蟲為躲避不利環境影響會選擇進入一種發育停滯狀態，即滯育（diapause）。滯育過程受環境因子、遺傳和激素的共同調控，滯育期間常伴隨能源物質積累、代謝抑制、抗逆性提高、生殖抑制等生理變化^[17-20]。研究明確昆蟲的滯育特征及其調控機制，不僅有助于掌握昆蟲的環境適應機制、預測種群發生動態，還可通過人為操控有益昆蟲的滯育進程延長其貯存和使用壽命，提高天敵的貨架期和應用潛力，或可干預害蟲的滯育發生控制其危害^[18]。筆者所在實驗室在前期研究中證實蠋蝽能以成蟲形態進行滯育，雌成蟲在短光照低溫條件下誘導40 d后進入滯育態，滯育率可達90%以上，滯育期平均可維持160 d，部分能達300 d以上^[21]。在此基礎上深入解析蠋蝽生殖滯育的調控機制，對促進蠋蝽的擴繁應用具有重要應用價值。

保幼激素（juvenile hormone，JH）能使幼蟲蛻皮后仍保持幼蟲狀態，抑制成蟲特征的出現，并在成蟲期促進卵子成熟，調控昆蟲生殖發育的一種倍半萜烯類激素。大量研究表明，JH是控制昆蟲滯育的主要調節激素^[22-24]。通常生殖滯育的雌蟲JH滴度低于正常發育的雌蟲，JH缺乏是成蟲滯育的主要原因^{[23，25-26]}。保幼激素滴度受合成和代謝共同調控，其中，JH的代謝主要受保幼激素酯酶（juvenile hormone esterase，JHE）、保幼激素環氧化物水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase，JHEH）和保幼激素二醇激酶（juvenile hormone diol kinase，JHDK）的調控^[27-31]。JHEH是調控昆蟲體內保幼激素滴度的關鍵酶^[30]，在昆蟲中，JHEH可把JH降解成保幼激素二醇（juvenile hormone diol，JHD），并把保幼激素酸（juvenile hormone acid，JHA）降解為保幼激素酸二醇（juvenile hormone acid diol，JHAD）^[22-25]。在異色瓢蟲（Harmonia axyridis）及大猿葉甲（Colaphellus bowringi）等昆蟲的生殖滯育研究中發現，JHEH基因在滯育期間顯著上調，干擾該基因表達，可明顯抑制滯育反應，促進卵巢發育及脂肪積累等，證明JHEH基因的高表達對促進滯育，維持滯育表型具有重要作用^{[28，32-34]}。并通過分別干擾JHE、JHEH或JHDK在成蟲滯育期間的表達，發現JHEH和JHDK比JHE在調控JH滴度水平中可能發揮更重要的作用^[35-39]。

本研究為解析保幼激素環氧水解酶基因JHEH在蠋蝽生殖滯育中的作用及調控機制，首先對克隆的JHEH基因的全長序列進行生物信息學分析，在此基礎上，運用實時熒光定量PCR技術測定了JHEH基因在蠋蝽不同組織及滯育不同時期的轉錄表達水平，明確了JHEH基因在蠋蝽生殖滯育過程中的表達規律。利用RNA干擾技術，對蠋蝽初羽化成蟲的JHEH基因進行干擾，并分析了干擾后對蠋蝽Vg基因表達及卵巢發育的影響，為進一步揭示JHEH通過調控JH滴度影響滯育進程的作用機制奠定了基礎。

1? 材料與方法

1.1? 供試昆蟲

供試蠋蝽種群來自中國農業科學院植物保護研究所河北省廊坊基地實驗室，于2021年7月在北京實驗室繼代飼養建立穩定種群。正常發育的蠋蝽飼養條件為：溫度（27±2） ℃，相對濕度75%，光—暗周期16 h—8 h；滯育誘導下的蠋蝽飼養條件為溫度周期15 ℃（光）—5 ℃（暗），相對濕度75%，光—暗周期8 h—16 h。

1.2? 試驗處理

蠋蝽雌蟲作為供試蟲源，取非滯育雌蟲（NE）、滯育誘導期（誘導10、20、30 d）、滯育初期（誘導 40 d）、滯育維持期（誘導50、60 d）的蠋蝽雌蟲整個蟲體樣品用于RNA的提取。解剖誘導40 d的蠋蝽雌蟲的不同組織（頭、脂肪體、卵巢、中腸和后腸）樣品用于RNA的提取。

1.3? AcJHEH基因克隆及序列分析

1.3.1? 引物設計與合成

根據筆者所在實驗室已測蠋蝽的轉錄組數據，鑒定得到AcJHEH基因序列，并設計引物（表1）。

1.3.2? RNA提取、-cDNA、5′/3′-RACE-ready-cDNA的合成

蠋蝽的總RNA提取步驟按照試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit，北京全式金生物技術股份有限公司）說明書進行。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用北京金沙生物科技有限公司的UnionScript First-strand cDNA Synthesis反轉錄試劑盒將上述不同樣品的 RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。按照試劑盒（SMARTer RACE 5′/3′Kit，Clontech）說明書，合成5′/3′-RACE-ready-cDNA，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3? 中間片段擴增

以滯育蠋蝽cDNA為模板，利用AcJHEH-F/AcJHEH-R進行中間序列擴增。反應體系（50 μL）：上下游引物各2 μL，模板1 μL，PCR Master Mix 25 μL，ddH₂O 20 μL輕微振蕩混勻。反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 ｓ，56 ℃退火10 ｓ，72 ℃延伸15 ｓ，共40個循環；反應完成后對PCR產物進行測序。

1.3.4? 5′/3′-RACE PCR

分別以5′-RACE-ready-cDNA和3′-RACE-ready-cDNA為模板，按照試劑盒說明書擴增RACE全長。反應體系（50.0 μL）：PCR-Grade H₂O 15.5 μL，Buffer 25.0 μL，SeqAmp? DNA Polymerase 1.0 μL，混勻后加入2.5 μL模板，10×UPM 5.0 μL，AcJHEH-5′GSP或AcJHEH-3′GSP 1.0 μL。反應程序：94 ℃ 30 ｓ，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 ｓ，70 ℃ 30 ｓ，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 ｓ，69 ℃ 30 ｓ，72 ℃ 3 min，20個循環。將PCR 產物進行回收、連接、轉化及測序。

1.3.5? 序列拼接與生物信息學分析

利用DNAMAN和EditSeq，對PCR試驗中得到的中間序列和5′／3′RACE得到的序列進行拼接，得到AcJHEH基因cDNA全長序列。利用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測氨基酸序列，用NCBI BLAST軟件進行序列比對及同源序列搜索；利用MEGA 7.0進行系統進化樹構建，用PredictProtein（https：//predictprotein.org/）在線分析和ExPASy Protteo tmics Server在線分析進行蛋白二級結構預測；利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）進行蛋白分子式預測，用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白跨膜結構的預測，用SignalP 5.0 Server在線分析（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）進行信號肽預測；利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）進行蛋白三級結構預測。

1.4? 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）

運用Primer Premier 6.0 軟件設計qRT-PCR引物，選取蠋蝽AcActin基因作為內參基因，并設計合成引物，見表1；實時熒光定量檢測使用 LightCycler 96 Instrument（Roche，瑞士）進行，試劑使用北京全式金生物技術股份有限公司的GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行。反應體系（20.0 μL）為：2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix（1×）10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各 0.8 μL，超純水 7.4 μL。反應條件為：95 ℃變性 60 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。

1.5? AcJHEH基因的RNA干擾和干擾后表型觀察

根據AcJHEH的cDNA序列，設計并合成帶有T7（TAATACGACTCACTATAGGG）啟動子序列的特異性引物[表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]和dsGFP（基于綠色熒光蛋白基因設計的dsRNA，用于對照試驗），以蠋蝽雌成蟲cDNA為模板進行PCR 擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后利用膠回收試劑盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit）進行純化。以1 μg膠回收產物為模板，利用dsRNA合成試劑盒（MEGA scriptRNAi Kit，Thermo Fisher）合成dsAcJHEH和dsGFP，試驗步驟和試劑參照Li等的方法^[33]，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶后定量至2 μg/μL。選取初羽化的蠋蝽雌成蟲，使用Nano Ject Ⅲ，Drummond Scientific Company注射儀（Drummond，美國）對其注射dsAcJHEH（注射數量為47頭），注射部位統一為蠋蝽第二、第三腹節之間的節間膜，注射劑量為3 μg/頭，同時注射等量的dsGFP（共47頭）作為對照，將注射后的試蟲飼養在正常條件下。將注射后的蠋蝽雌蟲用于基因沉默效率檢測和Vg含量檢測，檢測時取3組重復，每組雌蟲為5～6頭，設3次技術重復。取注射后24、48、60、72、96 h的試蟲進行qRT-PCR試驗，檢測其干擾效率，并檢測注射后48、60、72 h的Vg含量。分別對未滯育，注射dsGFP、注射dsAcJHEH后4 d的蠋蝽進行解剖，對其卵巢進行拍照。

1.6? 數據統計與分析

時空表達試驗采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對數據進行分析，RNA干擾試驗后檢測AcJHEH基因沉默效率以及對沉默AcJHEH基因后Vg基因的相對表達量進行t檢驗和單因素方差分析，并采用Tukeys多重比較法進行顯著性分析，數據均為平均值±標準誤。

2? 結果與分析

2.1? AcJHEH基因序列分析

由圖1可知，AcJHEH基因 cDNA 全長 2 109 bp，開放閱讀框（ORF）為1 359 bp，編碼452個氨基酸，5′非編碼區135 bp，3′非編碼區616 bp，預測該基因編碼蛋白的分子式為C_{2 402}H_{3 641}N₅₉₇O₆₅₂S₁₂，預測蛋白的分子量為51.69 866 ku，理論等電點為8.21，帶正電荷的氨基酸45個，帶負電荷的氨基酸43個，極性氨基酸216個，非極性氨基酸203個。親水性系數為-0.143（<0），不穩定系數為32.80（<40），是疏水的穩定蛋白。JHEH全長序列包含完整開放閱讀框，N端包含1個由18～22 個氨基酸組成的疏水性信號肽序列，第49～161個氨基酸之間存在EHN環氧水解酶超家族結構域，跨膜結構域預測結果表明，該蛋白包含0個跨膜區域和1個信號肽切割位點（圖2、圖3）。蛋白的螺旋（helix）、折疊（strand）、其他（other）占比分別為37.25%、8.65%和54.10%。以保幼激素環氧水解酶（SMTL ID：4qla.1.A）為模型預測蠋蝽JHEH蛋白的3D結構（圖4）為同源JHEH序列，序列相似度約為46.14%。

2.2? 構建AcJHEH系統進化樹

由圖5可知，在NCBI數據庫中選取8種不同昆蟲的JHEH氨基酸序列，與蠋蝽的JHEH序列進行同源性分析，結果顯示相似性達65.46%，JHEH

包含1個HGWP氨基酸序列，該序列在七星瓢蟲和其他昆蟲的JHEH中高度保守，因此，基序HGWP或許參加了JHEH的催化作用^[33-34]。由圖6可知，將從數據庫中選取的31種同源性較高的物種與蠋蝽JHEH氨基酸序列一起構建進化樹，從進化樹中可以看出，JHEH氨基酸序列與鞘翅目、雙翅目等昆蟲的親緣性較高，其中與茶翅蝽（Halyomorpha halys）（登錄號XM_014437801）的親緣關系最近。

2.3? AcJHEH基因的時序表達分析

由AcJHEH基因在蠋蝽滯育不同時期的表達結果（圖7）可知，AcJHEH基因在蠋蝽滯育誘導及滯育

期間均有表達，不同時期間存在極顯著差異（F=8.009，df=26，P<0.01）。成蟲初羽化時期AcJHEH表達量較高；滯育誘導10 d時表達量極顯著降低，滯育誘導20 d時表達量達最低，隨后逐漸升高；在滯育初期（誘導40 d）達到峰值，進入滯育維持期（50、60 d）后穩定在較高水平。

蠋蝽滯育初期（誘導40 d）檢測AcJHEH基因在雌蟲不同組織中的表達量，由圖8可知，AcJHEH在雌蟲頭部的表達量極顯著最高（F=311，df=19，P<0.01），是脂肪體中基因表達量的2.3倍；AcJHEH基因在中腸和后腸中的表達量均極顯著高于脂肪體和卵巢中的表達量，但兩者間無顯著差異；AcJHEH在卵巢中的表達量最低，僅為頭部表達量的5%。

2.4? AcJHEH基因的功能分析

由圖9可知，未注射dsAcJHEH的對照組中，JHEH的表達量持續下降；注射dsAcJHEH后，JHEH的表達量先下降再上升，注射后60 h的表達量最低，說明注射dsAcJHEH會影響JHEH的表達；在注射dsAcJHEH試驗后的24 h，對照組和處理組的JHEH相對表達量差異不大；注射后48～72 h，對照組和處理組的相對表達量差異極顯著。注射后 60 h，處理組的AcJHEH相對表達量極顯著低于對照

組的相對表達量，表明基因干擾成功。

由圖10可知，檢測注射dsAcJHEH 48、60、72 h 后試蟲的Vg基因的轉錄水平，發現注射dsGFP試蟲的Vg基因在注射后48、60 h的相對表達量呈下降趨勢；注射dsAcJHEH后，Vg基因的相對表達量極顯著高于注射dsGFP對照組的相對表達量，Vg基因的表達在注射后60 h時達最高，至注射72 h后，Vg基因的相對表達量下降，但依然極顯著高于對照組。由圖11可知，比較分別注射dsAcJHEH和注射dsGFP后4 d的雌蟲卵巢圖片，發現與注射dsGFP的對照組相比，注射dsAcJHEH后，卵巢發育，卵黃原堆積現象更加顯著。

3? 結論與討論

滯育是昆蟲在應對不良環境壓力，如夏季高溫、冬季嚴寒及食物缺乏等因素時的一種重要生存策略^[17-20]，對個體存活和種群維持具重要意義。蠋蝽成蟲的生殖滯育主要表現為生殖系統的發育停滯，如雌蟲卵泡不分化、無卵黃沉積、卵巢管呈透明色，雄蟲附腺發育抑制等^[21]。以往研究證實，成蟲進入滯育，伴隨著保幼激素水平下降，其中，JH生物合成下降或關閉被認為是誘發一些昆蟲啟動滯育的關鍵環節^[33-37]，有些研究也表明JH降解在調控滯育中發揮重要作用，如在滯育準備期JH代謝增強可促進脂肪積累、提高抗逆性，并抑制卵巢發育^[32-37]。JH的代謝分為2個途徑：（1）JH被JHE降解成為JHA，JHA再被JHEH降解為JHAD；（2）保幼激素被JHEH降解為JHD，JHD再被JHDK降解成為保幼激素二醇磷酸（juvenile hormone diol phosphate，JHDP），即JH最終被降解為JHAD和JHDP^[40-43]。已有研究表明，JH降解酶基因在不同種類昆蟲的生殖滯育中發揮不同程度的調控作用，且同種降解酶基因的不同亞型也具有不同功能，如在生殖的煙粉虱（Bemisia tabaci）和意大利蜜蜂（Apis mellifera）中，JHE與卵黃原蛋白基因表達水平一致，兩者均與JH滴度呈負相關^[42-44]；而黃斑星天牛（Psacothea hilaris）幼蟲進入滯育后，JHE活性顯著降低且在滯育期間維持較低水平^[45]，在滯育準備期的大猿葉甲雌蟲中，3個JHE基因也以低水平表達^[36]。

在本研究中，克隆獲得了AcJHEH基因全長，分析AcJHEH基因序列特征發現，蠋蝽JHEH的N端包含1個由18～22個氨基酸組成的疏水性信號肽序列，不含有跨膜結構域，第49～161個氨基酸之間存在EHN環氧水解酶超家族結構域，具備環氧水解酶的典型結構特征^{[27-29，33-35]}，推測為JHEH1^[35]。通過進化樹分析蠋蝽JHEH氨基酸序列與近源物種的同源比較，蠋蝽保幼激素環氧水解酶基因在進化上高度保守，與同屬半翅目蝽科的茶翅蝽JHEH聚類到同一分支，說明親緣關系較近。

分析JHEH基因在蠋蝽滯育過程中的時序表達規律特征，結果表明JHEH基因表達與滯育進程聯系密切，可能在滯育過程中也發揮重要調控作用。保幼激素降解代謝增強是生殖滯育激素調控的一個普遍特征。本研究結果表明，JHEH基因表達在蠋蝽滯育前期和滯育期均顯著提高，這和JHEH基因在七星瓢蟲滯育期間的表達規律相似^[32]，說明JHEH基因的轉錄水平變化與滯育進程密切相關。AcJHEH在滯育準備期和維持期的高表達，可能促進保幼激素的降解，降低JH滴度，從而促進滯育發生和維持。本研究也發現，蠋蝽成蟲和七星瓢蟲成蟲在初羽化時，JHEH表達水平均較高，在對初羽化成蟲進行滯育誘導處理后，JHEH表達量逐漸下降至最低水平后又隨誘導時間延長而顯著升高，推測初羽化成蟲體內高表達的JHEH與成蟲羽化行為有關，高表達的JHEH有助于維持低水平的保幼激素，從而完成羽化過程^[46]。在滯育蠋蝽中，JHEH基因在頭部高表達，說明該基因主要在頭部發揮重要調控作用，與本研究不同，JHEH1基因在滯育大猿葉甲頭部表達量較低^[35]。JHEH基因在蠋蝽中腸和后腸中的表達量僅次于在頭部的表達量。蠋蝽脂肪體中JHEH的表達量較低，和滯育大猿葉甲中JHEH1的研究結果^[35]相似，但JHEH基因在滯育九香蟲（Aspongopus chinensis Dallas）的脂肪體中高表達^[29]。滯育蠋蝽的卵巢中JHEH表達量極低，這與九香蟲的研究結果^[29]近似。上述研究結果表明，JHEH基因在蠋蝽滯育成蟲中的表達具有組織特異性，其在不同組織的差異表達發揮相應的生理調節功能，具體功能仍需進一步研究證實。

接下來，本研究對初羽化的蠋蝽進行JHEH基因的RNA干擾試驗，發現干擾后，Vg的表達量上升，卵黃沉積明顯，推斷JHEH基因可通過促進Vg基因的表達來促進蠋蝽卵巢的發育。在七星瓢蟲JH降解基因的功能研究中，發現在滯育準備期干擾JHE或JHEH基因表達均可促進卵黃沉積和卵子發生^[35]，但對大猿葉甲JH降解基因的研究中發現，JHE在滯育準備的雌蟲中低表達，干擾JHEHs和JHDK在滯育準備期的表達后，雖然能降低脂肪積累和抗逆性，但不能促進生殖，也沒有促進卵巢發育^[37-39]?，F有這些結果說明，JH降解酶基因在不同昆蟲生殖滯育中的調控作用程度不完全相同，因此，研究者認為雖然保幼激素降解基因可通過調控JH水平對昆蟲生殖滯育產生影響，但這種影響在某些昆蟲中的作用是有限的，在這些昆蟲中，或許JH生物合成水平的下降可能才是誘導生殖滯育的主要因素^{[35，37-41]}，僅通過抑制JH降解酶基因表達是否能逆轉成蟲進入滯育狀態還需要進一步研究。JHEH基因在蠋蝽生殖滯育中的具體調控作用仍需深入探索。

此外，保幼激素的代謝不僅受降解酶基因的調控，還受如叉頭轉錄因子（forkhead-boxO，FoxO）等的調控，其表達上調時可促進代謝酶類的轉錄翻譯，同時沉默Kr-h1（krüppel-homolog1）基因片段的表達，阻斷Kr-h1對JHD的應答反應，從而降低保幼激素滴度^{[38，46]}。在后續研究中，除繼續開展JHEH基因功能和上游信號通路研究，解析JHEH在滯育不同時期的特定作用機制，還要探索轉錄因子和保幼激素信號響應元件對保幼激素滴度的調控作用，為全面解析保幼激素調控生殖滯育的機制提供理論參考。

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