陸地棉GhRTE基因家族的鑒定與耐鹽性分析

徐凱祥 焦玚 王帥帥 陳全家 鄭凱

摘要：RTE（reversion-to-ethylene）是一種植物乙烯響應的負調節因子，參與植物生長發育并在非生物脅迫的逆境中起著重要作用。通過對陸地棉（Gossypium hirsutum）RTE家族成員的鑒定及其在鹽脅迫下的表達模式進行解析，為進一步探索棉花RTE家族成員的功能提供一定的研究指導。通過棉花全基因組數據，鑒定棉花RTE家族成員，以陸地棉為主要研究對象，結合海島棉（Gossypium barbadense）、亞洲棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）等植物的RTE基因家族成員進行物種內的進化分析。同時，利用轉錄組學方法，研究陸地棉RTE家族基因的表達量及其對鹽脅迫的應答規律。結果表明，棉花RTE蛋白家族共鑒定出24個RTE基因，其中來自陸地棉和海島棉的各有8個，有4個來自雷蒙德氏棉，4個來自亞洲棉。系統發育樹分析將24個RTE基因分成3個亞族，GhRTE基因同一亞族成員間具有相似的基因結構和保守基序。GhRTE啟動子區包含了許多與植物激素反應、生長發育和逆境應答密切相關的順式調控因子。通過對轉錄組數據分析以及熒光定量分析，初步驗證該家族GhRTE6基因可能在棉花生長發育以及鹽脅迫響應中發揮作用，可為闡明GhRTE基因耐鹽的分子機制提供理論依據。

關鍵詞：陸地棉；RTE基因家族；非生物脅迫；表達特性分析；耐鹽性

中圖分類號：S562.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0052-09

收稿日期：2023-05-29

基金項目：新疆維吾爾自治區重大科技專項（編號：2022A03004-2）。

作者簡介：徐凱祥（1995—），男，甘肅蘭州人，碩士研究生，研究方向為棉花耐鹽性。E-mail：965762115@qq.com。

通信作者：陳全家，博士，教授，博士生導師，從事棉花遺傳育種研究，E-mail：chenqjia@126.com；鄭凱，博士，副教授，從事棉花種質資源優異基因挖掘和分子育種研究，E-mail：zhengkai555@126.com。

乙烯是人類迄今發現的唯一一種植物氣體激素，它在植物的生長發育過程中起著十分關鍵的作用。乙烯與受體結合后，可觀察到對種子萌發、干細胞分裂、細胞伸長和分化、根毛生長、幼苗、性別決定、果實成熟、果實衰老、果實脫落以及對鹽、干旱、洪水、低溫脅迫等方面的各種反應及影響^[1]。RTE是植物乙烯反應的負調節因子，參與植物生長發育并在非生物脅迫的逆境中起著重要作用。RTE基因在高等真核生物中廣泛表達，而在低等真核生物和原核生物中不表達。前人通過遺傳學分析及轉基因技術，對擬南芥中RTE的功能進行了進一步研究，結果表明，RTE基因的過表達導致了乙烯的抗性；然而，當乙烯受體ETR（ethylene-response）基因被敲除，該基因過表達后，植株就會喪失對乙烯的抗性，這表明乙烯受體與RTE之間存在著緊密的相互作用。通過構建RTE和受體功能缺失的多突變體，發現RTE可能在乙烯信號通路中起負調控作用，并且RTE可能對ETR起正調控作用^[2]。然而在陸地棉中，關于棉花RTE基因家族成員相關的生物信息及功能特性鮮有報道。

棉花是一種重要的纖維作物，也是一種以商業規模將纖維轉化為織物的經濟作物^[3]。鹽脅迫對植物生長發育的影響貫穿于植物個體發育的整個過程，但幼苗期被認為是最脆弱的時期之一^[4-5]。此外，雖然棉花被認為是中等耐鹽的，臨界值為7.7 dS/m，但其生長在苗期受到嚴重影響，從而降低了產量^[6]。新疆是我國最大的棉產地，2022年，新疆棉花產量539.1 萬t，占全國總量的90.2%，比2021年增加26.2 萬t，增長5.1%^[7]，新疆棉花生產能夠直接影響我國的棉花生產。據有關數據統計，新疆鹽堿土地面積約占我國鹽堿土地總面積的22.01%，達到 2 181.4 萬hm²。在新疆地區407 萬hm²耕地中，受鹽漬化影響的耕地達122.88 萬hm²，極大程度影響了棉花的種植^[8-9]。提高棉花的耐鹽性是改善土壤鹽堿化的必要方法。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料

本研究所用陸地棉耐鹽材料CQJ-5和敏鹽材料新陸早49號（XLZ-49）均由新疆作物遺傳改良與種質創新重點實驗室提供^[10-11]。將形狀飽滿的棉種播種于裝滿蛭石與花土體積比1 ∶1混合的營養缽中，每個營養缽放入3～4粒種子，于培養室中進行培養，溫度為 25 ℃，光、暗周期為12 h光照、12 h黑暗。待長到3葉1心期，選取真葉生長一致的幼苗，展開鹽脅迫處理，將幼苗根系浸入150 mmol/L NaCl溶液中，分別于0 、3 、6 、12 、24、48 h后，取棉花幼苗的根、莖、葉部用于分析GhRTE6基因在鹽脅迫條件下的表達水平。以上樣品選取后迅速用液氮冷凍，貯藏于 -80 ℃ 冰箱備用^[12]。

1.2? 棉花RTE家族基因鑒定與蛋白理化性質分析

本試驗首先從CottonGen數據庫（https：//www.cottongen.org/）中獲取棉花的全基因組和蛋白組學數據，并下載GFF3注釋文件^[13]。以從NCBI-CDD數據庫獲取的RTE蛋白保守結構域（PF05608）為切入點，借助于隱馬爾可夫模型，并基于Hmmsearch搜索結果，通過本地數據庫BLAST比對，獲取棉花全基因組RTE蛋白質的序列信息，并對其進行生物信息學分析，進而對已知的RTE蛋白質進行功能分析。通過ExPASy網站上的ProtParam在線工具，分析棉花RTE基因編碼的蛋白質序列的分子量（MW）、等電點（pI）等物理化學性質，并通過WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位^[14-15]。

1.3? 進化樹、同源性分析

采用MEGA-X軟件對陸地棉、海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉等棉花品種的RTE蛋白質序列進行多序列比對，并建立進化樹^[16]。用名為Evolview v3的在線網站對其進行美化^[17]。根據棉花的基因組和染色體數據庫CottonFGD，利用TBtools軟件顯示出RTE蛋白家族成員在棉花染色體上的同源性^[18]。通過CottonGen數據庫、BLAST軟件、TBtools軟件和MCScanX等工具，對在陸地棉內部A、D基因亞組之間以及四大棉種之間的RTE蛋白家族同源性，進行了比對和共線性分析，并通過TBtools進行可視化分析后用Adobe Illustrator CS6進行美化修飾^[19-22]。

1.4? 染色體定位及基因結構分析

借助TBtools軟件將GhRTE基因染色體的定位信息從已下載的GFF3注釋文件中提取出來，之后進行可視化。利用MEME程序分析RTE家族成員的Motif基序（最大發現數設置為15）^[23]，并使用TBtools軟件對其進行可視化分析。

1.5? 順式作用元件預測

利用TBtools軟件，從已下載的基因組文件中提取陸地棉RTE基因起始密碼子上游2 000 bp序列，將這些序列視為啟動子區，并利用PlantCARE數據庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其進行分析，以此來預測GhRTE基因上游啟動子區可能存在的順式作用元件^[15，24]。

1.6? 陸地棉RTE基因RNA-seq表達模式分析

從NCBI SRA網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載陸地棉各器官的轉錄組數據（根、莖、葉、雌蕊、雄蕊、花萼、花瓣和花托）和非生物脅迫處理的轉錄組數據（基因組測序計劃編號為PRJNA248163）。參考基因組文件TM-1_genome_ZJU_v2.1，對原始數據進行轉錄組標準分析，獲得表達數據^[25-26]。表達數據標準化為lg（TPM+1），通過TBtools軟件繪制表達量圖。本研究的基因結構圖、順式作用元素圖和熱圖均由TBtools軟件完成，然后用Adobe Illustrator CS6進行美化和調整。

1.7? RNA提取及qRT-PCR分析

利用CottonFGD數據庫下載陸地棉RTE基因編碼序列（CDS）信息，利用DNAMan （Lynnon Corporation，Canada）軟件實現對相關基因特異性熒光定量引物的設計。根據生產商提供的說明書，使用RNAprep Pure多糖多酚的總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]從幼苗中提取總RNA，并使用abm反轉錄試劑盒進行合成，以獲得第1條cDNA。通常選擇棉花Ubiquitin7（UBQ7）作為內參基因，利用羅氏Light Cycler熒光定量PCR儀，對在不同部位各個脅迫處理時期的RTE基因進行 qRT-PCR擴增（3次技術重復），相關基因相對表達量分析采用2^－ΔΔC_T法^[27]。最后選擇GraphPad Prism version 9.0.0 for Windows對數據進行可視化處理，完成后用Adobe Illustrator CS6進行美化調整。

2? 結果與分析

2.1? 棉花RTE基因的鑒定和分析

通過本地BLAST數據庫和NCBI-CDD數據庫對棉花RTE蛋白家族進行篩選驗證，共鑒定出24個RTE基因，其中陸地棉和海島棉均包含8個基因，雷蒙德氏棉4個、亞洲棉4個（表1）。如表1所示，陸地棉RTE基因編碼區長度范圍為684～762 bp，氨基酸長度范圍在227～253 aa之間，基因編碼的蛋白質分子量范圍為25.84～28.62 ku，等電點（pI）介于5.86～7.09之間；海島棉RTE基因編碼區長度為 468～762 bp，氨基酸長度在155～253 aa之間，基因編碼的蛋白質分子量范圍為17.92～28.64 ku，等電點介于4.99～7.09之間；雷蒙德氏棉RTE基因編碼區長度為588～762 bp，氨基酸長度在195～253 aa 之間，基因編碼的蛋白質分子量范圍為22.38～28.57 ku，等電點介于4.94～7.09之間；亞洲棉RTE基因編碼區長度為684～762 bp，氨基酸長度在227～253 aa之間，基因編碼的蛋白質分子量范圍 25.83～28.54 ku，等電點介于5.27～7.01之間。預測亞細胞的定位結果顯示，棉花中的24個RTE編碼蛋白基本都位于細胞質或質膜中。RTE基因家族成員的理化性質和亞細胞定位結果大致相同，這也預示該基因家族在棉花生長發育信號傳遞過程中扮演著重要角色。

2.2? 棉花RTE基因染色體定位與命名

將棉花RTE基因進行染色體結構定位分析，結果如圖1所示，4個棉花品種RTE基因在染色體上呈不均勻分布。陸地棉和海島棉的A01、A02、A03、A04、A05、A06、A09、A12、A13、D01、D02、D03、D04、D05、D06、D09、D12、D13染色體均無RTE基因分布，A07、A08、A10、A11、D07、D08、D10和D11染色體各有1個基因分布。亞洲棉中Chr07、Chr08、Chr10和Chr11染色體各有1個基因分布，其他染色體上均無RTE基因。雷蒙德氏棉中Chr01、Chr04、Chr07和Chr11染色體各有1個基因，其他染色體上均無RTE基因。陸地棉所含的RTE基因分布于8條不同的染色體上，其中A亞組染色體上有4個，D亞組染色體上有4個，海島棉與之相同。雷蒙德氏棉4個RTE基因分布于4條不同的染色體上，亞洲棉與之相同。說明該基因家族在進化過程中比較穩定。之后根據基因在染色體上的排列位置，將它們命名為GhRTE1～GhRTE8、GbRTE1～GbRTE8、GaRTE1～GaRTE4、GrRTE1～GrRTE4。

2.3? 棉花RTE基因家族系統進化分析

采用鄰接法對棉花RTE基因進行聚類，并建立系統發育樹。從圖2可以看出，24個RTE基因可以被劃分為3個亞族，分別用Group1、Group2和Group3表示。Group1成員最多有12個，其中陸地棉和海島棉均有4個，雷蒙德氏棉和亞洲棉均有2個。其次，Group2和Group3成員個數相同，均為6個，Group2中陸地棉和海島棉成員均有2個，雷蒙德氏棉和亞洲棉成員均有1個。Group3中陸地棉和海島棉成員均有2個，雷蒙德氏棉和亞洲棉均有1個。結合圖1可以發現，陸地棉和海島棉在染色體相同位置上的RTE基因都緊密地聚集在了同一個亞族中，另外，每一個亞族中，與雷蒙德氏棉、亞洲棉相比，陸地棉、海島棉所含的基因數量均是它們的2倍，這與棉屬的演化規律相吻合。

2.4? 陸地棉RTE基因同源性分析

同源是指在演化過程中具有相同祖先血統的支系間的演化關系。在不同的物種中，源自于同一個祖先的基因被叫作直系同源基因，而在相同的物種中，因為基因復制而分離出來的同源基因就是旁系同源基因^[28]。為了解棉花RTE基因家族的同源進化關系，對陸地棉、海島棉、亞洲棉以及雷蒙德氏棉進行分析，同時也可以了解到8個GhRTE在二倍體棉和四倍體棉中的進化聯系。陸地棉各染色體之間有4對直系同源基因，A亞組和D亞組出現了加倍復制，并且不同亞組之間有更緊密的進化關系（圖3）。陸地棉與亞洲棉之間有12對直系同源基因，與雷蒙德氏棉之間有12對直系同源基因，與海島棉之間有8對直系同源基因（圖4），說明彼此之間具有極密切的進化關系，且這些基因在不同棉花中可能具有相同的功能。

2.5? 陸地棉RTE蛋白保守基序及對應的基因結構分析

本研究分析了陸地棉中8個RTE蛋白的序列特征，發現其結構域保守程度較高，將從RTE蛋白序列中找到的12個保守基序依次命名為Motif1～Motif12，8個GhRTE蛋白均含有Motif1～Motif7和Motif9（圖5-A）。Motif11基序只存在于GhRTE1與GhRTE5中。Motif10基序只存在于GhRTE2與GhRTE6中。Motif12基序只存在于GhRTE3與GhRTE7中。而GhRTE1、GhRTE5、GhRTE2和GhRTE6中均含有Motif8基序。GhRTE家族8個基因均有2個外顯子（圖5-B）。從基因長度方面來看，具有不同長度的基因，其編碼序列是相似的。這表明，在進化的過程中，RTE基因的內含子長度

發生了較大的改變，這就有可能導致不同的功能。

2.6? 陸地棉RTE基因家族的啟動子分析

對陸地棉啟動子的順式元件進行分析，可為研究基因的組織特異性或應激性表達模式提供思路和幫助。由圖6可知，在8個陸地棉RTE基因中鑒定到的順式作用元件中，有41個與激素有關，例如水楊酸響應元件（TCA-element，SARE）、脫落酸響應元件（ABRE）、赤霉素響應元件（GARE-motif，TATC-box，P-box）、生長素響應元件（TGA-element，AuxRR-core）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應元件（TGACG-motif，CGTCA-motif）等^[29]。此外，還發現了20個逆境應答元件，如低溫反應響應元件（LTR）、防御和應激響應元件（TC-rich repeats）、干旱脅迫響應元件（MBS），以及1個類黃酮合成響應元件（MBSI）。8個GhRTE基因含有4～10個不同的順式作用元件，其中以脫落酸和茉莉酸酯相關的順式作用元件的含量最高。據研究，脫落酸與植株抗逆性顯著相關，茉莉酸甲酯與植物生長發育以及抗逆性相關。其中GhRTE1、GhRTE4和GhRTE5基因所含脫落酸、茉莉酸甲酯順式元件數量為3個，GhRTE6和GhRTE8基因所含脫落酸、茉莉酸甲酯順式元件數量為4個。說明陸地棉RTE基因家族可能在植物生長發育以及在非生物脅迫逆境中發揮著較強作用。

2.7? 陸地棉RTE基因家族的表達分析

為了明確RTE家族基因在陸地棉中的組織表達特異性，以及它們對鹽脅迫的響應規律，利用轉錄組數據，借助TBtools軟件對8個GhRTE基因在棉花根、莖、葉、花瓣、花托、花萼等組織進行了特異性表達分析。在正常的生長環境下，這些基因在陸地棉的不同部位表現出了不同的表達模式：GhRTE1、GhRTE2、GhRTE4、GhRTE5、GhRTE6和GhRTE8基因在不同組織中的表達有很大的差異，并且它們的表達量比較高，而其他基因的表達量則比較低，甚至不表達，暗示這些基因可能在陸地棉的生長發育中起重要作用（圖7-A）。同時分析在不同時期鹽脅迫下的陸地棉RTE家族基因表達情況，發現GhRTE2、GhRTE5和GhRTE6在鹽脅迫下的各個時間階段中表現出高表達趨勢（圖7-B），且在花托和花萼這類營養器官中的表達量高于其他組織。由此可推測出GhRTE2、GhRTE5和GhRTE6可能在棉花的生長發育階段以及在非生物脅迫響應中發揮重要作用。

2.8? qRT-PCR分析

通過啟動子區相關順式作用元件（圖6）以及轉錄組表達（圖7）分析結果，選取鹽脅迫下表達變化明顯且抗逆性相關順式作用元件交集最多的GhRTE基因，最終挑選GhRTE6基因進行進一步研究。分別對耐鹽棉花材料CQJ-5以及敏鹽材料新陸早49號進行72 h鹽脅迫處理（圖8）。根據GhRTE6基因序列設計引物（表2）并利用qRT-PCR分析發現，耐鹽材料CQJ-5經鹽脅迫處理 12 h 后，GhRTE6基因在莖部的表達量較高，而在葉片和根部的表達量則相對較低；敏鹽材料新陸早49在脅迫后24 h時，在莖中表達水平較高，而在根和葉中表達水平相對較低（圖9）。從總體觀察發現，GhRTE6基因在耐鹽材料中的表達量高于敏鹽材料。

3? 討論與結論

RTE基因在多種植物中的功能分析已見報道，但關于RTE基因家族分析研究卻極少，在棉花中從未有過基因家族鑒定及功能分析。本研究鑒定出陸地棉8個、海島棉8個、雷蒙德氏棉4個和亞洲棉4個，共24個棉花RTE家族成員，進行進化關系解析將其分為3個亞族，每個亞族中的陸地棉和海島棉在染色體相同位置上的RTE基因都緊密地聚集在了一起，而且每個亞組中陸地棉和海島棉的基因數量都是雷蒙德氏棉和亞洲棉的2倍左右，符合棉花物種的進化關系。本研究中棉花RTE基因家族成員編碼的蛋白通過亞細胞定位預測多數位于質膜上，少數位于細胞質中，這與前人的研究結果^[2]較為一致。

前人的研究表明，RTE家族包括2個類群：RTE1組和RTH（RTE1-homolog）組^{[23，30-32]}。RTE1可以正調控乙烯受體ETR1，并通過ETR1的N端跨膜域對乙烯信號進行調控，番茄中的GR（green-ripe）和GRL1（green-ripe like 1）是擬南芥中的AtRTE1的同源基因，對RTE1/GR/GRL1基因進行過表達，可以提高乙烯受體活性，進而降低植株對乙烯的敏感性^[31-33]。擬南芥中的AtRTE1也可以結合生長素調節基因（ARGOS）參與調控器官大小，它的保守的TPT區使其對乙烯的敏感性下降^[33-34]，ARGOS基因的過表達能夠提高擬南芥和玉米的耐旱性。本研究通過順式作用元件預測得出陸地棉RTE基因家族啟動子區包含多個生長發育激素以及逆境響應調控元件，其中GhRTE1、GhRTE4、GhRTE5、GhRTE6和GhRTE8基因所含脫落酸、茉莉酸甲酯順勢元件數量最多，且GhRTE1、GhRTE4和GhRTE5基因含有抵御脅迫相關的順式作用元件，說明RTE基因家族可能也參與了棉花的生長發育并調控其他酶類合成以應對逆境脅迫。

對RTE家族中不同組織及逆境條件下不同基因表達量分析發現，GhRTE1、GhRTE2、GhRTE4、GhRTE5、GhRTE6和GhRTE8基因的表達量明顯高于其他基因，表明它們在棉花生長發育中起著重要的作用。同時分析在不同時期鹽脅迫下的陸地棉RTE家族基因表達情況，結果表明，GhRTE2、GhRTE5和GhRTE6在不同的鹽分脅迫時期表現出了較高的表達趨勢，在12～48 h之間表達量較高，其余基因受非生物脅迫后表達量低甚至不表達。GhRTE6基因在棉花受到鹽脅迫處理下，隨著脅迫時間的延長，在不同的陸地棉材料中做出了顯著性應答。在耐鹽材料中，GhRTE6基因在脅迫12 h后表達量較高，而在敏鹽材料中GhRTE6在脅迫24 h后表達量較高，且都在莖中高表達，這說明GhRTE6在敏鹽材料中對于鹽脅迫的響應比耐鹽材料中慢，證明GhRTE6對鹽脅迫具有一定的調控作用。由此可推測出GhRTE6可作為棉花響應非生物脅迫的關鍵基因進一步研究其功能特性。

本研究從陸地棉、海島棉、雷蒙德氏棉以及亞洲棉等4個棉花品種中，發現了24個RTE基因家族成員，并在進化樹上將它們劃分為3個亞族，依據同源性關系可推斷出陸地棉與海島棉、亞洲棉以及雷蒙德氏棉之間的進化關系，發現同族成員中個別基因保守基序不同且相似長度基因其外顯子的數量和長度也有所不同，故其功能可能存在一定的差異。通過順式作用元件分析發現，陸地棉RTE基因啟動子區含有多個生長發育激素和逆境響應元件，說明其可能在植物生長發育及抵御非生物脅迫逆境中發揮著較大作用。本研究通過轉錄組表達模式分析發現，陸地棉RTE基因在不同組織和非生物脅迫下的表達量存在差異，并且qRT-PCR結果證明GhRTE6對鹽脅迫具有一定的調控作用。本研究結果可為今后探索棉花RTE基因的功能及分子機制提供參考。

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