椎間盤退變中外泌體的功能、作用機制和臨床治療

苗鴻雁 馮晶 劉偉 杜世陽 楊若鵬 尹志源 肖子鈞 徐磊

下腰痛是一種常見的癥狀，多由軟組織損傷、骨質疏松、腫瘤、感染、骨折和非特異性疼痛等引起，而臨床上 40%～50% 的下腰痛是由腰椎間盤退變 ( intervertebral disc degeneration，IVDD ) 引起的[1]。導致 IVDD 的確切病因尚不清楚，但隨著機械負荷、衰老、肥胖、慢性應激等危險因素的增加，IVDD 的患病率呈逐年上升趨勢[2]。臨床治療 IVDD 的方法主要分為保守治療和手術治療。保守治療包括臥床休息、藥物治療、牽引、針灸推拿等物理療法[3]，這些方法在緩解癥狀方面有著一定的作用，但不能逆轉 IVDD[4]。手術治療旨在切除退變的椎間盤、消除根性疼痛，但由于脊柱生物力學的改變，常伴有明顯的后遺癥或鄰近椎間盤的再突出?；谝陨媳尘?，阻止或逆轉IVDD 并恢復其原有的結構與功能成為亟需解決的問題。近年來，生物活性分子注射、細胞治療、組織工程和基因治療等新型治療方法成為研究熱點[5]，如生長因子和富血小板血漿 ( platelet-rich plasma，PRP ) 注射、干細胞移植等。但由于倫理學及社會因素限制，給藥的劑量和方式、細胞的選擇、療效的評估、高成本等問題成為新型治療不可避免的障礙。外泌體 ( exosomes，exos ) 是由細胞分泌的裝載有多種生物活性物質的脂質雙分子層囊泡，是細胞間進行信息交流的重要手段。外泌體能夠傳遞大量生物活性物質到受損的細胞[6]，在維持椎間盤結構與功能的穩定方面發揮著重要的作用，目前已被廣泛應用于 IVDD 的研究。筆者回顧了近 5 年來對外泌體的研究，結合熱點話題分析總結了不同細胞來源的外泌體治療 IVDD 的機制，以期為后續的深入研究提供新的思路。

一、外泌體的產生和功能

外泌體是細胞外囊泡 ( extracellular vesicles，EVs ) 的一個亞群，直徑在 40～160 nm 之間[7]，由脂質雙分子層包裹蛋白質及多種核酸如 DNA、長鏈非編碼 RNA ( long noncoding RNA，LncRNA )、環狀 RNA ( circular RNA，circRNA )、微小 RNA ( microRNA，miRNA )、信使 RNA( messenger RNA，mRNA ) 等組成。外泌體幾乎存在于所有的細胞、組織和體液中，如血漿、尿液、唾液、關節液、母乳[8]。細胞外成分隨著質膜的內陷與細胞表面蛋白一起進入細胞內，并在反式高爾基體網絡和內質網的參與下形成早期分選內涵體 ( early sorting endosome，ESE )；ESEs 成熟為晚期分選內涵體 ( late-sorting endosome，LSE )；LSE 第二次內陷裝載細胞內成分，胞內體囊泡( intraluminal vesicles，ILVs ) 產生；包含有 ILVs 的多囊泡體 ( multivesicular body，MVB ) 可直接與溶酶體融合發生降解，另一條途徑便是和質膜直接融合釋放內容物形成外泌體[9]。

外泌體的分子結構、內容物的組成和含量取決于親本細胞類型、表觀遺傳修飾和眾多環境因素，從而使其在各種組織環境及刺激下發揮不同的作用。外泌體最早發現時被認為是細胞的廢棄物，但越來越多的證據表明，外泌體包含的各種細胞成分通過運輸到受體細胞內發揮著重要的調節作用，甚至可作為載體將藥物等治療性物質遞送到難以到達的組織中[10]。

二、外泌體可通過多種生物學機制改善 IVDD

1. 抑制內質網應激、調控增殖和凋亡：凋亡程序的過度激活導致的椎間盤細胞的死亡是 IVDD 的重要原因，因此抑制髓核的凋亡、促進增殖在防治 IVDD 中至關重要。Zhu 等[11]將骨髓間充質干細胞 ( bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC ) 來源的外泌體與白細胞介素-1β ( interleukin-1β，IL-1β ) 誘導的小鼠退變髓核細胞 ( nucleus pulposus cells，NPCs ) 共同培養后，發現BMSCs-exos 包裹的 miR-142-3p 可通過靶向 MAP3k 混合譜系激酶 3 ( mixed lineage kinase 3，MLK3 ) 抑制絲裂原活化蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 信號通路，抑制 IL-1β 誘導的 NPCs 的凋亡。人母系蛋白 3 ( matrilin-3，MATN3 ) 可促進轉化生長因子-β( transforming growth factor-β，TGF-β ) 的解離和活化。Guo 等[12]首次發現人尿源性干細胞 ( urine-derived stem cell，USC ) 外泌體能通過轉運 MATN3 蛋白提升 TGF-β 的含量，通過激活 TGF-β / SMAD 蛋白 ( drosophila mothers against decapentaplegic protein ) 途徑和磷脂酰肌醇 3-激酶( phosphoinositide 3-kinase，PI3K ) - 蛋白激酶 B ( protein kinase B，AKT ) 通路來發揮促進細胞外基質 ( extracellular matrix，ECM ) 合成和 NPCs 增殖的作用。

機體缺氧、饑餓、炎癥、蛋白質糖基化、Ca2+水平紊亂等均可在椎間盤中通過阻礙蛋白質的折疊或修飾誘發內質網應激，嚴重或長期的內質網應激過度激活未折疊蛋白反應 ( unfolded protein response，UPR )[13]，從而造成細胞的凋亡。轉錄激活因子 6 ( activating transcription factor 6，ATF6 ) 是 UPR 中的關鍵蛋白，受到刺激時可發揮轉錄因子活性，使內質網應激相關基因 C / EBP 同源蛋白 ( C / EBP homologous protein，CHOP )、葡萄糖調節蛋白 78 ( 78-kDa glucose regulated protein，GRP78 ) 和 X 盒結合蛋白 1( X boxbinding protein 1，XBP1 ) 表達上調，CHOP 是內質網應激誘導細胞凋亡信號通路中的重要介質，它的積累促進凋亡相關基因的表達以及蛋白酶的活化[14]。Xie 等[15]利用叔丁基過氧化氫處理終板軟骨細胞 ( endplate chondrocyte，EPCs )，發現間充質干細胞 ( mesenchymal stem cell，MSC )來源的外泌體中的 miR-31-5p 可靶向負調控 ATF6，抑制EPCs 的凋亡和鈣化。Xiang 等[16]通過蛋白質印跡實驗和qRT-PCR 檢測發現壓力培養的 NPCs 中內質網應激標志物的表達增加，然而 USCs-exos 通過 AKT 和 ERK ( extracellular regulated protein kinases ) 信號通路顯著抑制 UPR 的激活，降低 CHOP 表達，顯著抑制細胞凋亡和延緩 IVDD 進程。Liao 等[17]用晚期糖基化終末產物 ( advanced glycation end products，AGEs ) 誘導人 NPCs，同樣發現 BMSCs-exos 通過降低 CHOP 表達水平，抑制 caspase-12 和 caspase-3 的活化，進一步證實了外泌體抑制內質網應激介導的凋亡可能是延緩甚至逆轉 IVDD 的有效途徑?？傊?，外泌體可通過調節經典信號通路的活性及內質網相關基因的表達來維持椎間盤細胞數量的穩定，在椎間盤的再生和修復中發揮著重要作用，但具體的分子機制還需要進一步研究。

2. 抑制炎癥反應，減少細胞焦亡：退變椎間盤細胞產生的炎癥因子不僅可以誘導炎癥細胞的聚集，還能上調基質分解代謝酶。細胞焦亡是一種與炎癥相關的細胞死亡方式，常伴有各種促炎細胞因子的分泌[18]。NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3 ( NOD-like receptor thermal protein domain associated protein，NLRP3 ) 炎癥小體是一種多蛋白復合物，可以招募并活化 caspase-1，進而激活下游的 GSDMD ( Gasdermin D ) 蛋白，后者可結合膜脂使孔道形成，引起胞膜的破裂和內容物的釋放，是介導細胞焦亡的直接效應分子[19]。此外，caspase-1 可切割 pro-IL-1β 和pro-IL-18[20]，在 IL-1β 和 IL-18 的成熟和分泌以及細胞焦亡中均發揮重要的作用。

Zhang 等[21]在脂多糖誘導的 NPCs 模型中發現NLRP3、caspase-1、GSDMD 表達水平均顯著增加，下游細胞因子 IL-18 和 IL-1β 隨之增加。當與 MSCs-exos 共培養后這一現象發生了逆轉。進一步研究證明，MSCs-exos中的 miR-410 可直接結合 NLRP3 mRNA，調控 NLRP3 /caspase-1 的級聯反應，抑制了 NLRP3 介導的細胞焦亡。Yuan 等[22]發現人臍帶 MSC 來源的外泌體中的 miR-26a-5p通過靶向甲基化轉移酶 ( methyltransferase，MRTTL14 ) 阻斷甲基化修飾來降低 NLRP3 表達水平，抑制 NPCs 的炎癥反應和焦亡。Xing 等[23]提取了脂肪 MSC 的外泌體，并與熱敏性脫細胞細胞外基質水凝膠偶聯制備成可注射外泌體功能化細胞外基質水凝膠 ( dECM@exo )，與NPCs 共培養后，發現其能調控基質金屬蛋白酶 ( matrix metalloproteinases，MMPs ) 的表達，并通過減輕炎癥反應抑制細胞焦亡；此外，在大鼠模型的影像學結果中也觀察到退變的椎間盤得到改善。該工程化外泌體為 IVDD 治療提供了新的策略，可進一步開發進行臨床研究。綜上所述，NLRP3 的活化可放大炎癥反應、促進 NPCs 的焦亡，而外泌體可通過抑制 NLRP3 的激活及其產物的活性有效地保護 NPCs。

3. 抵抗氧化應激 ( oxidative stress，OS )：OS 是指細胞氧化與抗氧化失衡 ( 偏向于氧化 )，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物的過程因子的表達，引起椎間盤細胞的凋亡和 ECM 成分的改變[24]?；钚匝踝鳛檠趸瘎┏Ｓ糜诩毎?OS 的檢測，它是一類不穩定、高活性分子，主要包括 O2-、OH-、H2O2、OCl-和 NO。椎間盤微環境的紊亂及外源性的刺激，如壓力、促炎因子、高氧、高糖等，促進椎間盤中活性氧的產生，誘導 OS 并參與基質代謝、炎癥、焦亡和凋亡等多種病理機制[25]。

Xia 等[26]通過共聚焦顯微鏡觀察發現 NPC 中線粒體可攝取 BMSCs-exos，并通過基因本體論 ( gene ontology，GO ) 分析顯示多種線粒體相關蛋白在 BMSCs-exos 中富集，這提示了 BMSCs-exos 可能通過維持線粒體功能，抑制線粒體活性氧介導的 TXNIP ( thioredoxin interacting protein )-NLRP3 的活化，減少 H2O2培養下大鼠 NPCs 的炎癥和凋亡，從而抑制 IVDD。Hu 等[27]用 BMSCs-exos 處理壓力誘導的大鼠 NPCs，通過檢測活性氧水平以及線粒體膜電位，證明了 BMSCs-exos 通過抑制 OS，保護 NPCs 免受壓力引起的線粒體損傷，減少細胞凋亡。轉錄因子 NF-E2相關因子 2 ( nclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2 )可促進抗氧化基因表達，通過激活 Nrf2 信號增加內源性抗氧化酶的合成，是抵抗 OS 的重要策略[24]。Xu 等[28]采用 H2O2處理小鼠 NPCs 建立 OS 模型，發現富血小板削減來源的外泌體中的 miR-141-3p 可降低 NPC 中 NLRP3、GSDMD、caspase-1 及炎癥因子的表達水平，進一步的結果表明 miR-141-3p 通過靶向結合 Keap1 mRNA 的 3’UTR使其降解，促使 Nrf2 從 Keap1-Nrf2 復合物中釋放并轉位到細胞核中，實現抗氧化的生物學功能，從而抑制 OS 介導的炎癥和焦亡，延緩 IVDD。

OS 是 IVDD 發生發展的重要原因，能夠引起 NPCs 凋亡、ECM 分解代謝、炎癥反應及細胞焦亡等一系列病理過程。外泌體以抗氧化應激作為靶點治療 IVDD 或將成為未來非常具有前景的研究方向。

4. 調節細胞自噬：自噬是細胞在營養和能量缺乏、蛋白質積累、應激狀態等情況下自我消化的過程，主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[29]。巨自噬為常見的自噬類型，是將受損細胞器、蛋白質或病原體包裹在自噬體中，與溶酶體融合形成自噬溶酶體降解包裹的內容物，以實現細胞對自身代謝和能量的更新[30]。隨著年齡的增長，退變椎間盤組織中的受損蛋白質和細胞器的積累、營養剝奪、缺氧等上調自噬，通過細胞內自我降解抵御這種不利改變[31]。

Xiao 等[32]利用脂多糖誘導大鼠 NPCs，通過 RT-qPCR和 ELISA 檢測發現 BMSC-exos 可減少腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α )、IL-1β 的釋放，通過激活 AKT-mTOR 信號通路促進自噬，從而減少 NPC 凋亡。Shi 等[33]分離培養大鼠 NPCs，通過血清剝奪實驗模擬人體椎間盤低血供病理模型，進一步研究發現 BMSCs-exos中 miR-155 通過靶向 Bach1 上調 HO-1 表達，從而激活自噬，抑制 NPCs 的凋亡。Chen 等[34]首次發現人脂肪 MSC來源的外泌體 miR-155-5p 可靶向 TGF-β Ⅱ 型受體，促進 NPC 自噬并減少細胞焦亡。軟骨終板干細胞 ( cartilage endplate stem cells，CECs ) 在維持軟骨終板 ( cartilaginous end plate，CEP ) 結構和功能的完整性方面具有重要的作用，通過促進 NPCs 再生和調節椎間盤的穩態有效控制IVDD。Luo 等[35]通過分析正常 CEP 來源的外泌體 ( CEP N-exos ) 和叔丁基過氧化氫 ( tert-butyl hydroperoxide，TBHP )誘導的退變 CEP 來源的外泌體 ( CEP D-exos ) 的生物信息學差異，發現 CEP N-exos 通過激活 PI3K / AKT / mTOR信號通路增強自噬，并通過體內和體外實驗證實了 CEP N-exos 可改善 IVDD。Li 等[36]將人骨髓 MSC 來源的外泌體與 IL-1β 誘導的退變纖維環細胞共培養，發現 BMSCsexos 可通過抑制 PI3K / AKT / mTOR 信號通路介導的自噬來抑制纖維環細胞的炎癥和凋亡?？傊?，外泌體可通過調節椎間盤細胞的自噬來響應外界不利因素的刺激，從而有效地減輕 IVDD。

5. 維持 ECM 的穩定：長期乳酸的積累會降低 CEP 通透性，改變 IVDD 中 pH 值，可破壞 ECM 的代謝平衡[37]。外泌體在酸性環境中仍能保持良好的生物活性，彌補了干細胞移植治療 IVDD 的不足，并代替發揮重建椎間盤結構的作用。Li 等[38]發現在酸性環境中，BMSCs-exos 可維持軟 ECM 的穩定，促進 Ⅱ 型膠原和蛋白聚糖的表達，下調 MMP-13 水平，保護 NPC 免受酸性環境誘導的凋亡，延緩 IVDD。Hingert 等[39]獲取了嚴重下腰痛患者的退變椎間盤組織，在 3D 細胞培養模型中與人間充質干細胞( human mesenchymal stem cells，hMSC ) 來源的細胞外囊泡共培養，發現 2～4 周后活細胞的數量增加超過 50%，并且 hMSC 來源的細胞外囊泡可誘導退變的椎間盤軟骨和ECM 的早期形成，通過對抗椎間盤微環境中炎癥細胞因子和 MMPs 的破壞性作用來促進 IVDD 修復。由此可見，外泌體能夠保護 ECM，且具有良好的穩定性，在退變椎間盤不利的微環境中仍可發揮較好的治療作用。

6. 促進細胞的分化：干細胞移植作為治療 IVDD 的新型細胞治療方法，可直接解決退變椎間盤細胞減少的問題，然而干細胞的低存活率、倫理學及社會因素等限制了其臨床普及[40]。已有大量研究表明，外泌體可促進細胞的分化，在繼承了干細胞作用的基礎上，不受退變椎間盤不利微環境的影響，受到了越來越多的關注[41-43]。

Lan 等[41]發現 NPC-exos 培養的 MSCs 中 Ⅱ 型膠原、聚集蛋白聚糖和 Sox9 的表達均顯著增加，同時 NPC 標志物 CD24、KRT19 蛋白表達水平增加，證明了 NPCs-exos可促進 MSCs 向 NP 樣細胞轉化并遷移，且在此過程中Notch11 通路表達下調。GATA 結合蛋白 4 ( DATA binding protein 4，GATA4 ) 是一種 DNA 結合鋅指轉錄因子，可以調節多種生物學過程，在促進增殖、成骨分化等方面發揮著重要作用[44]。Luo 等[42]通過體內和體外實驗，證實了 SD 大鼠軟骨終板的干細胞 ( CESCs ) 通過自分泌機制激活缺氧誘導因子-1α ( hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α ) /Wnt 信號通路，增加 GATA4 和 TGF-β1 的表達，從而促進CESCs 向 NPC 的侵襲、遷移和轉分化。Zhang 等[43]發現髓核 MSC 來源的外泌體中 miR-15a 可通過 PI3K / AKT 和Wnt 3a / β-catenin 信號軸下調 MMP-3 等表達，維持了 ECM蛋白的平衡，促進了髓核 MSC 的成軟骨分化。

隨著細胞治療、基因工程等新型治療方法的不斷深入，誘導干細胞分化成特定的組織細胞從而治療退行性相關疾病一直是研究熱點。外泌體能夠促進干細胞向 NPC轉化，或可為 IVDD 患者提供新的有效的治療方式。

7. 抑制椎間盤內血管的生成：健康的椎間盤是無血管和神經的組織，在 IVDD 過程中，纖維環破損削弱了椎間盤的物理屏障作用，導致血管神經長入，促進免疫細胞和炎癥因子浸潤，從而打破了椎間盤的穩態，引起椎間盤源性下腰痛。因此抑制椎間盤內血管的侵入在緩解疼痛、提高患者的生活質量方面有著重要的意義。利用不同壓力負荷培養大鼠脊索細胞 ( notochordal cell，NC )，發現 0.5 MPa 壓力培養下 NC-exos 可抑制內皮細胞血管生成。通過進一步的體外遷移實驗、小血管形成實驗和增殖實驗發現 0.5 MPa /NC-exos 的 miR-140-5p 可通過調節下游的 Wnt11 / β-catenin通路來抑制血管的生成[45]。Sun 等[46]將退變的纖維環細胞來源的外泌體 ( annulus fibrosus-exos，AF-exos ) 與人臍靜脈內皮細胞 ( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs )共培養，發現退變的 AF-exos 通過促進 HUVECs 遷移和 IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13、血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF ) 的表達發揮促血管化的作用，而未退變的纖維環細胞可通過分泌外泌體來阻止該現象的發生。目前，椎間盤血管化的機制仍有待深入探討，而外泌體包裹豐富的生物活性物質，作為細胞間信息交流的重要載體發揮抑制椎間盤內血管生成的作用，在延緩 IVDD 的進程中具有巨大的潛力。

三、總結與展望

綜上所述，外泌體作為促進 IVDD 再生和修復的一種潛在的新型無細胞療法，包含其來源細胞的各種生物成分，且具有低免疫原性、生物屏障的滲透性、低細胞毒性和良好的穩定性[47]，在眾多研究中已顯示出了有效的促增殖和抗凋亡、抗 OS、抗炎、維持 ECM 穩態、促進分化和抑制血管再生的能力。然而，外泌體治療 IVDD 的研究仍存在著許多難題。外泌體的分泌是一個高度受調控的過程，其組成和功能受源細胞的類型和培養條件的不同而有所差異，所以需要統一的標準來規劃外泌體的生產、純化和分離[48]；另外，外泌體的儲存、轉運對未來進一步的應用同樣至關重要[49]。遞送方式顯著影響外泌體在體內的存在時間，體外實驗多采用單次遞送相同濃度的外泌體分析探討其作用機制，但不能保證外泌體可在體內發揮長期效應，因此外泌體的最佳給藥途徑、給藥劑量、合適的給藥頻率、方法和療效的評估值得后續的深入研究[50]。外泌體的治療效果主要來自于其包裹的物質如蛋白質、 miRNA，具體作用機制還需要進一步闡明。目前已有大量的研究結果證實了不同的 miRNA 對受體細胞的調控作用，其它外泌體成分如 LncRNA、circRNA 和蛋白質也有著廣闊應用的前景，對 IVDD 的作用有望進一步去發掘。