大豆疫霉根腐病的防治及研究進展

周 揚 韓昕君 傅豪 李志輝

（漯河市農業科學院 河南漯河 462000）

大豆［Glycine max（L.）Merr.］不僅是一種重要的農作物， 也是重要的工業和飼料原料。 在大豆受侵發生的主要30 多種病害中[1]，大豆疫霉根腐?。≒hytophthora root rot,PRR）是其中危害嚴重的病害之一。該病害發生于大豆的整個生育期， 其病原菌侵染植物的根、莖、葉和豆莢，引起莖部腐爛、植株矮化枯萎甚至死亡。 大豆疫霉根腐病能造成25%～50%的產量損失，在低溫和高降雨年份為50%～80%，嚴重的地塊甚至絕產[2-3]。 目前對于PRR 的抗性研究主要是利用新發掘的抗病基因和已知抗病基因培育抗病品種，但病原菌的致病機制、田間抗性機制與抗病機制之間的關系這些問題仍需解決。 因此，了解大豆疫霉根腐病的發生危害、抗源篩選、抗性機制等尤為重要。

1 PRR 研究概述

1.1 PRR 的發生與危害

PRR 由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起，于1989 年在我國黑龍江省地區被發現[4-5]，1991 年我國科學家沈崇堯首次分離出大豆疫霉菌[6]。 大豆疫霉根腐病在排水不佳、 地表易積水的黏性土壤中發生最為嚴重[7]，大豆疫霉菌使幼苗猝倒、 根腐與莖腐， 最后造成植株枯萎死亡， 疫霉菌的侵染還大大降低植株對其他病原菌的抵抗性[8]。 該病害對大豆產量造成嚴重影響， 在美國1996-2010 年共造成（0.68～1.55）×109kg 的損失[9]。 我國黑龍江每年受疫霉菌侵染的面積高達150 000 hm2[9]，PRR 在全國呈蔓延趨勢[10]。

1.2 PRR 病原特征

大豆疫霉菌屬于卵菌綱疫霉屬，有至少59 個生理小種，還存在其他致病型[11]。 大豆疫霉菌菌落呈白色，形態均勻，主要以氣生菌絲的形式存在，幼齡期菌絲無隔多核，隨著生長變成分隔，菌絲體為多核[12]，老齡期形成結節狀或不規則的菌絲膨大體， 呈大小不等的橢圓形或球形。 大豆疫霉菌既可以通過產生孢子囊、游動孢子和厚垣孢子的形式進行無性生殖，又可以通過分化出卵原細胞和雄器進行有性生殖。卵孢子在適宜的條件下萌芽產生芽管， 并進一步發展成為菌絲、 孢子囊。 菌絲生長的最適溫度為25～28℃，最低5℃，最高35℃，因此PRR 在10℃時發病率最低，在25℃發病率最高[13]。 大豆疫霉菌在馬鈴薯培養基（PDA）上生長緩慢，在LBA、CA 和含有復雜營養元素的V8 培養基上生長較快[14]。

2 PRR 的發病特征

PRR 是典型的土傳性真菌病害， 在整個生育期均可發生， 并能為害大豆的任何部位， 引起種子腐爛、出苗前死亡和出苗后鉤壯期死亡[15]。 在種子萌發前，引起種子變褐腐爛；種子萌發后，引起大豆下胚軸系統性變褐腐爛；出苗后，近地根莖部出現褐色水漬狀病斑，葉片變黃萎蔫，根莖變褐軟化，引起幼苗萎蔫或死亡，此時期是幼苗最易受侵染的時期；成株期受侵染植株表現為葉片由下部到上部逐漸變黃并萎蔫， 分枝基部發病出現黑褐色病斑， 莖中空易折斷，豆莢基部初期也會出現水漬狀病斑，最后種子失水干癟，籽粒萎縮，完全失去使用價值。

3 PRR 的防治

疫霉菌是一種能對大豆造成循環侵染的病害，其能在土壤中越冬， 待溫度濕度適宜時釋放孢子進行侵染[16]。 因此探索長期有效的防治方法尤為重要，目前主要有以下幾種防治措施。

3.1 栽培防治

防治PRR 最主要的栽培措施是控制土壤濕度[17]，對于低洼地塊可采用及時排水或高壟栽培進行管理[18]。 另外，由于大豆疫霉菌的游動孢子易通過水分進行傳播，尤其在土壤通透性和排水性降低時大豆疫霉病更易發生，因此可以通過更改耕作方式、疏松土壤、建立高效的排水系統來減輕根腐病的發生[19]。

3.2 化學防治

PRR 可為害大豆任何生育階段， 藥劑防治比較困難，但利用高效、低毒、低殘留的殺菌劑能達到短期防治效果[20]，常用的包括甲霜靈、精甲霜靈和惡霜靈，一般通過藥劑拌種的方法操作[21]，方法為在種子中加入種子質量0.3%～25.0%的甲霜靈粉劑拌種。 由于甲霜靈能夠通過抑制蛋白質和核酸的合成從而對卵菌綱產生影響，因此是一種常用的高效殺菌劑。 藥劑噴霧處理也可有效控制病情，植株生長發育后期感病時可采用噴藥或澆灌的方式，可選用58%甲霜·錳鋅濕性粉劑600 倍液、69%安克·錳鋅可濕性粉劑900 倍液等[22]。 此外，將甲霜靈、烯酰嗎啉、霜脲氰和嘧菌酯兩兩復配形成的配比混合物， 也能顯著增強其對大豆疫霉的抑制[23]。

3.3 生物防治

生物防治與化學防治相比更加安全， 對環境污染小， 目前發掘的能有效防治PRR 的生物藥劑有“818”發酵液、45 mg/L 的Harpins 蛋白、恩益碧種衣劑[24]、嗜線蟲桿菌、亮盾種衣劑等，其中Harpins 蛋白[25]、嗜線蟲桿菌[26]、亮盾種衣劑[27]的防治效果最好。然而生物制劑控制病害見效較慢， 并且不易批量生產，因此不能作為主要防治措施。

3.4 培育抗耐病品種

由于殺菌劑、 田間排水等措施不能有效控制PRR，抗耐病的大豆不僅成本低廉，還有較強的控制作用， 因此培育和種植抗病品種是最為經濟有效的方法[28-30]。 大豆與大豆疫霉菌的相互作用符合基因對基因假說，疫霉具有高度遺傳變異的特點，抗病基因可完全抵抗病害， 但新的毒力小種的出現會導致抗病品種的抗性喪失[31-33]。 在我國，不同疫霉菌群體多樣性是復雜的，生產上為了延長品種的抗性年限，最為理想的是利用擁有多個抗性的單基因系品種。 目前研究表明， 河南大豆品種是優質的對PRR 具有抗性的種質資源[34-35]，許多品種具有廣譜抗病性，其中大豆品種鄭97196 是國內篩選到的優異抗源之一，其對大豆疫霉菌株HeN35 表現為完全抗性[36-38]。

從以上幾種防治措施來看， 單一的方式都具有一定的缺點，比如田間管理成本較高，栽培措施不能從根本上控制病害； 化學防治中長期使用藥劑可能使大豆疫霉對其產生抗病性； 由于大豆疫霉的病原變異性高，品種的抗性不能一直持續。 因此，結合單一防控措施，多方位綜合治理，能夠有效控制PRR 的發生及蔓延。

3.4.1 PRR 抗性類型 大豆對PRR 的抗性有2 種，一種是受抗性基因（Rps）控制的小種?；剐?，又稱為質量抗性，符合“基因對基因”假說原理，大豆疫霉抗性基因（R）與無毒基因（Av）非親和互作，介導侵染部位的過敏性壞死反應 （Hypersensitive Response,HR） 和細胞程序性死亡 （Programmed Cell Death，PCD），從而阻止病原菌的定殖和擴展[3]；另一種是由多個基因（Quantitative Trait Loci,QTL） 控制的數量抗性，屬于非小種?；?，并且無法介導HR 反應，該類型對疫霉菌病原體具有廣譜抗性， 但抗性較弱。 目前，質量抗性為研究的重點[8]。

3.4.2 PRR 抗源篩選 抗性資源的篩選是防治PRR 的基礎，也是抗性研究的關鍵。 我國擁有豐富的大豆種質資源，安徽、四川、湖北、江蘇存在的抗性資源較多[39]。 南方的大豆種質抗性優于北方，江蘇、河南、安徽的抗病資源更為豐富，黃淮海地區的抗性種質資源最多[40-42]。 李永剛等用游動孢子接種法，利用7 個菌株對生產上常用的51 個大豆品種進行鑒定，對所有7 種供試毒性型均具有抗性的有9 個，占17.6%，均感病的有2 個，占3.9%[43]。任海龍等采用下胚軸傷口接種法用大豆疫霉菌株Pm14 對南方部分地區江西、 湖南和廣西的273 份野生大豆資源進行篩選， 其中3.30%表現為抗病，16.48%表現為中間反應類型[44]。 程艷波等采用下胚軸創傷接種法，利用大豆疫霉菌PGD1 菌株鑒定華南省份631 份大豆種質資源對PRR 的抗性， 分析出能夠同時抗7 個不同毒力的大豆疫霉菌株的4 份種質[45]。 黃婧通過224 份大豆微核心種質對14 個菌株的抗性研究發現，有18 份種質擁有最廣抗譜，能抗8～11 個不同的菌株[46]。楊曉賀等通過對13 個主栽品種進行大豆疫霉菌1 號小種的盆栽接種和大田接種抗性分析試驗， 發現合豐55 和墾豐16 具有良好的抗性，是適合三江平原地區種植的抗PRR 的優良品種[47]。 劉淼等利用離體葉片接種法對黑龍江省的620 份野生大豆資源進行大豆疫霉菌1 號、3 號和4 號生理小種的抗病性鑒定，獲得雙抗資源23 份、三抗資源4 份[48]。

3.4.3 PRR 抗性基因發掘 目前國內外已發現分別定位在9 條染色體上的30 個抗病基因：Rps1、Rps7、Rps9、the WaseshirogeRps gene、RpsYD25、RpsYD29、RpsUN1、RpsWY和RpsQ定位于3 號染色體；Rps2和RpsUN2定位于16 號染色體；Rps3、Rps8和RpsSN10定位于13 號染色體；Rps4、Rps5、Rps6、Rps12和RpsJS定位于18 號染色體；Rps10定位于17 號染色體；Rps11定位于7 號染色體；RpsYB30定位于19 號染色體；RpsZS18定位于2 號染色體；RpsSu定位于10 號染色體[49]。

R 蛋白、轉錄因子（Transcription Factors,TF）和小RNA 都能介導疫霉的抗性， 其中R 蛋白中的NBSLRR 基因基本上都聚集在Rps 位點上， 因此推測NBS-LRR 基因可能與抗PRR 有關。 Rps2 位點富含9 個NBS-LRR基因，從Rps1k 位點分離出4 個CCNBS-LRR型同源基因，Rps1k-1和Rps1k-2轉基因大豆植株能介導對大豆疫霉菌的抗性[50-51]。 與抗病相關的轉錄因子有WRKY 家族、MYB 家族、HSP 蛋白等， 其中WRKY 家族是主要的轉錄因子。 在高抗PRR 品種綏農10 中，GmWRKY31 能與GmHDL56 共同作用調控抗病基因GmNPR1 的表達從而提高抗性[52]。 將一個新的乙烯響應因子GmERF5 過表達，能夠增強轉基因大豆對疫霉菌的抗性[53]。 小RNA 包括miRNAs 和siRNAs，miRNA 參與大豆對大豆疫霉菌所有的抗病類型[54]，在大豆被侵染的根中由于熱失活誘導產生的miR393 和miR166 共同參與大豆的基礎防御反應[55]。 另外gma-miR1507a 能通過調節靶基因GmRGA4的表達來調控大豆對大豆疫霉菌的抗性[56]。小RNA 在大豆抗疫霉根腐病中也起著重要的作用，為大豆抗性育種提供了新的方向。

4 展望

PRR 對大豆生產危害性極大， 雖然目前對病癥的研究愈加重視，但仍有許多問題需要解決。 農業生產方面的防治工作主要是加強田間管理和利用一些殺菌劑，但生產上工作量繁重，殺菌劑藥效期有限，并且傳統育種上的常規方式防治病害缺陷較大。 因此近些年越來越多的研究傾斜于基因育種。 栽培抗性大豆是其中一種防治措施， 通過遺傳學分析已定位、鑒定出30 個抗性位點基因，并且對于抗性的基因組學、小RNA 及蛋白質組學方面也進行了深入的研究。 還有一個重要的工作是基因功能驗證，由于大豆遺傳轉化較難，主要是利用大豆發狀根轉化、VIGS和CRISPR/Cas9 體系進行基因功能鑒定， 遺傳轉化系統需要更加穩定、高效。目前PRR 抗性研究的瓶頸主要是關于基因組學、遺傳學、分子生物學、代謝組學、蛋白質組學、小RNA 及表觀遺傳組學等方面共同串聯， 植物激素傳導及代謝通路的調控網絡也很復雜，需要進一步深入研究。