黃曲霉毒素誘發奶牛乳腺炎的潛在風險

翟長樂，陳 鈺，王友信，袁正寧，穆興偉，張西鋒*

（1.青島農業大學動物醫學院，山東青島 266109；2.萊州市柞村畜牧獸醫站，山東萊州 261429）

黃曲霉毒素是一類來自于霉菌中的劇毒物質，常見于霉變的玉米、花生、豆類、堅果類等糧油作物中，且污染范圍還在不斷擴大。在目前已知的二十多種天然黃曲霉毒素中，根據化學結構以及紫外線照射所發熒光的區別，可將黃曲霉毒素分為B1、B2、M1、M2、G1、G2 等多種亞型，而在此類衍生物之中，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1)毒性最大，并被世衛組織歸類為Ⅰ類致癌物[1]。AFB1 自發霉作物進入奶牛體內，嚴重影響了奶牛的生命健康和乳制品的食品健康安全。而乳腺炎作為一種奶牛常見的疾病，主要表現為乳腺組織炎癥、紅腫、疼痛等癥狀，誘發原因主要是細菌感染，但近年來，有研究表明飼料中的AFB1 也會對奶牛乳腺炎的誘發有一定作用[2]，本文主要綜述AFB1 毒理作用，乳腺炎的致病機理及兩者相關性研究進展，以期為預防和治療奶牛乳腺炎疾病提供參考。

1 黃曲霉毒素的毒理作用

1.1 黃曲霉毒素的產生條件

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的一種雙呋喃環類毒素，霉菌的產生條件寬泛、分布范圍較廣，當周圍環境水分含量高于12%時即可在谷類作物、油料作物中大量生長繁殖，同時，大多數霉菌在室溫條件下繁殖速度較快，且在25～32℃均可產毒，此外，大多數霉菌穩定性較強，極其耐熱，不易清除[3]，尤以花生、玉米、棉籽等奶牛的飼料原材料污染最為嚴重，奶牛極易誤食而被感染。

1.2 黃曲霉毒素B1 的危害

黃曲霉毒素B1 在許多物種中表現出肝毒性、肝癌、致突變和致畸作用。高劑量的AFB1 會導致動物發生急性中毒甚至死亡，臨床表現為食欲不振、嘔吐、體重減輕、便血、肝中毒及肝壞死等[4]。而低水平長時間的AFB1 攝入會導致機體慢性中毒，動物的生長受到影響，臨床癥狀有肝硬化、骨骼畸形、生長遲緩等，嚴重的會引起癌癥。此外，AFB1 還會誘導機體腫瘤的產生與擴散，干擾機體細胞DNA、RNA 的合成與代謝，導致腫瘤壞死因子α 的mRNA 表達水平升高，從而破壞蛋白質、脂肪的合成與分泌，影響線粒體以及溶酶體的結構和功能。AFB1 羥化后會分泌到乳，危害犢牛，污染奶源，影響乳制品質量進而危害人類健康。

1.3 黃曲霉毒素B1 的免疫毒性

黃曲霉毒素B1 會極大影響動物免疫系統的正常運行，嚴重損傷免疫器官的結構，導致其功能降低。長時間的AFB1 暴露會使免疫器官中實質細胞及淋巴細胞的凋亡百分比及細胞內的核碎片數量大幅增加。同時，脾臟脾小體以及動脈周圍淋巴鞘中空泡明顯增多，紅髓與白髓間界限模糊；胸腺皮質區網狀細胞形態結構不清，髓質區毛細血管擴張充血；法氏囊髓質組織細胞排列松散，且淋巴濾泡間有纖維結締組織增生[5]。AFB1對體液免疫和細胞免疫也會造成一定損害。長期攝入AFB1 導致機體血液中紅細胞和白細胞數目顯著減少，免疫球蛋白水平明顯下降，補體活性受到破壞，引發體液免疫功能抑制。同時，樹突狀細胞的抗原遞呈能力嚴重失調，抑制T 細胞的分裂增殖，T 細胞亞群（CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+) 的百分比也明顯下降，影響機體的的細胞免疫功能[6-8]。

1.4 黃曲霉毒素B1 的生殖毒性

黃曲霉毒素B1 對動物的生殖系統也有一定的傷害，公小鼠攝入含有高水平AFB1 的飼料后，嚴重影響睪丸發育，睪丸間質細胞功能受損并且大量凋亡，誘導睪丸萎縮和結構紊亂，生精小管干癟，生精細胞數量減少。同時，睪酮合成受損，影響精子發生，附睪尾中精子量顯著減少，異常精子量顯著增加，精子質量降低，雄激素水平下降，繁育能力降低[9,10]。母小鼠懷孕期間食用飼料后，采食量降低、產子數減少、弱子數增多，AFB1 通過阻斷卵母細胞成熟的細胞周期進程，影響囊胚的形成，胚胎發育受損，造成胚胎畸變，嚴重時會引起母小鼠失配或流產，同時，卵母細胞過度自噬，干擾卵巢卵泡發育，卵母細胞透明帶軟化，顆粒細胞退行性變，導致排卵卵泡數量減少，甚至完全耗盡，從而嚴重損害雌性生殖健康[11,12]。

1.5 黃曲霉毒素B1 對腎、肝、腸的影響

黃曲霉毒素B1 會對腎、肝、腸造成不同程度的損害，導致機體的物質代謝、排泄機能紊亂。長期服用AFB1 導致腎臟細胞脂質過氧化、細胞膜受損，腎臟的抗氧化能力降低，血清中肝酶含量升高，造成腎臟氧化損傷，表現為腎小管上皮細胞變性壞死，近曲小管萎縮，基底膜增厚，腎小球發生透明變性或纖維化，腎臟功能衰竭[13]。動物肝臟內主要通過羥化、脫甲基、環氧化反應降解AFB1，肝臟的正常功能受到影響，肝細胞脂變、纖維結締組織和膽管上皮大量增生，造成肝臟腫大、壞死甚至癌變，同時也會損傷血管，毛細血管通透性增高，肝臟被膜下出現較多出血點[14]。AFB1 侵入機體后，對腸道細胞也具有毒性作用，可能引發細胞損傷和炎癥反應，損壞腸上皮的形態和組織完整性，抑制其緊密連接蛋白的表達，導致腸黏膜結構和功能的紊亂，同時降低腸道微生物群的多樣性和豐富度，破壞腸道屏障功能，造成機體的腸道菌群紊亂[15]。

2 乳腺炎的誘發因素

2.1 生存環境

奶牛乳腺炎的發生與墊料材料、通風情況和圈舍溫濕度密切相關。有研究表明，墊料中的鋸末是導致克雷伯氏桿菌乳腺炎的風險因子，泥炭和秸稈也有誘發奶牛乳腺炎的可能[16]。場地寬松、環境清潔、通風良好，可降低病原微生物與奶牛直接接觸的機會，減少感染的可能性。氣溫過高引起的熱應激、夏季氣溫過低引發的熱射病或養殖設備不完善導致的晝夜溫差過大，均可導致機體免疫功能受損，增加患病的風險[17]。潮濕、臟亂的環境存在大量的蚊蟲等生物傳播媒介，加快病原體的繁殖與傳播，對奶牛的健康造成極大的威脅[18]。

2.2 奶牛自身

奶牛的年齡是誘導乳腺炎發生的重要因素之一，據報道，乳腺炎多發生于8～12 歲奶牛，老年奶牛由于多年擠奶，乳頭管變寬，加之身體素質和免疫功能降低，抵抗外界病原體入侵的能力逐漸減弱，細菌侵入乳腺的概率增加[19]。產犢次數較多的奶牛也是患乳腺炎的主要群體，產后乳房下垂、乳頭呈漏斗形或乳區不活躍的奶牛，患亞臨床乳腺炎風險較高[20]。遺傳因素也會影響奶牛對乳腺炎的易感性，患乳腺炎的奶牛產下的后代往往具有較高的發病率，乳頭管生理結構松弛的奶牛的乳腺炎發病率相對更高[21]。

2.3 飼養管理

飼養管理方式也是家畜乳腺炎的誘發原因。在人工擠奶時，部分擠奶員在擠奶前未對乳房進行充分按摩和熱敷或擠奶速度過慢，導致放乳反射不強烈或放乳反射周期已過，乳房內有殘留奶，易造成致病菌的繁殖[22]，在機械擠奶過程中，擠奶器指標調整不當、脈動器頻率不穩定以及榨乳操作規程不規范都可能會誘發奶牛乳腺炎。此外，部分乳頭在牛奶擠凈后不能及時卸下擠奶器，持續抽擠導致乳房受到一定損傷[23]，使病原菌入侵乳腺幾率增加。對于患有乳腺炎的奶牛，若未能及時隔離、治療或淘汰，將導致病原體在牛群中傳播，給健康牛的生命健康造成嚴重威脅。

2.4 飼料安全

黃曲霉毒素廣泛存在于奶牛的飼料作物中，尤其當外界環境潮濕及悶熱時，飼料的污染更加嚴重[24]。有研究表明，當使用配合飼料飼喂奶牛時，尤其是當配合飼料中玉米含量較高時黃曲霉毒素的感染量或許有增加的趨勢，相應牛奶檢測出的黃曲霉毒素的幾率增加[25]。飼料粒徑偏離標準也會增加黃曲霉毒素殘留的可能性，粒徑偏小會大幅縮短瘤胃分解毒素的時間，使得毒素殘留體內的可能性提高[26]。此外，飼料的營養水平低下、微量元素供應不足以及突然改變飼料成分會使得奶牛體內的防御屏障功能不全，導致免疫力下降，乳腺炎易發。同時，近年來，為提高奶牛產奶量，飼養者往往大幅提高飼料蛋白質的比例，這種狀況往往增加了奶牛乳腺的負擔，提高了乳腺炎的發生率[27,28]。

3 乳腺炎致病機理

3.1 環境致病菌的致病機理

3.1.1 金黃色葡萄球菌的致病機理

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最常見細菌之一，感染的乳腺炎類型一般為隱性或慢性感染，引起的癥狀通常不嚴重，甚至沒有癥狀，但感染持續性強，容易復發，通常于擠奶期間在奶牛內部及奶牛之間傳播。

金黃色葡萄球菌可以黏附在不銹鋼、聚苯乙烯和橡膠等材料表面，定植形成生物膜，廣泛存在于地板、擠奶裝置等奶牛生存環境中，生物膜穩定性極強，難以去除，導致菌體持續存在，侵入機體后，生物膜的存在極大增強了菌體對機體免疫反應的抵抗力以及對于抗生素和殺菌劑的耐受能力，造成機體的長期感染。菌體在牛乳腺上皮細胞的F-肌動蛋白微絲聚合的過程中侵入細胞，逃避機體的免疫損傷，并且在牛乳腺上皮細胞中進行自我復制，造成細胞損傷[29]。此外，金黃色葡萄球菌還會分泌多種細胞外毒素，包括溶血素、腸毒素以及殺白細胞素等，溶血素會直接攻擊乳腺上皮細胞膜，導致血小板損傷、溶酶體破壞、缺血和壞死，腸毒素通過引發細胞因子風暴對宿主產生間接影響，而殺白細胞素會特異性攻擊免疫細胞，這些物質在誘導乳腺炎發生方面發揮了重要作用[30]。脂磷壁酸（Lipteichoic acid，LTA) 是金黃色葡萄球菌細胞壁中的重要成分，LTA 侵入乳腺上皮細胞后，可強烈誘導趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3 和及CXCL8 的分泌，募集大量中性粒細胞進入乳腺，但誘導產生的促炎細胞因子（TNF-α、IL-1 β、IFN-γ) 十分有限，機體只能發生有限的免疫應答反應，造成了金黃色葡萄球菌的長期感染[31]。自噬作為一種有助于細胞內病原體降解的宿主防御機制，可識別和捕獲侵入細胞的細菌并最終靶向溶酶體。金黃色葡萄球菌感染后，乳腺上皮細胞和巨噬細胞的自噬作用被激活，自噬體的形成增加，但金黃色葡萄球菌的存在導致自噬體和溶酶體的融合受到抑制，阻礙了自噬體的成熟與降解，自噬通量受阻，自噬體的積累促進了金黃色葡萄球菌在細胞中的存活和復制[32-34]。

3.1.2 無乳鏈球菌的致病機理

無乳鏈球菌也是誘導奶牛乳腺炎的重要致病菌之一，屬于專性乳腺寄生菌，其可以附著、破壞乳腺管壁從而引起隱性感染的乳腺炎。同時，無乳鏈球菌具有高度傳染性，一旦牛群中有感染病例，傳播迅速，致病率高。

無乳鏈球菌的毒力因子具有附著和侵襲機體細胞的作用，菌體表面的黏附因子可與細胞表面外基質蛋白相互作用黏附于乳腺上皮細胞上，隨后，細菌的Alp 蛋白可由脂筏介導侵襲進入細胞中[35]，此外，有研究表明，細菌的莢膜多糖有助于菌體生物膜的形成，生物膜可防止機體免疫細胞補體介導的吞噬作用，為無乳鏈球菌在機體內存活和繁殖提供了條件[36]。同時，菌體毒力基因中lmb 基因的表達產物層粘連蛋白結合蛋白，可以協助參與細菌的粘附作用，scpB 基因編碼產生的C5a 肽酶，可以導致中性粒細胞募集通路受損并結合纖連蛋白以促進細菌侵襲上皮細胞，BCA基因編碼α 蛋白幫助細菌進入乳腺上皮細胞，引起感染[37]。在菌體侵入乳腺上皮細胞后，會促使糖酵解過程中催化果糖-1,6-二磷酸轉化為果糖-6-磷酸的磷酸果糖激酶以及氧化3-磷酸甘油醛轉化為1,3-二磷酸甘油醛的甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達量下調，ATP 合成量減少，乳腺上皮細胞的代謝受到明顯抑制，從而顯著影響細胞增殖、乳蛋白和乳糖合成以及產奶量[38]。另有研究表明，分離自臨床型乳腺炎的無乳鏈球菌分離株SAGFX17 在感染量較少時會刺激機體中性粒細胞的增殖分化，并誘導中性粒細胞胞外誘捕網的形成，引發機體較好的免疫應答作用。當感染量繼續增加到一定程度時，中性粒細胞的功能會受到抑制，顯著提高了無乳鏈球菌在中性粒細胞內的存活率，促使無乳鏈球菌在乳腺中定植[39]。

3.1.3 大腸桿菌的致病機理

大腸桿菌廣泛存在于自然環境中，在正常情況下不會引起人和動物感染，但當機體免疫力低下時會導致疾病，造成奶牛的急性乳腺炎，通?；謴洼^快，但特定菌株也會引起持續感染，在極端情況下，大腸桿菌乳腺炎也可誘發嚴重的全身性臨床癥狀，如膿毒癥等。

造成急性乳腺炎和持續性乳腺炎的兩種大腸桿菌菌株都會誘導牛乳腺上皮細胞中促炎細胞因子IL-1、IL-6、IL-8、趨化因子CCL20、CXCL2、MHC I 類分子以及細胞凋亡相關基因caspase-3 等表達量上調，且急性菌株的上調幅度明顯高于持續性菌株，以致急性菌株感染的乳腺炎誘導的機體免疫反應較強，大部分可以被宿主的免疫系統清除，而慢性菌株只能引起機體免疫應答基因的中度表達，使得大腸桿菌菌株在乳腺內大量增殖和持續性存在，從而導致機體的長期感染[40]。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS) 是大腸桿菌細胞壁的重要組成部分，有研究表明，LPS 會與乳腺上皮細胞表面toll 樣受體-4 結合，激活其下游的信號通路，誘導細胞中核因子NF-κB 活化，促進乳腺中促炎細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達[41]。乳腺上皮細胞中緊密連接蛋白Claudins結構組成也會發生改變，血乳屏障破壞，提高了大腸桿菌侵入乳腺的可能性[42]。隨后，侵入機體的大腸桿菌菌株通過網格蛋白介導的內吞作用進入乳腺上皮細胞，避免機體內體酸化和內體-溶酶體融合等免疫防御機制，增加了菌株在機體內存活的機會，為大腸桿菌在乳腺環境中快速的生長和繁殖提供了條件[40]。大腸桿菌通過下調牛乳腺上皮細胞的線粒體膜電位（Mitochondrial mem-brane potential，MMP)，導致線粒體膜通透性轉換孔MPTP 持續開放，促使線粒體中的細胞色素氧化酶Cyt-C 等促凋亡因子釋放入胞質，啟動內源性細胞凋亡途徑，激活caspase-3 從而誘導牛乳腺上皮細胞凋亡，造成奶牛乳腺炎[43]。乳腺中脂肪代謝基因的表達也會由于大腸桿菌感染而降低，牛奶中脂肪分泌的總量減少，同時影響牛奶中的脂肪百分比，使得患有大腸桿菌乳腺炎的奶牛產奶量及產奶質量顯著下降[44]。

3.2 霉菌毒素的致病機理

3.2.1 黃曲霉毒素B1 通過導致小鼠腸道菌群紊亂誘導乳腺炎發生

當奶牛機體感染乳腺炎時，中性粒細胞趨化因子會迅速募集原本存在于血液中的中性粒細胞通過基底膜和乳腺上皮遷移至乳腺，使乳汁中出現大量的中性粒細胞，中性粒細胞可殺滅大量病原菌，并且霉菌毒素造成的炎性反應越嚴重，奶牛乳腺中存在的中性粒細胞相應就越多，因此常把中性粒細胞認為是乳腺炎的主要診斷指標。腸道菌群在維持機體屏障的完整性、保證內環境穩定和增強免疫功能方面具有重要作用。有研究表明，在使用AFB1 灌胃實驗小鼠后，菌群的組成成分及豐度降低，有益菌含量明顯降低，有害菌含量顯著增高，嚴重破壞腸道菌群的內環境穩態[45]。腸道微生物群的改變會使得腸道的粘膜屏障和上皮屏障發生破壞，系統性炎癥增加。有研究發現，腸道菌群的豐度和乳腺炎的發生有極強的關聯性，乳腺炎奶牛和健康奶牛相比，腸道菌群的組成結構發生明顯變化，顫螺菌屬（Oscillospira)和瘤胃菌屬（Ruminococcaceae) 相對豐度普遍增加，糞厭氧棒桿菌屬（Anaerostipes)、乳桿菌屬（Lachnospiraceae) 和羅氏菌屬（Roseburia) 相對豐度明顯減少[46]。將乳腺炎奶牛的糞便菌群移植給無菌小鼠后，小鼠出現乳腺炎癥狀，并伴隨血清、脾臟、結腸等部位的炎癥發生[47]。同時，腸道菌群組成改變會下調ZO-1、Occludin 和Claudin-3 等乳腺上皮細胞間的緊密連接蛋白的表達，血乳屏障通透性顯著增高，改變中性粒細胞穿過血乳屏障的閾值，導致大量中性粒細胞募集至乳腺并加重乳腺炎[48]。

3.2.2 黃曲霉毒素B1 通過破壞血乳屏障誘導乳腺炎發生

血乳屏障在中性粒細胞從血液轉移到乳汁中起著重要作用。血乳屏障通透性的增加會導致乳腺中出現大量中性粒細胞，加重奶牛的乳腺炎，血乳屏障的功能主要依賴于乳腺上皮細胞的完整性以及細胞間的連接作用。有研究表明，乳腺中的乳腺上皮細胞是AFB1 羥化為AFM1 及其他代謝產物的主要場所，隨著奶牛攝入AFB1 濃度的增加，乳腺上皮細胞的損傷程度也隨之加重。AFB1 長期感染會導致乳腺上皮細胞內的活性氧升高以及MMP 部分丟失，同時抑制機體抗氧化物過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶的表達量，造成乳腺上皮細胞的氧化應激，上調細胞凋亡蛋白caspase-3 的表達，誘導細胞凋亡[49,50]。有研究表明，AFB1 也可以通過促進髓細胞白血病因子1（MLF1)、細胞周期調節因子家族成員A（SPDYA) 以及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1C（CDKN1C) 的表達，導致細胞周期S 期縮短以及G1 和G2 期停滯，同時，AFB1 會下調生長停滯特異性基因2（GAS2)、高遷移率族AT-hook2（HMGA2) 以及血小板反應素-1(THBS-1)的表達，抑制細胞骨架和微管的形成，導致DNA 轉錄過程受阻，抑制乳腺上皮細胞增殖，細胞活力降低。此外，AFB1 可以編碼G 蛋白偶聯受體（GPR37L1)、溶質載體家族40成員1（SLC40A1) 等在細胞凋亡過程中發揮作用的基因的表達，最終造成細胞凋亡[51]。STAT5A 基因的表達會誘導乳腺上皮細胞增殖分化，有研究表明，STAT5A 基因的表達被AFB1以劑量依賴的方式顯著下調，導致乳腺上皮細胞的DNA 損傷，影響了乳腺上皮細胞之間的間隙連接作用[52]，同時，日糧中添加AFB1 會導致乳畜體內的體細胞數（Somatic Cell Count，SCC)大量增加，也可能破壞細胞間的緊密連接，導致大量促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α涌入乳腺，進一步增加血乳屏障的通透性，導致牛奶中的SCC 含量增高[53]。此外，AFB1 引起的乳腺上皮細胞中p-p65、p-IκB-α 蛋白的上調表達，也會促進炎癥相關因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β 的分泌，激活NF-κ B 信號通路，引起炎癥反應的發生，趨化中性粒細胞遷移進入乳腺，誘發乳腺炎[54]。

4 小結

目前，隨著人民生活水平的提高，如何提高乳制品質量及其產量日漸成為我國泌乳研究的重點。由環境致病菌導致奶牛乳腺炎的機制研究已相對成熟，但對于AFB1 誘導乳腺炎的機制研究較少，致病機理尚未明確。因此，通過探究AFB1 誘發奶牛乳腺炎的潛在風險，將為尋找預防和治療靶點提供新的理論依據。