1例由p.Arg35Cys引起遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的研究

唐勇 張福勇 蔣燕珍 吳崇榮 代洪飛 楊紅海

基金項目：廣西壯族自治區衛生健康委員會自籌經費科研課題（Z20200085）

第一作者簡介：唐勇，男，副主任技師，醫學學士， 研究方向：臨床檢驗診斷學。E-mail：xhero521@163.com

通信作者：楊紅海。E-mail：57179627@qq.com

［本文引用格式］唐勇，張福勇，蔣燕珍，等.1例由p.Arg35Cys引起遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的研究［J］.右江醫學，2024，52（3）：215-220.

【摘要】? 目的 ?分析武鳴壯族地區1例FGA基因雜合突變引起的遺傳性異常纖維蛋白原血癥的表型和基因型，探討其發病機制。

方法? 對先證者家系三代5人進行外周血采集，使用凝血分析儀檢測PT、APTT、FIB、TT等凝血項目，FIB采用PT演算法和Clauss法檢測；采用DETA抗凝管收集全血，通過NGS篩選，用Sanger測序驗證FGA、FGB、FGG基因編碼區突變。

結果? 先證者及其父親表現出FIB-Clauss法水平降低和凝血酶時間延長，而其妹妹和兩個女兒均正常。高通量基因測序顯示先證者及其父親檢測到FGA c.103C>T雜合錯義突變，而先證者的妹妹和兩個女兒未檢測到該突變。

結論? 導致該家系成員遺傳性異常纖維蛋白原血癥的分子機制是FGA c.103C>T雜合錯義突變，該突變導致蛋白質中第35位氨基酸由精氨酸變為半胱氨酸（p.Arg35Cys），從而導致遺傳性異常纖維蛋白原血癥。

【關鍵詞】? 基因突變；家系；遺傳性異常纖維蛋白原血癥

中圖分類號：R446??? 文獻標志碼：A??? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.03.005

A research on 1 case of hereditary abnormal fibrinogenemia family caused by p.Arg35Cys

TANG Yong1， ZHANG Fuyong2， JIANG Yanzhen1， WU Chongrong1， DAI Hongfei1， YANG Honghai1▲

（1. Department of Clinical Laboratory， Nanning Wuming District Hospital of Traditional Chinese

Medicine， Nanning 530199， Guangxi， China; 2. Department of Clinical Laboratory， the First

Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi， China）

【Abstract】? Objective? To analyze the phenotype and genotype of 1 case of congenital dysfibrinogenemia caused by heterozygous mutation of the FGA gene in Zhuang region of Wuming， so as to explore the pathogenesis of the disease.

Methods? 5 peripheral blood samples from three generations of the proband were collected， and blood coagulation items such as prothrombin （PT）， activated partial thromboplastin（APTT）， fibrinogen （FIB）， and thrombin time （TT） were analyzed by coagulation analyzer， FIB was detected by PT algorithm and Claus method， whole blood was collected by DETA anticoagulant tubes and was screened through NGS， and mutations in the coding regions of the FGA， FGB， and FGG genes were verified by Sanger sequencing.

Results? The proband and his father showed reduced levels of the FIB-Clauss method and prolonged time of thrombin， while his sister and 2 daughters were normal. High-throughput gene sequencing revealed a heterozygous for the FGA c.103 C > T missense mutation detected in the proband and his father， which was not found in the detection of his sister and 2 daughters.

Conclusion? The molecular mechanism that leads to congenital dysfibrinogenemia in members of this family is FGA c.103C>T heterozygous missense mutation， which causes the 35th amino acid in the protein to change from arginine to cysteine （p.Arg35Cys）， resulting in congenital dysfibrinogenemia.

【Keywords】? gene mutation; family; congenital dysfibrinogenemia

遺傳性異常纖維蛋白原血癥（congenital dysfibrinogenemia， CD）是一種遺傳性血液病，由于纖維蛋白原（fibrinogen， FIB）基因缺陷導致FIB分子結構與功能異常，可能引起機體凝血功能異常。CD患者臨床表現多樣，大部分無癥狀，少數出現血栓、出血事件或肺動脈高壓等癥狀［1］。CD主要為常染色體顯性或共顯性遺傳，少數為常染色體隱性遺傳。由于廣泛的臨床癥狀，CD診斷困難［2］，治療方法包括纖維蛋白原替代治療、抗凝、血栓預防和多學科團隊方法［3］。目前尚未建立統一的標準CD治療方案［2］。本研究發現1例患者纖維蛋白原異常降低，為探明其原因進行家系表型與基因型分析，探討發病機制，減少誤診漏診，為該病的研究提供臨床依據。

1? 對象與方法

1.1? 對象

先證者為一名44歲的廣西南寧市武鳴區壯族男性。入院體檢時發現凝血功能異常，FIB結果為0.47 g/L， TT為40.4? s，PT演算法纖維蛋白原結果正常。其血栓彈力圖結果顯示凝血因子（R）為5.6 min，纖維蛋白原功能（K）為2.9 min，纖維蛋白原功能（ANGLE）為54.6 deg，血小板功能（MA）為56.8 mm，凝血綜合指數（CI）為-1.4，纖溶指標（LY30）為0，纖溶指標（EPL）為0，均在正常范圍內。肝腎功能、血常規、D二聚體、纖維蛋白原降解產物（FDP）等結果均未見異常。體格檢查結果正常，既往無滲血不止、出血、黑便、尿血或血栓形成病史，也沒有家族遺傳病史。其家系圖譜如圖1所示，母親已逝，其資料不詳。

1.2? 方法

1.2.1? 標本采集

經先證者與家屬簽署知情同意書后，并通過醫院倫理委員會批準，采集先證者及先證者的父親、妹妹、兩個女兒空腹外周靜脈血標本各2 mL和4 mL分別置于4支試管。其中1管用枸櫞酸鈉抗凝，分別進行凝血相關項目檢測；另2管用EDTA抗凝進行血常規項目以及基因項目檢測，并將該家系的血樣本放置于-80 ℃的冰箱中冰凍保存；4 mL促凝管用于生化項目肝功能檢測。

1.2.2? 凝血項目檢測

將收集好的先證者以及家屬的凝血標本離心后，按照儀器操作說明書使用法國STA-MAX全自動血凝分析儀及其配套試劑進行凝血相關項目檢測（分析儀及其配套試劑需進行質控）；SYSMEX CS 2000i全自動血凝分析儀及其配套試劑通過PT演算法測定FIB結果。

1.2.3? 血常規檢測

將收集好的先證者和家屬的血常規標本混合后，按照儀器操作說明書，使用MEK9100全自動血細胞分析儀及其配套試劑進行檢測。

1.2.4? 肝功能檢測

收集好的先證者及其家屬促凝管標本離心分離血清后，使用日立LABOSPECT 008AS全自動生化分析儀及其配套試劑對血清標本進行檢測。

1.2.5? 基因檢測

將存放在 -80 ℃ 的血樣本送至武漢華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，使用Life Technologies 公司 Ion Torrent PGM 高通量測序儀篩選 FGA、FGB、FGG 基因編碼區及其上下游 5bp 范圍內的點突變和微小插入/缺失，并使用 Sanger 測序驗證突變。

參考序列：

FGA：GRCh38， Chromosome 4，NC_000004.12， NM_000508.4；

FGB：GRCh38， Chromosome 4，NC_000004.12， NM_005141.4；

FGG：GRCh38， Chromosome 4，NC_000004.12， NM_000509.5。

參考數據庫：

The Genome Aggregation Database （gnomAD）： http：//gnomad.broadinstitute.org/；

Human Gene Mutation Database （HGMD）：http：//www.hgmd.cf.ac.uk/。

1.2.6? 蛋白模型構建

為了描述突變體FIB蛋白的三維結構變化，首先在NCBI上搜索FGA基因的氨基酸序列，將該序列導入SWISS-MODEL生成其野生型分子模型。接著將序列中的第35位氨基酸Arg修改為突變的Cys，再次導入上述工具生成突變型分子模型。最后，使用Swiss-PdbViewer v4.1軟件對野生型和突變型的分子蛋白模型進行評估。

2? 結? 果

2.1? 血常規、肝功能、凝血項目

先證者以及家屬血常規、肝功能、D二聚體和FDP檢查結果均正常，因肝臟疾病引起的FIB缺陷以及纖溶亢進引起的FIB消耗可以排除。先證者的妹妹及女兒凝血功能各項指標均在正常范圍內；而先證者與其父親PT結果均為輕度延長，TT結果延長，FIB-Clauss法結果降低，FIB演算法結果正常。具體結果見表1，表2，表3。

2.2? 基因檢測結果

先證者及其父親FIB FGA基因中發現了c.103C>T雜合錯義突變。該突變導致蛋白質第35位氨基酸由精氨酸突變為半胱氨酸（p.Arg35Cys）。值得注意的是，先證者的妹妹和女兒的基因結果均為正常，未檢測到任何異常突變。據gnomAD數據庫顯示，該突變在人群中的頻率為3.23E-05，在HGMD數據庫中也有相關病例報道（CM930249）。綜合考慮，該突變被認為具有可能致病性。具體的檢測結果見表4，測序結果見圖2和圖3。

2.3? 突變蛋白分子建模

對p.Arg35Cys 突變的分子模型和結構分析，圖4A 中白色箭頭所指的是野生型 FIB 蛋白 Aα 的第35位氨基酸精氨酸（Arg）。該氨基酸突變為半胱氨酸（Cys）后，蛋白的空間構象發生改變（圖4B 紅色箭頭所指），可能影響凝血酶對纖維蛋白原肽 A 的裂解，導致纖維蛋白肽 A 的釋放延長或出現缺陷。

3? 討? 論

纖維蛋白原，又稱凝血因子Ⅰ，主要由肝細胞分泌［4］。其分子量為340 kD的糖蛋白，能相互結合形成纖維蛋白凝塊并介導血小板聚集，在維持機體止凝血平衡方面發揮著重要作用［5］。FIB異常性疾病通?？煞譃閮深悾阂活愂撬幬镆鸬墨@得性異常，另一類是由FIB編碼基因缺陷引起的遺傳性凝血功能異常疾?。?］。遺傳性的FIB異常相對較罕見，發病率約為1/106，可分為兩種類型［7］：Ⅰ型為FIB水平降低或缺陷，包括低纖維蛋白原血癥和無纖維蛋白原血癥；Ⅱ型為FIB分子結構或功能異常，包括低異常纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥［8］。CD屬于Ⅱ型纖維蛋白原缺陷癥。

FIB是由多肽鏈Aα、Bβ、γ構成的二聚體［9］，同源基因FGA、FGB和FGG按順序編碼形成FIB的3條肽鏈［5］，編碼基因如出現大片段缺失、框移突變、無義突變、錯義突變等缺陷可導致FIB分子結構和功能異常，導致纖維蛋白單體聚合障礙、ⅩⅢ因子介導的交聯障礙或纖維蛋白肽A/B釋放障礙［10］。本家系先證者在入院體檢凝血檢查中發現PT 19.7 s，APTT 36.2 s，FIB 0.47 g/L，TT 40.4 s，除FIB活性明顯降低、TT延長外，無其他臨床癥狀?；驒z測結果顯示患者FIB的FGA基因發生c.103C>T雜合錯義突變，并導致第35位氨基酸從精氨酸突變成半胱氨酸（p.Arg35Cys）。據研究顯示α鏈上凝血酶裂解位點是R35，錯義突變是該點位常見突變之一，從而引起了異常纖維蛋白原血癥［11］。從纖維蛋白原基因突變數據庫（https：//site.geht.org/base-de-donnees-fibrinogene/）也可以證實。此外，該突變可導致纖維蛋白肽A釋放延長或缺陷，以及隨后的多聚化延遲，最終導致FIB出現異常和TT延長，臨床上常無血栓或出血表現［6］。該家系中的先證者臨床癥狀與研究一致。

前期研究表明，女性CD患病率高于男性。這可能是因為女性通常必須接受常規術前檢查，如妊娠和產科手術，從而更容易發現凝血功能異常并就診［9］。本研究對先證者及其父親、妹妹和女兒進行了相關項目檢查。結果顯示先證者及家系成員的血常規和肝功能正常，排除了因肝臟疾病引起的FIB缺陷，D-二聚體和FDP也正常，排除了因纖溶亢進導致的FIB消耗。凝血功能結果顯示家系中的女兒和妹妹正常，而先證者及其父親的PT略有延長，TT延長，FIB活性降低?；驒z測結果確認僅其父親的FIB FGA基因c.103C>T存在雜合錯義突變，而妹妹和女兒的基因正常，未出現突變。MOSESSON等發現［12］，FIB中的Arg變為Cys可增加患者血栓形成的易感性。然而，本研究暫未發現先證者及家系成員出現血栓。但統計數據顯示，CD患者發生靜脈血栓的中位年齡為34歲，而發生動脈血栓的中位年齡為49歲［13］，大出血主要發生在20～40歲［14］。因此，仍需要警惕該先證者發生血栓和出血風險，并需要長期進行血液科隨訪。FIB基因分析是診斷CD的重要手段，但檢出FIB相關基因突變并不等于確診CD，也可見于遺傳性低（無）纖維蛋白原血癥。因此，確診CD尚需結合FIB的Clauss法和PT演算法結果，以及患者的臨床表現和家系調查綜合診斷。故該病容易漏診、誤診。特別是僅單獨采用Clauss法檢測FIB水平常導致該病易被誤診為遺傳性低纖維蛋白原血癥。一些患者在受到創傷時會引起嚴重的出血或血栓，甚至危及生命或死亡［15］。通過對該病的認知，有助于提升臨床診療水平，及時發現并干預，避免誤診和漏診。

本研究樣本來源為受檢者血液或體細胞，而非生殖細胞，因此不能排除嵌合現象所致的解讀偏差。如果檢測結果提示為自發變異位點，該情況下并不排除父母生殖腺嵌合變異的存在。由于人類疾病認識的局限性和本檢測Panel所包含基因數量的限制，如未檢出FGA、FGB、FGG基因的致病位點，即為陰性結果，但并不能排除患遺傳性異常纖維蛋白原血癥的可能性。由于對基因認識的不足，對檢出的特定基因突變，在某些情況下可能并非引起該疾病的致病突變，尚需要進一步驗證和研究。

綜上所述，通過本家系的研究，了解其分子發病機制、表型與基因的相關性，為臨床對該病的診斷以及治療提供重要的依據。

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（收稿日期：2023-05-10? 修回日期：2023-09-28）

（編輯：梁明佩）