miRNA 在糖尿病足潰瘍炎癥期的作用機制及中醫藥干預進展

趙欣華，張東旭，高獻敏，于文慧，張美君，趙 鋼

糖尿病是一種臨床常見的慢性、代謝性疾病，常使多器官功能受損，導致多種并發癥，糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer, DFU）是臨床中最常見的并發癥[1]。DFU 常因患者局部缺血、神經病變、感染等因素，由外傷、壓力性損傷等誘發，出現踝關節遠端皮膚及深部組織的潰爛。DFU 具有經久不愈，愈后易復發，較高致殘率的特點，給患者生理及心理帶來極大的負擔，嚴重影響了患者的生活質量，故對于DFU 的治療至關重要。目前，對于DFU 的研究已逐漸步入基因層面，越來越多的研究表明，非編碼小RNA （microribonucleic acid，miRNA）在DFU 皮膚中異常表達，并參與了DFU 的發生發展，對于miRNA 的調控可能成為DFU 治療的關鍵。本文通過miRNA 在DFU 炎癥期中的作用機制，以及中醫藥通過調控miRNA 治療DFU 研究進展的綜述，以期為中醫藥治療DFU 提供基因層面的理論支持。

1 miRNA 的發生機制

miRNA 即microRNA，又稱微小核糖核酸。其為內源性長度為20～24 nt 的非編碼單鏈RNA 分子，存在于真核生物體內。在細胞核內存在的miRNA 的前體（pri-miRNA)可被加工成莖環或發夾結構前體miRNA (pre-miRNA)，經過轉運，premiRNA 由細胞核移動到細胞質，在這里被加工成miRNA，而人類近1/3 的基因都受這些miRNA 調控[2-3]。miRNA 在GW182 功能蛋白的調控下抑制靶向目標mRNA 的翻譯過程，破壞mRNA 的自身穩定性，進而負調控轉錄后的基因表達水平，即miRNA 在細胞質中對基因表達進行負調控[4-5]。細胞質內的miRNA 還可以通過以下多種途徑調控生命活動，包括：直接參與調節基因轉錄過程、靶向線粒體基因、與多種功能蛋白結合及促進靶向mRNA 表達作用[2]。

2 miRNA 在糖尿病足潰瘍炎癥期的作用機制

DFU 患者創面的愈合是一個由多種細胞及組織因子參與的復雜的生理過程，主要包括炎癥期、增殖期與重塑期3 個時期，3 個時期相輔相成，任何一個愈合過程反應不及或過度都有可能造成愈合創面的再度損傷[6]。創面最先進入的時期為炎癥反應期，這一時期對于創面愈合起重要作用。炎癥反應期發揮作用的主要有兩種因子：抗炎因子和促炎因子。促炎因子的分泌加速了炎癥過程，而抗炎因子則可減緩炎癥的發生。兩類炎癥因子處于相對平衡狀態，才有利于創面的修復。若促炎因子生成過多，則會導致創面遷延不愈，從而形成慢性潰瘍[7]。若抗炎因子生成過多，同樣對于創面愈合不利。研究發現，miRNA 在愈合過程的炎癥期發揮了重要作用。DFU 后巨噬細胞被激活，M1 型巨噬細胞可促使大量促炎因子生成，M2 型巨噬細胞則可促使抗炎因子表達，miRNA 靶向多種轉錄因子來調控巨噬細胞的極化，從而調節炎癥過程。

2.1 miRNA -155 miRNA -155 作為多功能miRNA，參與了多種生物學過程，且與炎癥密切相關。Cai 等[8]研究表明，miRNA-155 能夠調節巨噬細胞的極化狀態，在巨噬細胞由抗炎型M2 型向促炎型M1 型極化時高表達，而在M1 型向M2 型極化時低表達。同樣的，Li 等[9]研究也表明，miRNA-155 的缺乏可導致巨噬細胞的M1-M2 極化。有團隊研究表明，miRNA-155 通過調控轉錄因子C/EBP-β、SHIP1 和IL13Rα1 促進M1 巨噬細胞的極化[10]。而Jin 等[11]研究表明，miRNA-155 的過表達直接促進了促炎細胞因子腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-1β 的產生，加重了炎癥狀態。譚仕廉等[12]研究發現也同樣佐證了這一結論，miRNA-155 可通過靶向抑制SOCS1 蛋白表達，促進LPS 所致的THP-1 巨噬細胞的激活，釋放炎性細胞因子TNF-α及IL-8，從而促進炎癥反應。而TNF-α 作為被激活的巨噬細胞最先產生的細胞因子，又會誘導IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 等細胞因子的分泌，從而產生連續反應，更大程度加速炎癥反應的發生[13]。細胞實驗表明miRNA-155 可通過靶向IL-13 受體α1的表達水平，介導STAT6 的激活減弱，從而抑制M2型巨噬細胞生成，加速炎癥反應的進程；此外，研究人員還發現miRNA-155 對IL-13 依賴性調節的巨噬細胞M2/pro-Th2 表型建立相關基因（SOCS1、DC-SIGN、CCL18、CD23 和SERPINE）的影響，可能也是其抑制巨噬細胞向M2 型極化的重要機制[14]。

2.2 miRNA-9 miRNA-9 是一種富集在腦內的miRNA，既往研究多集中在其對神經系統的影響，而miRNA-9 在炎癥過程中也發揮了重要作用。miRNA-9 可通過調節核因子（NF）-κB 水平，抑制巨噬細胞釋放炎性細胞因子。NF-κB 是一種異聚轉錄因子,可通過介導激活促炎因子，從而調控TNFα、IL-1β 和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等的生成[15]。體外實驗發現，miRNA-9 過表達可減少RAW 264.7細胞釋放炎性因子TNF-α 和IL-1β，促進PPARs活化，調控M1/M2 極化狀態，降低炎性反應狀態[16]。吳曉玲等[17]研究發現，抑制miRNA-9 可下調PPARδ 的表達，減少抗炎轉錄因子BCL-6 的生成，從而促進巨噬細胞M1 極化。細胞實驗表明，在OGD 模型中NF-κB、TNF-α、IL-1β 和iNOS 等炎性因子均處于高表達狀態，而將miRNA-9 轉染入細胞后，上述炎性因子表達降低，提示miRNA-9 可抑制上述炎性因子的表達[18]。同樣的，Bazzoni 等[19]及Qian 等[20]研究也證實miRNA-9 可通過抑制NF-κB下調TNF-α 和IL-1β 的表達，從而減輕炎癥反應。這些研究提示miRNA-9 可能是通過作用于關鍵靶點NF-κB 來治療DFU。

2.3 miRNA-146a 多項研究結果表明miRNA-146a 在炎癥反應過程中起重要的調控作用[16-18]。細胞實驗表明，miRNA-146a 可通過抑制IRAK1 和TRAF6 表達，降低JNK 磷酸化水平，減少巨噬細胞M1 型極化，抑制TNF-α、IL-1β 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的生成，從而降低炎癥反應[19]。Qian等[20]研究證實了miRNA-146a 可通過下調Notch1的表達使M1 型巨噬細胞的激活被抑制，還可以提高PPARγ 的表達增強M2 巨噬細胞的活化，以此發揮抗炎作用。miRNA-146a 還能夠直接抑制炎性因子在細胞中的表達，從而顯著降低炎癥反應水平。研究表明，miRNA-146a 能夠直接抑制細胞中多種白細胞介素因子的表達，包括IL-6、8、17、13、1β等，從而直接抑制細胞炎癥反應[21-22]。miRNA-146a還能夠通過TLR 途徑負反饋調節促炎性細胞因子的表達，從而抑制侵襲性炎癥的產生，阻止炎癥進展[23]。動物實驗表明，隨著大鼠體內miRNA-146a 的分泌不斷增多，細胞因子IL-6、MCP-1 及TNF-α 的分泌明顯被抑制[24]。細胞實驗則證實，miRNA-146a的過表達直接抑制Nox4 的分泌，減少ROS 的產生從而降低氧化應激水平，抑制炎癥的發生[25]。這些研究都表明miRNA-146a 能夠通過多條途徑負向調節炎癥反應，提示miRNA-146a 具有治療DFU 的重大潛力。

上述研究表明，miRNA 在DFU 炎癥期的異常表達發揮著重要的調節作用，這為炎癥期DFU 的治療提供了重要參考。miRNA 通過多種途徑調控巨噬細胞表型，平衡促炎因子與抗炎因子在創面的表達，從而減輕創面炎癥狀態，避免過度炎癥反應，保護創面，促使創面順利進入下一修復期。

3 中醫藥通過調節miRNA 干預糖尿病足潰瘍

中醫藥治療DFU 的療效顯著、歷史悠久，治療疾病具有多層次、全方位、多靶點共同作用的特點。近年來，大量研究結果表明，中藥單體提取物、中藥組成成分及中藥復方均能夠通過調控miRNA 來影響DFU 進程。

3.1 中藥單體及提取物 中藥單體及提取物是從單味中藥中提取的有效化學成分，由現代醫學與祖國傳統醫學融合而成。相較于中藥復方，其成分單一、化學結構明確，便于進行安全性及有效性評價。研究發現三七總皂苷、黃芪總皂苷、人參皂苷、葛根素、龍血素、山奈酚、黃芩苷等多種中藥單體及提取物可通過調節miRNA 治療DFU。

五加科植物三七具有化瘀止血、活血定痛功效，豆科植物黃芪具有健脾補中、升陽舉陷、益衛固表、利尿、托毒生肌等多重功效，二者的提取物三七總皂苷及黃芪總皂苷能夠通過上調miRNA-146a的表達,活化IRAKl 和TRAF6，抑制TLR 信號通路，降低炎癥反應的發生，改善創面微循環，從而加速創面修復[26]。這與此前論述一致[23]，此外動物實驗還表明，三七花總皂苷水凝膠能夠促進肉芽組織的形成，增強對炎性滲出物的吸收，從而加速大鼠皮膚創面修復[27]。Xue 等[28]研究表明，人參提取物人參皂苷Rg1 通過miRNA-2113/RP11-982M15.8/Zeb1 通路調控降低高糖誘導的間充質活化和組織纖維化。人參皂苷Rg1 還可通過抑制miRNA-489e3p 的表達，負調控Sirt1，激活PI3K/AKT/eNOS 信號，增強eNOS 和iNOS 的表達，促進NO 的產生和血管生成，加速傷口愈合[29]。Xu 等[30]研究發現，豆科植物葛根主要成分葛根素通過上調miRNA-145-5p 表達水平，抑制TLR4/MyD88/NF-κB（p65）通路的激活，降低多種炎性因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等的表達，從而減少炎癥反應的發生，促進創面愈合。血竭作為血管外科常用中藥，能夠活血定痛，化瘀止血，生肌斂瘡，主要成分龍血素A 抑制miRNA-339-5p的表達，增加了同源異形盒基因5 的表達，從而激活了Wnt 信號通路，促進細胞增殖與分化，從而修復創面[31]。當歸補血復合微囊由當歸主要成分阿魏酸及黃芪主要成分黃芪甲苷復合而成，體外實驗結果表明，20 μg/mL 當歸補血復合微囊能夠上調miRNA-21 的表達，通過JAK2/STAT3 信號通路促進血管生成，加速創面愈合[32]。姜科植物姜黃具有破血、行氣止痛的作用，其主要成分姜黃素具有抗炎、抗氧化及抗癌多種作用。Qiu 等[33]研究結果表明，姜黃素能夠上調miRNA-143 和miRNA-124 的水平，降低靶基因NF-κB、ROCK1 及因子TLR9 的分泌，以此降低炎癥水平。中藥肉桂的提取物桂皮醛能夠顯著抑制TLR4、NO、MMP-13 等炎性因子的分泌，當其與miRNA-146a 模擬劑聯合使用時，其抑制效果更為顯著，而當其與miRNA-146a 抑制劑聯合使用時，抗炎作用明顯降低，這提示桂皮醛可能通過協同miRNA-146a 發揮抗炎作用[34]。毛茛科植物芍藥提取物芍藥內酯苷能夠促進miRNA-149-5p 的表達，從而抑制WISP1 表達，減低IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平，抑制細胞凋亡，改善創面環境[35]。連翹及山奈提取物山奈酚屬于黃酮類化合物，其通過上調miRNA-130a 調控STAT3 水平，降低細胞內炎性因子的分泌，抑制細胞凋亡[36]。同屬于黃酮類化合物的黃芩苷，主要來源于中藥黃芩，細胞實驗表明，黃芩苷能夠促進IL-1β 處理過的細胞中miRNA-766-3p 的表達，并且抑制細胞凋亡，促進ECM 的合成[37]，這可能加速了創面的愈合。

3.2 中藥復方 中藥復方是包含兩種或兩種以上藥物的方劑，依據君臣佐使的組方原則，針對某一證型的疾病進行配伍使用。中藥復方是祖國傳統醫學的精髓，通過多種藥物的配伍使用，有著同病異治、異病同治的功效，多種藥物通過聯合應用，既可以增強藥效，又能夠減輕藥物不良反應，有著良好的治療效果。相比于中藥單體及提取物，中藥復方成分復雜，研究難度較高，通過調節miRNA 來治療DFU 的中藥復方主要有生肌玉紅膏、回陽生肌方和紫朱軟膏。

生肌玉紅膏是治療創面的常用方劑，主要成分是白芷、甘草、歸身等，有活血祛腐、解毒生肌的功效。體外實驗表明，生肌玉紅膠原可以通過調控脂肪干細胞來促進miRNA-21 的表達，并且這種表達呈劑量依賴性，高表達的miRNA-21 可能促進下游p-p38 蛋白表達的增加，從而促進血管新生，加速血液流通及創面愈合[38]?；仃柹》接扇藚?5 g，鹿茸15 g，雄黃1.5 g，乳香30 g，琥珀7.5 g 及京紅粉3 g組成，功能主治為回陽生肌,止痛收斂。高通量測序分析顯示，回陽生肌方應用于創面的LncRNA 及mRNA 可能通過調節PPAR、局灶性黏附及內吞作用等信號通路參與創面愈合的調控[39]。紫朱軟膏是臨床治療DFU 的常用方劑，是在奚九一先生“煨膿長肉膏”方義上化裁而來，包含朱砂、紫草、冰片、黃芪、龍血竭及阿膠六味中藥。李文惠等[40]應用高通量測序方法分析發現，DFU 大鼠在紫朱軟膏治療前后，存在122 種miRNAs 差異表達，用藥后下調差異顯著性最大的5 種為miR-379-3p、miR-496-3p、miR-434-5p、miR-411-5p、miR-122-5p，上調差異顯著性最大的5 種為miR-1b、miR-1-3p、miR-133b-3p、miR-133a-3p、miR-133a-5p，這一研究結果為紫朱軟膏干預糖尿病潰瘍的治療提出了基因層面上的可能途徑。

4 結語

據統計，約有1/4 的糖尿病患者最終發展為DFU[41]。較高的發病風險及發病率嚴重影響了個人、家庭及社會。早期的預防、診斷與治療能夠大大改善DFU 患者的癥狀，降低發病率及截肢率。近年來，隨著基因組學的深入發展，miRNA 參與調控DFU取得了較大進展。本文分別探討了miRNA-155、miRNA-9 及miRNA-146a 三種常見的miRNA 在DFU 炎癥期的作用機制，以及多種中藥單體及提取物、中藥復方通過上調或下調不同miRNA 來實現對DFU 的有效干預，從而達到治療目的。這些研究為中醫藥治療DFU 提供了基因層面的理論依據，雖然中醫藥通過調控miRNA 治療DFU 的療效肯定，但由于其多成分、多靶點的作用特點，治療機制并未完全清晰，尤其是中藥復方的相關研究較少，研究層面不夠深入，且僅有少數miRNA 應用于臨床。未來期冀科研工作者們運用更多新技術，繼續探索中藥單體及復方，為中醫藥調控miRNA 應用于臨床治療提供更多方案。