脂肪酶法制備富含DHA甘油酯的研究

張士龍,王 鑫,把宗國

中糧糧油工業(巢湖)有限公司 (巢湖 238000)

二十二碳六烯酸(DHA),作為一種ω-3多不飽和脂肪酸,是人體必需的多不飽和脂肪酸,具有很多重要的生理功能,如調節人體的脂質代謝、降低血液粘稠度和膽固醇水平、降分,能促進嬰幼兒的腦部和視力的機能發育,有利于智力、學習和記憶能力的提高[1]。DHA目前存在的主要方式有兩大類,一是甘油三酯型(微藻油);二是乙酯型(魚油)。研究顯示,乙酯形式的DHA在人體內難以被消化吸收,游離形式易氧化,氣味口感難以被接受,而甘油酯形式的DHA既保持了原有的生物學活性和生理功能,不易氧化,又易于被人體吸收利用,氣味口感更加溫和。

微藻油與魚油二者DHA含量均較低,可以采用適當方法富集以提高DHA的含量。富集方式通常有兩種,即脂肪酶法和傳統的物理化學法。脂肪酶富集DHA主要通過酶促水解、酯化、酯交換、醇解等方式來實現。傳統物理化學方法主要有低溫結晶、金屬沉淀、尿素包合等。

與傳統的低溫結晶、金屬沉淀、尿素包合等物理化學富集方法相比,利用脂肪酶法合成富含DHA的甘油酯,具有高效性、選擇性好、產品質量高、反應條件溫和等優點[2]。因此利用天然的脂肪酶來富集DHA的方法越來越多的被學者們采用。研究表明,脂肪酶主要來源有兩大類:一是以動植物及真菌為代表的真核生物;二是以細菌等為代表的原核生物,二者的獲取既可采用組織提取方式又可采用微生物培養方式。脂肪酶即三?；视王；饷?它催化天然底物油脂水解,生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶,可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應等。脂肪酶也是一種活性蛋白質。因此,一切對蛋白質活性有影響的因素都影響酶的活性。酶與底物作用的活性,受溫度、pH值、脂肪酶濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響。

1 脂肪酶在富集DHA工藝中的應用

1.1 脂肪酶促水解

魚油甘油酯分子的三個酯鍵具有空間差異性,ω-3多不飽和脂肪酸大多位于2位上,而大多數脂肪酶作用在1,3位點。由于不同脂肪酶對于不同脂肪酸具有特異性,因此在脂肪酶的催化下,魚油發生選擇性水解,從而富集DHA。水解是一種平衡反應,因此DHA只能濃縮到一定水平。為了提高DHA的含量,可以重復水解反應混合物中分離出的含DHA組分。

朱東奇等[3]研究了重組米根霉脂肪酶(rProROL)的酶學性質,并且將其用于催化水解鳀魚油富集DHA,發現rProROL水解三油酸甘油酯時具有顯著的sn-1,3位置專一性。水解產生的甘油二酯中DHA含量達到19.7%,單甘酯中DHA含量達到25.2%,DHA的回收率可以達到65.6%。

劉國艷等[4]以小黃魚內臟精煉魚油為原料,通過脂肪酶選擇性水解法富集DHA和EPA,最終產物EPA和DHA甘油酯總含量為21.65%,高于精煉魚油(12.35%)。

1.2 脂肪酶促酯化

水解純化得到高純度的DHA后,先使DHA與甘油二者在酶存在體系下進行酯化反應,待反應達到平衡后進行分離提純。使用該方案能得到較高純度的DHA甘油三酯,但是工作效率較低,成本較高。

孫兆敏等[5]首先通過技術手段(氯仿-甲醇混合液)將裂殖壺菌總脂提取出來,然后在反應體系中加入特定脂肪酶,將其轉化為乙酯型,再借助分子蒸餾技術手段可將乙酯中的DHA含量由原有的40%提升至80%以上。另外,李道明等[6]使用原料為富含DHA的脂肪酸和甘油,在游離脂肪酶和固定化脂肪酶作用下通過兩階段酯化反應合成高含量甘油三酯。其中一階段先用游離脂肪酶催化,反應達到平衡時富含DHA脂肪酸的酯化率達到67%。二階段再利用固定化脂肪酶下催化上一步反應后的油相,結果顯示脂肪酸的轉化率提高到96%以上,甘油三酯的含量也可提高40%以上。

1.3 脂肪酶促酯交換

將DHA或其乙酯加入到含有DHA的甘油三酯中,再輔用酶催化酯交換反應,可得到更高DHA含量的甘油三酯。根據國外學者研究結果,原料甘油酯中DHA的初始含量和加入的DHA純度二者是脂肪酶促酯交換反應得到高純度DHA終產物的主要影響因素。相較于酯化,酯交換對高純度DHA要求較低,但其缺點也很明顯,反應速度相對較慢且反應不完全[7]。

李金章等[8]通過將乙酯型和甘油酯型相互轉換的方式,可以將乙酯型中的EPA、DHA富集到甘油酯型當中,得到的甘油三酯其EPA、DHA含量較高。鄭建永等[9]以乙酯型魚油和甘油酯型魚油為原料在米曲霉脂肪酶催化下進行酯酯交換反應得到高含量EPA/DHA甘油酯,探討了最優酶催化反應條件。在最優的酶催化反應條件下反應18 h,產物中EPA和DHA含量可達到接近40%左右。在優化條件下重復使用米曲霉菌絲體,產品中的EPA和DHA含量仍保持穩定狀態,變化較小。

1.4 脂肪酶促醇解

醇解產生的脂肪酸乙酯相較于水解產生的游離脂肪酸有易于分離的特點,因此被更多學者采用。脂肪酶在醇解反應時對長不飽和脂肪酸不敏感,反應效率較低,采用此方法可以將魚油中DHA轉化為甘油酯的形式富集。

醇解反應主要影響因素有:水分含量、醇的種類。研究者們對比了不同種類醇參與的醇解反應,研究發現月桂醇、乙醇和異丙醇等幾種醇是比較好的反應原料。

楊博等[10]對部分醇解魚油進行了研究,對油醇比、酶加量的相關實驗表明在油醇比2∶5、酶加量5%(質量比)條件下,魚油中DHA含量由26.1%提高了接近17%。潘志杰等[11]利用填充床酶反應器進行了脂肪酶催化精煉海洋魚油和乙醇通過連續式的部分醇解反應富集甘油酯型DHA和EPA的研究。

2 脂肪酶法的優化

2.1 脂肪酶催化反應條件的優化

影響脂肪酶催化反應的因素有很多,如反應底物配比、反應溫度、時間、酶種類、酶添加量等,通過實驗探討這些因素的影響規律,調節最優反應條件,使轉化效率達到最高,可節省生產成本,提高產品質量。

李麗帆等[12]使用固定化脂肪酶對粗魚油進行選擇性水解,分析了加酶量、含水量、溫度、反應時間對富集過程的影響規律,得出最優反應條件:2 g粗魚油,2.5 g水,221.3 U脂肪酶,30 ℃,反應11.7 h,再進行二次水解,EPA和DHA的質量分數分別從原始的4.2%和18.9%提高到8.5%和42%。

石紅旗等[13]對脂肪酶水解制備DHA甘油酯產品的工藝條件進行了研究,比較了數種脂肪酶對魚油水解的效果,發現國產解脂假絲酵母脂肪酶水解效果最佳。

多位學者對脂肪酶反應條件進行研究探索,酶種類來說國產解脂假絲酵母脂肪酶水解效果較好,其他反應條件如溫度、時間、底物濃度比等則需要更進一步的研究探索。

2.2 酶催化方法的優化

事實上,僅用脂肪酶催化酯化的方法并不高效,需要在催化反應之前對DHA進行提純操作。通過提純反應產物后,可得到由混甘油三酯的混合物,其中甘二酯含量最高。若使甘油三酯為主要成分的產物,可以通過將該混甘油三酯的混合物和一定量的游離脂肪酸進行酯化反應,使混甘油三酯的混合物中甘油三酯含量達到最高。

另外,還有學者采用兩階段酶法反應制備富含EPA/DHA的甘油酯。其中一階段先用游離脂肪酶催化,反應達到平衡時二階段再利用固定化脂肪酶下催化上一步反應后的油相,這樣可以得到以甘油三酯為主的EPA/DHA甘油酯產品。

通過提純以及采用兩階段酶法反應等優化方法來富集DHA,富集的DHA含量有顯著提升,這些優化方法值得被采用推廣。

2.3 與其它技術的聯用

2.3.1酶的優化

雖然脂肪酶催化活力高、專一性強、反應條件溫和,但游離酶難以與產物分離,且只能發生一次反應,對環境的耐受性差。為了提高酶的穩定性和回收利用率,常對脂肪酶進行固定化處理。諸如采用交聯、吸附、包埋、共價結合等方法對酶進行固定化處理。劉向前等[14]研究利用樹脂對脂肪酶Lipozyme CALB L進行固定化,然后將固定化酶用于催化富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯與甘油進行酯交換反應合成甘油酯。

酶催化反應一般在酶反應器中進行,其是根據酶的催化特性專門研究開發的一種設備,可以帶來的好處有:提高效率、降低成本、降低能耗,產生更好的經濟效益。

2.3.2蒸餾分離

分子蒸餾技術特別適于高沸點、易氧化、熱敏性物質的分離,被廣泛應用。具有如下特點:壓力低、受熱時間短、避免多不飽和脂肪酸的氧化、高真空、連續分離操作。

很多學者利用分子蒸餾技術分離脂肪酶促酯化和醇解之后的混合產物,從而富集產物中的DHA。另外,蒸餾還是降低魚油中游離膽固醇含量的一種有效途徑。在脂肪酶促反應過程中,魚油中的游離膽固醇會形成酯化形式,難以與油相分離。因此可以在脂肪酶催化反應之前,利用短程蒸餾去除膽固醇,在酶催化和提純后膽固醇含量仍保持在低水平。

與其他技術聯用能更大程度的發揮脂肪酶催化效果以及商業化程度,有著更好的經濟效益,為富集DHA提供更好的選擇。

3 結束語

與日本、歐美等國家相比,我國對于魚油中DHA富集的研究起步較晚,但近年來發展迅速,且取得一定成效。但還有以下方向可以探索:如活性更高的酶制劑、更好的酶固定化方法、更先進的DHA分離提純方法以及更新型的生物反應器等,致力于制備高純度高質量的DHA產品。隨著人們生活質量的提升,保健意識的增強,富含DHA的產品等保健產品具有廣闊的商業前景。