血清學檢測與PCR 技術在生豬常見疾病防控中的應用進展

張婷婷 泉州市泉港區農業農村和水務局 福建泉州 362801

1 檢測方法與技術

1.1 血清學檢測 血清學檢測是一種常用的豬疾病檢測方法， 基于體外的抗原-抗體特異性結合反應[1]。 在臨床上，可以利用已知的抗原或特異性抗體來鑒定患畜血液中相應的抗體或抗原。 利用血清學檢測技術，不僅能夠評估豬群的免疫效果、監測疾病的流行情況，而且還可以確定最佳免疫時機，制定更為合理的免疫計劃[2]。 常見的血清學反應根據抗原-抗體反應所產生的現象與結果， 可大致分為以下五種類型：凝集反應（直接凝集和間接凝集）；沉淀試驗（絮狀沉淀試驗、瓊脂擴散試驗和免疫電泳）；補體結合反應；標記抗體反應（熒光抗體、酶標抗體、放射性標志抗體和發光標志抗體等）；中和反應。

1.2 聚合酶鏈式反應技術 聚合酶鏈式反應（PCR）是一種新型的實驗室技術，在醫學領域、生物學、獸醫等領域均廣泛應用。 PCR 的優勢之一就是可以在體外進行DNA 復制， 將少量甚至是微量的DNA 進行大量擴增，有利于對疾病或病原微生物等進行鑒定。

2 豬場常見疾病檢測的研究現狀與進展

2.1 豬瘟 豬瘟 （CSF） 是由豬瘟病毒 （CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病， 可造成全球性范圍的傳播感染[3]，被列為我國中長期動物疾病防治規劃（2012-2020）中優先防控的十六種動物疾病之一[4]。雖然豬瘟兔化弱毒苗在一定程度上抑制生豬疫情的大面積傳播， 但我國許多地方還是有零星暴發或小規模傳播，而且伴有非典型豬瘟、溫和型或繁殖障礙型豬瘟，為豬瘟的防治增加了新的難度。

Tu 等[5]將分離自中國的130 株豬瘟病毒的E2基因序列進行分析， 發現我國流行的豬瘟優勢毒株主要是基因1 型和2 型。 張洪亮等[6]通過對一些已進行豬瘟免疫的規模豬場所出現的疑似豬瘟感染病例進行豬瘟病毒的分離鑒定， 發現所分離到的毒株為2.1d 基因亞型。 魏春華等[7]利用PCR 技術對E2基因進行擴增及序列分析， 發現所分離的毒株屬于1.1 亞群和2.1 亞群。焦秋林等[8]建立E2 基因的遺傳進化樹， 表明分離株與2.1d 亞群毒株親緣關系最近， 屬于變異毒株。 這些研究都指出相應地區的豬瘟病毒流行株正在向遠離疫苗株的方向變異。

隨著豬瘟病毒流行的不斷發展和變化， 臨床癥狀逐漸非典型化，因此，為了更加快速準確地做出判斷，往往需要結合實驗室診斷結果進行判斷。常用的豬瘟病毒實驗室診斷方法有正向間接血凝試驗（IHA）、間接ELISA、 膠體金免疫層析試紙條（GICA）和瓊脂擴散試驗（GDP）等。 感染豬瘟病毒后，一般在10～15 d 內即可出現中和抗體，利用ELISA 方法可及時檢出。 馬超英等[9]應用IHA、ELISA、GICA 和GDP 這四種方法分別對142 份豬瘟陽性血清樣品進行檢測， 研究結果顯示間接ELISA 的靈敏性最高，而膠體金層析試紙條的靈敏性最低。

目前， 仍有不少豬場中出現豬瘟病毒感染和免疫計劃失敗的現象， 而導致該現象的主要因素除流行的病毒株在變化外， 更主要的因素則是部分豬場的豬瘟疫苗免疫規劃不能嚴格地根據血清學檢查結果來制訂，從而造成在錯誤的時機免疫，引起母源抗體干擾從而導致免疫計劃失敗[10-11]。 通過血清學方法檢測豬瘟的抗體水平， 一方面可以直接反映豬群的健康狀況， 另一方面養豬場可以直觀了解到現行的免疫程序是否合適，而且通過豬瘟抗體的檢測，還可以及時淘汰不能留作種用的后備種豬。

2.2 豬繁殖與呼吸障礙綜合征 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種“災難性”疾病，傳播迅速。 該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （PRRSV），可以感染任何日齡的豬， 以妊娠母豬和哺乳仔豬最易感[12-13]。

PRRS 抗體的檢測方法有ELISA、膠體金免疫層析試紙條（GICA）和免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）。 IPMA 檢測方法由Wensvoort G 等建立，不但能夠用于檢測抗原，而且可用于檢測抗體，是歐洲很多發達國家使用的血清學檢測方法。 ELISA 檢測方法是我國檢測PRRS 抗體最常用的方法， 適合用于大規模樣品的檢測。在抗體陽性的基礎上，再利用RT-PCR 技術對PRRSV 進行檢測，可以提高檢測的準確性。使用血清學檢測方法，可以協助豬場篩查后備種豬、淘汰陽性表達的感染型種豬，并有效檢測是否出現了持續性感染豬只， 是豬場及早進行制訂免疫規劃及凈化計劃的工具基礎[14-15]。

2.3 口蹄疫 口蹄疫（FMD）是一種由口蹄疫病毒（FMDV）引起的可感染偶蹄類動物（如豬、牛、羊）的高度傳染水泡性疾病[16]。 幼齡動物感染后的病死率接近100%[17]； 成年動物感染口蹄疫后雖然病死率低，但是發病率極高，嚴重影響感染動物的正常生長發育， 導致生產能力大幅減少， 被定為一類動物疫病[18]。

口蹄疫從發現到現在已有500 多年的歷史，其中流行范圍最廣的是O 型[19]，幾乎所有的國家都暴發過口蹄疫，引起了各個國家的高度重視[20]。雖然我國對口蹄疫的防控措施到位， 但是目前仍有部分地區散發性出現，主要原因是從國外引種，導致國外毒株不斷傳入，因此，針對口蹄疫進行快速診斷必不可少[21-22]。

口蹄疫的血清學檢測方法，一般分為ELISA、病毒中和試驗（VNT）、瓊脂擴散試驗（AGID）、補體結合試驗（CFT）、免疫熒光試驗（IFA）、凝集試驗（AT）和正向間接血凝試驗（IHA）。 其中，ELISA 方法應用最為廣泛，研究也最多。目前在我國相對成熟的有亞洲I 型、O 型和A 型固相含量競爭ELISA 抗體篩查方法和非結構蛋白抗體的特異性單抗阻斷ELISA。高得吼等[23]為了節省IHA 的血凝抗原，在不影響檢測結果的情況下，探索和改進了原來的IHA 檢測方法，對IHA 標準進行了簡化，并分別進行了乳牛和仔豬口蹄疫O 型血清抗體的測定，數據統計分析發現，免疫合格率也分別超過了97.5%和92.5%，在此基礎上，不僅減少了檢測成本，同時還節約了檢測時間，提高了檢測效率。盧順等[24]使用人工合成的包括有O 型口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC 上主要抗原表位中原核表達的蛋白質為包被體抗原， 并使用間接ELISA， 確定了抗原的最大包被物含量和對新鮮血清樣本的最佳溶液稀釋率， 對原來的間接ELISA方案加以優化， 首先對臨床上220 份豬血清進行測定，同時用上海優耐特VP1 結構蛋白ELISA 試劑盒進行重復測定， 結果表明2 種試劑盒檢測結果的總符合率為87.27%。

2.4 豬圓環病毒病 豬圓環病毒?。≒CVD）是由豬圓環病毒（PCV） 引起的一種多系統功能障礙性疾病，導致機體免疫抑制，臨床上以新生仔豬先天性腦震顫和斷乳仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）最為常見[25-26]。 由于PCV-2 能夠對感染動物的免疫產生破壞，引起免疫抑制，所以，養殖戶必須做好定期的血清學檢查來確定豬群的抗體水平， 判斷疫苗免疫是否成功[27-28]。

常見的PCV-2 抗體篩查手段有間接ELISA、競爭ELISA、膠體金免疫層析試紙條（GICA）和間接免疫熒光試驗（IFA）。 李春燕等[29]將非結構蛋白ORF3用作包被性抗原， 建立PCV-2 的間接ELISA 檢測法，檢測結果與PCR 檢測結果高度一致，有利于在臨床上對rCap 蛋白基因工程苗免疫的豬場進行鑒別診斷。 歐陽素貞等[30]用間接ELISA 方法檢測338份血清中PCV-2 抗體陽性率為40.6%，引起養殖戶和相關部門的重視，及時干預，避免造成不必要的損失。 王慧杰等[31]將PCV-2 的衣殼蛋白與膠體金免疫技術融合，形成了一個全新的抗體膠體金檢測方式，可以高效分辨PCV-2 的標準陽性血清與陰性血清，同時具有較大的生物特異性。 蘆銀華等[32]使用豬腎傳代細胞系PK-15 來擴增PCV-2 制備抗體， 并建立對PCV 的抗體間接免疫熒光試驗， 為PCV 的流行病學調查提供了一種新的手段。

2.5 偽狂犬病 偽狂犬?。≒R）是由皰疹病毒科的偽狂犬病毒（PRV）感染引起的一種急性傳染病，而且感染了PRV 的豬會終生帶毒并向體外持續排毒，感染其他動物[33]，被納入“中國中長期動物疫病防治規劃（2012-2020）”，但目前尚未實施強制免疫接種政策。 因為PRV 容易通過空氣傳染，同時也會引起潛伏傳染，對偽狂犬病的預防造成很大的麻煩[34-35]。目前，國際上針對偽狂犬病的防治主要采取隔離、檢疫、淘汰陽性感染和免疫接種[36]。

常見的PR 抗體測定方式有ELISA、 乳膠凝集試驗（LAT）、GICA、SNT 和IFA 法等。 國內外實驗室廣泛使用的是gB/gE-ELISA 方法，對待檢樣品中的抗體具有高度的特異性[37]。 其中gB-ELISA 一般用于評估疫苗的免疫水平，gE-ELISA 一般用于檢測是否發生PRV 野毒株感染。 gE-ELISA 是針對疫苗株中存在缺失的gE 糖蛋白質而形成的一個鑒別ELISA，具有高度靈敏性和特異性。Kimman 等[38]以桿狀病毒表達的gE 重組蛋白作為抗原， 形成了一個全新的間接型雙抗夾心gE-ELISA。黃駿明等[39]用混合纖維素酯的微孔過濾器用作固相支撐物進行斑點-ELISA (Dot-ELISA)， 與常規試劑盒相比，Dot-ELISA 法的陽性檢出率明顯高于常規試劑盒，且已投放市場使用。 王生育等[40]采用ELISA 試劑盒和GICA 方法對64 份豬血清進行測定，2 種方法的測定準確率高度統一， 說明2 種方法都可進行實驗室檢查，具有微量、特異、準確的優點。

4 總結與展望

血清學檢測作為一種常規的疫病監測手段，在生豬養殖業中得到廣泛應用， 通過檢測動物體內的抗體水平，可以迅速診斷某些病原的感染情況。PCR技術作為一種分子生物學技術， 也廣泛應用于生豬常見疾病病原檢測和監測。 PCR 技術可以通過檢測病原的核酸序列，實現對病原的高靈敏度、高特異性檢測。 總的來說，血清學檢測和PCR 技術在生豬常見疾病防控中的應用前景十分光明。 隨著技術的不斷突破和創新，兩種技術將發揮更大的作用，為生豬行業提供更準確、 快速和精細化的疫病診斷和防控措施，保障生豬生產的健康和可持續發展。 未來，期待可以借助更先進的技術平臺和更全面的抗原檢測，實現對更多病原的敏感、準確和高通量檢測，以加強疫病監測和防控工作。