嘌呤核苷酸補償對海洛因依賴大鼠腦組織中TPH和GTPCH基因表達的影響

李鴻梅,李 坤,何海濤,劉劍凱,洪 敏

(吉林大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室,吉林長春 130021)

嘌呤核苷酸補償對海洛因依賴大鼠腦組織中TPH和GTPCH基因表達的影響

李鴻梅,李 坤,何海濤,劉劍凱,洪 敏*

(吉林大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室,吉林長春 130021)

目的研究嘌呤核苷酸補償對海洛因依賴大鼠腦組織中色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)、GTP環水化酶1(GTP cyclohydrolase 1,GTPCH)基因表達的影響。方法劑量遞增腹腔注射海洛因,建立海洛因依賴大鼠模型,50只正常雄性Wistar大鼠隨機分為對照組(C)、海洛因組(H)、海洛因補償AMP+GMP組(HAG)、海洛因補償AMP組(HA)、海洛因補償GMP組(HG),每組10只。Real-time PCR法測定各組大鼠腦組織中TPH和GTPCH1基因的表達。結果與C組比較,H組大鼠腦組織中TPH基因表達下降71%(P＜0.05);與H組比較,HAG,HA和HG組大鼠腦組織中TPH基因表達分別升高60%,100%和150%(P＜0.05)。與C組比較,H組大鼠腦組織中,GTPCH基因表達下降43%(P＜0.05);與H組比較,HAG,HA和HG組大鼠腦組織中GTPCH基因表達均有所升高,但差異不顯著(P＞0.05)。結論海洛因給藥使大鼠腦組織中TPH,GTPCH基因表達下調;嘌呤核苷酸補償可以減弱海洛因對TPH和GTPCH基因表達的影響。

嘌呤核苷酸;海洛因;色氨酸羥化酶;GTP環水化酶

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0026)

急性全身性給予阿片類可以使5-HT的合成增加[1],并使TPH的活性增強[2]。急性給予嗎啡可以使前腦廣泛區域內5-HT的循環和釋放增加[3]。本實驗室前期研究發現,長期應用嗎啡、海洛因等阿片類物質可引起嘌呤核苷酸分解過度,表現為分解代謝終產物尿酸增加,分解代謝關鍵酶腺苷脫氨酶(ADA)和黃嘌呤氧化酶(XO)活性增強[4-7]。我們前期的研究結果還表明,長期慢性給予海洛因可以使海洛因依賴大鼠腦組織中5-HT及其代謝產物5-HIAA及TPH的含量都下降;嘌呤單核苷酸補償能使海洛因依賴大鼠腦組織中5-HT和5-HIAA的含量增加,并能夠增加TPH的含量[8]。四氫生物喋呤(BH4)是生物體內羥化酶(如TH,TPH)的重要輔助因子,而BH4是由GTP環水化酶1(GTPCH)以GTP為底物催化合成的,因而GTPCH基因的表達水平必定會影響GTP含量以及羥化酶的表達。本實驗中,我們用適時RT-PCR方法分析了海洛因依賴及嘌呤核苷酸補償大鼠腦組織中TPH和GTPCH基因表達的變化,以探討海洛因使神經遞質5-HT含量下降及嘌呤核苷酸補償對5-HT含量影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 正常雄性Wistar大鼠50只,體重(200±20)g,由吉林大學實驗動物中心提供。海洛因(純度為99%)由吉林省公安廳提供,臨用時用滅菌三蒸水溶解。Trizol及適時 RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產品(SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit,Lot BK1301),其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法 50只大鼠隨機分為5組,每組10只,普通固體飼料,自由飲水,同條件飼養。①對照組(C):每日2次腹腔注射(ip)生理鹽水,注射體積和時間與當天實驗組相同,第10天處死。②海洛因給藥組(H):第1-9天每日早晚2次注射海洛因,日劑量分別為0.5,0.75,1.25,2.0,3.0,4.25,5.75,7.5,and 7.5mg/kg體重,第10天處死。③海洛因給藥補償AMP+GMP組(HAG):海洛因給藥同海洛因組,同時腹腔注射等摩爾混合的AMP+GMP,給藥濃度為7.5 mg/kg體重,第10天處死。④海洛因給藥補償AMP組(HA):第1-9天給藥時間與劑量同海洛因給藥組,同時腹腔注射AMP,給藥濃度為7.5 mg/kg體重,第10天處死。⑤海洛因給藥補償GMP組(HG):第1-9天給藥時間與劑量同海洛因給藥組,同時腹腔注射GMP,給藥濃度為7.5 mg/kg體重,第10天處死。各組動物均腹腔注射水合氯醛麻醉,斷頭后冰上快速取腦,分離中腦后-80℃保存。

1.3 腦組織中TPH、GTPCH基因表達的分析 取液氮中凍存的腦組織100 mg,4℃條件下以Trizol試劑提取總 RNA,定量后反轉錄成cDNA。Real-Time PCR引物:以Primer 5軟件設計大鼠TPH基因、GTPCH基因及β-actin mRNA嵌合熒光Real-Time PCR引物,經檢索Blast驗證特異性。TPH基因(NM-001100634):上游引物:5-TGGAGACTGTCCCTTGGT-3,下游引物:5-TAGCCAGCTCTGCGAAAT-3,產物長度:153 bp;GTPCH基因(NM-024356):上游引物:5-AGAACGCCTTACCAAACAGA-3,下游引物:5-CCCGAGTCTTTGGGTCTT-3,產物長度 :179 bp;β-actin 基因(NM-031144):上游引物:5-AAGAGAGGCATCCTGACCCT-3;下游引物:5-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3,產物長度:218 bp。適時PCR條件為:95℃,10 s;40 cycles(95℃,5 s,61℃,31 s)。

1.4 統計學方法 數據以比較Ct值法(△△Ct)對基因表達進行分析,所有假設檢驗以0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 嘌呤核苷酸補償對大鼠腦組織中TPH基因表達的影響

如圖1所示,與對照組比較,海洛因組大鼠腦組織中TPH基因表達下降71%(P＜0.05);與海洛因組比較,HAG,HA和HG組中TPH基因表達分別升高60%,100%和150%(P＜0.05)。

圖1 大鼠腦組織中TPH基因表達

2.2 嘌呤核苷酸補償對大鼠腦組織中 GTPCH基因表達的影響

如圖2所示,與對照組比較,海洛因組大鼠腦組織中GTPCH基因表達下降43%(P＜0.05);與海洛因組比較,HAG,HA和HG組GTPCH基因表達分別升高39%,4%和21%,但差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 大鼠腦組織中GTPCH基因表達

3 討論

TPH是5-HT合成的限速酶,BH4是色氨酸羥化酶發揮最適催化活性的重要輔助因子。盡管BH4對TPH的確切作用機制還不清楚,但是越來越多的證據表明,BH4是羥化酶重要的變構調節劑及氧化還原反應的輔助因子[9,10,11]。BH4是以GTP為底物,經過一系列酶的催化作用而生成的[8],BH4的水平除了取決于底物GTP含量外,還取決于GTP環水化酶(GTPCH)的活性和該基因表達水平的高低,GTPCH是合成BH4的一系列酶促反應的第一個酶,也是BH4生物合成的限速酶[12,13,14]。我們的研究結果表明,海洛因使大鼠腦組織中GTP含量下降(文章待發表)、TPH基因和GTPCH基因表達下調;GTPCH基因表達下調,很可能會導致BH4生成減少以及TPH催化活性的下降,并最終導致5-HT和5-HIAA含量下降。補償嘌呤核苷酸后,大鼠腦組織中GTPCH基因表達比海洛因組大鼠高。AMP和GMP在生物體內經過兩次激酶的催化和轉化后可生成GTPCH的底物GTP。AMP和GMP通過激酶的催化生成GTP,使GTP水平升高(文章待發表),并使GTPCH基因的表達也升高,其機制可能是底物對酶的正反饋調節作用。GTP含量的升高以及GTPCH基因表達水平的升高,可能會使BH4的生成增多以及TPH含量升高、催化活性增強,并最終使5-HT和5-HIAA含量升高。能使腦中5-HT含量升高的藥物,如氟西汀和5-羥色氨酸,可以消除慢性嗎啡依賴并戒斷的大鼠對嗎啡相關環境的偏愛,當將氟西汀顯微注射到大鼠伏隔核時,也能觀察到相似的結果,氟西汀還能改善嗎啡戒斷大鼠的焦慮狀態[15]。這提示嘌呤核苷酸具有治療阿片成癮及減輕阿片戒斷癥狀的潛能。

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Effects of purine nucleotides compensation on TPH and GTPCH gene expression in heroin dependent rats

LI Hong-mei,LI Kun,HE Hai-tao,et al.(Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of purine nucleotides compensation on the expression of tryptophan hydroxylase(TPH)and GTP cyclohydrolase(GTPCH).MethodsRatswere administered with heroin by intraperitoneal injectionwith increasing dose to develop addiction models.Fifty male Wistar rats were divided into five groups:control group(C),heroin group(H),heroin plus purine mononucleotides(AMP+GMP,equal mole mixture)group(HAG),heroin plus adenosine monophosphate(AMP)group(HA),heroin plus guanosine monophosphate(GMP)group(HG).TPH and GTPCH gene mRNA were analyzed by real-time PCR.ResultsTPH gene expression was decreased by 71%in H group when compared with C group(P＜0.05);in HAG,HA and HG group,TPH gene expressionwasincreased by 60%,100%and150%respectively when comparedwithH group(P＜0.05).GTPCH gene expression was decreased by 43%in H groupwhen compared with C group(P＜0.05);in HAG,HA andHG group,GTPCH gene expression was increasedwith no significant differences(P＞0.05).ConclusionAdministration of heroin can decreased the expression of TPH and GTPCH gene;purine nucleotides compensation can attenuate the effect of heroin on TPH andGTPCH gene expression.

Purine nucleotides;Heroin;TPH;GTPCH

Q786

A

1007-4287(2010)01-0026-03

吉林大學重大重點項目發展啟動基金資助項目(No 200602037);吉林省科技發展計劃項目(No 20080435-2)

*通訊作者

李鴻梅(1975-),女,博士生,主要從事阿片的作用機制及治療研究;洪敏(1945-),男,教授,博士生導師,研究方向:阿片的作用機制及治療。

2009-05-11)