葛根異黃酮的分離與純化

肖芳

（錫林郭勒職業學院，錫林浩特026000）

·基礎研究·

葛根異黃酮的分離與純化

肖芳*

（錫林郭勒職業學院，錫林浩特026000）

通過單因素試驗和正交試驗探討了葛根異黃酮的浸取工藝，并對大孔樹脂對葛根異黃酮純化進行了詳細研究。試驗結果表明：浸提時，在溫度為70℃的條件下，用料液比1 g∶8 mL體積分數為50%的乙醇，浸提2.5 h，葛根異黃酮浸取率最高；對6種商品化大孔樹脂吸附純化葛根異黃酮的性能進行對比篩選，發現AB－8樹脂最適合葛根異黃酮的純化；洗脫劑乙醇體積分數為70%，工作液流速為2 BV/h，浸提濃縮液pH值為5時，采用AB-8大孔吸附樹脂串聯柱對葛根異黃酮進行純化，其效果最優，產品的收率和純度都較高。

葛根；異黃酮；提??；大孔吸附樹脂；純化

AbstractTheoptimumextractingtechnologyof isoflavonoids from pueraria lobata（Wiolld.）Ohwi was investigated by using the factorial and orthogonal design, and macroreticular resin was used for the purification of pureraria isoflavonoids.The results showed that 70℃，8∶1（v/w）of 50%ethanol and 2.5 hours were the optimum ondition for the extracting of isoflavonoids from pueraria lobata（Wiolld.）Ohwi.The purification pueraria isoflavonoids with 6 commercial macro reticular resins was studied；the results showed that AB-8 was the most appropriateresinforthepurificationofpueraria isoflavonoids.With an ethanol desorption agent concentration of 70%，work solution speed of 2 BV/h and work solution pH of 5，contacted AB-8 resin column can reach a reasonable yield and purityofproduct.

KeywordsPueraria lobata（Wiolld.）Ohwi；Isoflavonoids；Extraction；Macro reticular resin；Purification

葛根（Radix Pueraria），是豆科植物葛（Puerar Lobatel（willd）.Ohwi）的塊根，含有葛根素、葛根木糖苷、大豆甙、大豆甙元等多種異黃酮類物質，干物質含量為50 mg/100 g，其味甘、辛、性平，既是中藥材又是營養豐富的食用原料，且《神農本草經》中列為中品，并為中國藥典所收載。葛根中異黃酮是一種毒性極低的安全藥物，具有解肌退熱，生津止渴、降低心肌耗氧量、增加冠脈腦血管流量、緩減心絞痛、抗心肌缺血、抗心律失常、抗氧化、降低血壓、降低血糖、調節血脂、解毒、增強機體免疫力等多種藥理作用。葛根的粗提物中含多種成分，入藥時，必須對粗提物進行選擇分離，提高異黃酮的純度。選擇性分離的一種有效方法是利用大孔樹脂吸附，大孔樹脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生簡單、解吸條件溫和、使用周期長、宜于構成閉路循環、節省費用等諸多優點。

我國湖南、廣西、江西及西南地區均有豐富的野生葛根資源，同時市場對葛根黃酮需求量越來越大，但我國科技投入不足，葛根異黃酮制取技術相對落后、生產效率低、耗能大、雜質含量高、產品缺乏市場競爭力，因此，本文對葛根異黃酮提取及對粗提物進行純化提高葛根異黃酮的純度，均有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

層析柱（上海滬西分析儀器廠）；SP-2100型紫外-可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司；KQ-1500型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；電熱數碼恒溫水浴鍋（金壇市華儀器有限公司）；RE-86旋轉蒸發器（上海本波儀器有限公司）；LD5-2A離心機（北京醫用離心機廠）；電子稱；烘干箱等。

1.2 材料與試劑

葛根（野生，重慶合川）；葛根素（中國藥品生物制品檢定所）；AB-8大孔樹脂（南開大學）；pH試紙；乙醇；NaOH；HCl等均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 葛根異黃酮浸提及純化工藝流程

葛根→粉碎→乙醇浸提→過濾→濃縮→乙醇沉降水溶性雜質→濃縮→大孔樹脂吸附→蒸餾水洗脫→乙醇洗脫→收集洗脫液

1.3.2 葛根異黃酮含量的測定

1.3.2.1 標準曲線的繪制

以葛根素為標準物，用紫外分光光度法測定。準確稱取葛根素標準品5 mg，置于25 mL容瓶中加體積分數為95%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，從中分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL溶液置于6個10 mL的試管中，各加乙醇體積分數為95%的乙醇1 mL，用蒸餾水將體積定容至10 mL，搖勻，以第一管為對照，在250 nm處測吸光值D（λ）與葛根素含量（ρ）之間的關系作為異黃酮測定標準曲線方程，該方程為D（λ）=83.4ρ－0.032，γ=0.9999，得標準曲線（見圖1）。

圖1 葛根異黃酮測定的標準曲線

1.3.2.2 浸提物中總異黃酮含量的測定

將浸提溶液過濾，濾液混勻，準確吸取1 mL置入100 mL容量瓶中，加入體積分數95%的乙醇至刻度，搖勻，在250 nm波長下測定其吸光度，以同樣乙醇作空白，并根據標準曲線方程計算葛根中異黃酮的含量。

1.3.3 AB-8型大孔樹脂預處理

將AB-8樹脂先用乙醇浸泡24 h充分溶脹，濕法裝柱。然后用95%乙醇洗至洗出液加適量水無白色混濁現象，再用蒸餾水洗盡醇，最后轉入酸堿處理：用4B體積分數的質量分數5%HCl溶液，以5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡3 h，而后用蒸餾水以同樣的流速洗至流出水pH值為中性；再用4BV的質量分數5%NaOH溶液，以5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡3 h，而后用蒸餾水以同樣的速度洗至流出水pH值呈中性。

1.3.4 葛根異黃酮的純化

將浸提的異黃酮濃縮液上柱，控制流速3 mL/min～5 mL/min，當溶液全部吸附后，用蒸餾水洗脫至流出液為無色，然后用乙醇進行洗脫至流出液為無色，將乙醇洗脫液收集在容器中，測其吸光度，并計算出異黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1 葛根異黃酮提取的單因素試驗

2.1.1 溶劑體積分數對葛根異黃酮浸提效果的影響分別用體積分數不同的乙醇溶液對葛根浸提，

可以發現隨乙醇體積分數的增加，浸出物的顏色由棕黑色逐漸變為黃褐色。結果（見表1）表明：乙醇體積分數為50%時，葛根異黃酮的含量最高，浸提效果較好。

表1 乙醇體積分數對葛根異黃酮浸提效果的影響

2.1.2 固液比對葛根異黃酮浸提效果的影響

在溶劑體積分數為最佳條件時，以能浸沒樣品的最少溶劑量為基礎，確定最低限度固液比為1 g∶6 mL，改變固液比的試驗結果（見表2）表明：當固液比為1 g∶8 mL時，浸出物異黃酮含量達最高，隨著固液比減小，含量略降。

表2 固液比對葛根異黃酮浸提效果的影響

2.1.3 提取時間對葛根異黃酮浸提效果的影響

在確定提取溶劑濃度、固液比之后，考察提取時間對浸提效果的影響。結果（見表3）表明：浸提2 h后基本達平衡。原因可能來自兩個方面，一是生物活性成分異黃酮葛根素、大豆甙、大豆元等存在于外部的木栓層下面的外部薄層組織中，二是磨碎后的葛根粉容易被溶劑浸透，2 h后，活性物質在固相和液相的濃度就達到了平衡。

表3 提取時間對葛根異黃酮浸提效果的影響

2.1.4 提取溫度對葛根異黃酮浸提效果的影響

在溶劑體積分數、固液比和提取時間都為最佳條件時，采取不同的提取溫度對葛根異黃酮進行浸提，結果（見表4）表明：提取溫度為70℃時效果最佳。一般來說異黃酮隨溫度升高而在乙醇中溶解度增大，因為溫度升高異黃酮浸取液黏度減小，擴散系數增大，促使浸提速度加快，浸取率提高，浸出物異黃酮含量增加；但溫度太高，會使乙醇揮發損失，致使溶劑體積分數下降，達不到最佳效果，表4中溫度為90℃時黃酮含量明顯降低就是此原因。同時溫度太高，某些活性成分可能遭到破壞，雜質溶出增多，操作不便，故浸提時溫度不能太高。

表4 提取溫度對葛根異黃酮浸提效果的影響

2.2 葛根異黃酮提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對影響葛根異黃酮浸提效果的因素進行了正交試驗，因素水平見表5，正文試驗結果見表6。表明，4個因素對浸出物異黃酮含量的影響與前面單因素試驗結果趨勢一致，對浸出物異黃酮含量影響主次關系順序為：溶劑體積分數＞固液比＞溫度＞時間；最佳的提取工藝條件為：乙醇體積分數為50%、固液比為1 g∶8 mL、時間為2.5 h、溫度為70℃。

表5 正交試驗因素水平表

表6 正交試驗表

2.3 葛根異黃酮提取液的制備

經正交試驗，得出提取葛根異黃酮的最佳組合因素，以此組合因素對葛根進行浸提，提取液異黃酮含量為2.34 mg/mL，將提取液濃縮至最小體積，加3～4倍體積分數為95%乙醇沉降水溶性高分子多糖、蛋白質雜質，經離心去除沉淀，經旋轉蒸發器濃縮得葛根異黃酮提取濃縮液，經測定其葛根異黃酮的含量為11.93 mg/mL，備用。

2.4 葛根異黃酮的大孔樹脂純化

2.4.1 大孔吸附樹脂對葛根異黃酮的靜態吸附效果比較

將經過預處理的6種大孔樹脂去除表面水后，各取2.5 g分別置于具塞磨口三角瓶中，加入異黃酮會含量為11.93 mg/mL的提取濃縮液25 mL，振蕩24 h，使樹脂充分吸附異黃酮后測定樹脂的靜態吸附效果，過濾取出吸附飽和的樹脂（得濾液1），向其中加入50 mL體積分數95%乙醇振蕩24 h使異黃酮解吸附，再過濾（得濾液2），分別測定濾液1和濾液2中異黃酮的含量，結果如表7。

表76 種大孔樹脂對葛根異黃酮的靜態吸附效果比較

由表7可以看出，6種樹脂對葛根異黃酮的吸附率AB-8和ADS-5l較高，分別達到26.91%和27.49%；解吸率AB-8、HPD600和ADS-17的較高，都達到了90%以上，解吸效果非常優良；而ADS-5樹脂的解吸效果一般，只有86.82%。和有關文獻對比，本研究樹脂對異黃酮的吸附率普遍較低，其原因可能是其他研究大都利用純化的標準品進行實驗，而本研究直接以葛根異黃酮提取濃縮液為材料，提取液中的其他成分可能是造成這種差異的主要原因。綜合對比之下，AB-8樹脂對葛根異黃酮的吸附效果最好，因此，下面進一步對AB-8樹脂對葛根異黃酮的動態吸附進行探討。

2.4.2 AB－8樹脂的動態吸附及解吸附效果

選用D20 mm×L300 mm的層析柱，濕法裝柱，樹脂床體積為120 mL，料液中葛根異黃酮量為1.50 mg/mL，料液以1BV/h速度通過樹脂柱床，共處理7 BV料液，每處理1BV料液的流出液單獨收集，測定流出液中異黃酮的含量，結果見圖2。從圖2中可以看見，AB－8樹脂吸附異黃酮濃度為1.50mg/mL料液時，從第二樹脂床體積異黃酮就有很大泄漏，流出液中異黃酮濃度高達1.001 mg/mL，但樹脂床飽和吸附可達6BV。只有樹脂達到完全飽和時才能充分發揮其吸附性能，因此考慮生產中采用樹脂柱串聯的方法。

圖2 A B-8樹脂對葛根異黃酮的動態吸附效果

2.4.3 乙醇體積分數對AB－8樹脂洗脫效果的影響

將濃縮液注入樹脂柱中，待樣品液全部通過吸附柱后，用蒸餾水洗至流出液呈澄清狀態，然后再分別用不同體積分數乙醇洗脫，將洗脫液經旋轉蒸發濃縮、真空干燥，測定異黃酮得量和純度（見表8），由表8可以看出體積分數95%乙醇洗脫異黃酮收集率最高，達79.79%，而體積分數70%乙醇洗脫后異黃酮純度最高，為34.20%，因此，本試驗認為采用體積分數70%乙醇洗脫可以較好地達到純化葛根異黃酮的目的。

表8 不同乙醇濃度對樹脂洗脫效果的影響

2.4.4 流速對AB-8樹脂吸附性能的影響（見表9）

表9 不同流速對AB-8樹脂吸附性能的影響

從表9可知，流速不同，異黃酮的洗脫率和收率也不同，在1 BV/h～3 BV/h內，隨著流速的增加，異黃酮的收率隨之下降?？紤]到工作的效率和異黃酮洗脫率，選用2 BV/h流速較為適當。

2.4.5 原液pH值對AB－8樹脂吸附性能的影響（見表10）

表10 pH值對AB-8樹脂吸附性能的影響

異黃酮類物質屬多酚類化合物，pH影響異黃酮物質在水中的溶解性從而影響樹脂對其吸收附性能。試驗中發現葛根異黃酮原液在較低pH時，溶液呈絮狀渾濁狀態，而隨pH增加，原液逐漸澄清，并且不同pH值原液在樹脂柱中的擴散轉移速度也有明顯差異，pH值越低，其擴散轉移速度越慢。由表10可以看出，其純度隨pH值變化的而變化，pH3時，產物純度最高，達48.98%；而pH5時，收率最高，達2.31%。但是試驗中發現pH值為3和4時，絮狀物在樹脂柱上部形成沉淀，對樹脂床污染和堵塞嚴重，因此認為適宜pH值為5。

3 結論

用乙醇溶液提取葛根異黃酮時，通過四組單因素試驗和四因素三水平正交試驗，以及用大孔樹脂純化葛根異黃酮，通過四組單因素的試驗，試驗結果表明：

a）提取葛根異黃酮時，溶劑乙醇體積分數為50%、固液比為1 g∶8 mL、提取溫度為70℃、提取時間為2.5 h時，浸出物中異黃酮的含量最高。

b）對6種樹脂吸附葛根異黃酮性能進行對比篩選，發現AB－8樹脂最適合葛根異黃酮的純化。實驗結果表明，洗脫劑乙醇體積分數為70%、工作液流速為2BV/h、浸提濃縮液pH值為5時，采用AB-8大孔吸附樹脂串聯柱對葛根異黃酮進行純化，其效果最優，產品的收率和純度都較高。

［1］楊明毅，史勁松.葛根的綜合利用及深加工［J］.常德師范學院學報，2001，13（1）：74-75.

［2］肖培根.新編中藥志（上卷）［M］.北京：化學工業出版社，2002：902-970.

［3］凌關庭.保健食品原料手冊［M］.北京：化學工業出版社，2002：442-449.

［4］趙浩如，郜風香.葛根總黃酮的提取方法研究［J］.中成藥，2000，22（11）：756-757.

［5］［美］K·R·馬卡姆.黃酮類化合物結構鑒定技術［M］.北京：科學出版社：1993，1-3.

［6］李勇，高明俠.銀杏及葉中黃酮類化合物生理功效的研究進展［J］.食品科技，2001（5）：72-73.

［7］趙國華，陳宗道.柑桔類黃酮生物活性的研究進展［J］.食品與發酵工業，2001，27（3）：71-75.

Extracting and purification ofIsoflavonoids from pueraria lobata(Wiolld.)Ohwi

XIAOFang*
（XiLinGuoLe vocational college，Xilinhaote 026000，China）

*肖芳，女，1977年出生，2003年畢業于西南農業大學，食品科學與工程專業，講師。

2010-05-24