作物轉基因技術研究進展

周巖,薛曉鋒,趙俊杰,賀杰

（河南科技學院,河南新鄉 453003）

作物轉基因技術研究進展

周巖,薛曉鋒,趙俊杰,賀杰

（河南科技學院,河南新鄉 453003）

綜述了當前作物轉基因技術的三大主流方法農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等在農作物遺傳改良中的研究進展,并闡述了這些轉基因技術在水稻、小麥、棉花、玉米、大豆、苜蓿等主要農作物遺傳轉化現狀.著重論述了作物轉基因技術在抗病蟲、抗逆、品質改良、雄性不育等方面對作物進行遺傳改良的最新研究進展.

作物;轉基因技術;研究進展

自1983年第一株轉基因作物誕生以來,作物轉基因技術得到了迅速發展.截至目前,幾乎所有的作物都開展了轉基因研究,育種目標涉及到高產、優質、高效兼抗性及多用途等諸多方面.一批抗病、抗蟲、抗逆、抗除草劑等轉基因作物已進入商品化生產階段.

植物轉基因技術就是將具有重要利用價值的、外源的DNA片斷導入植物基因組中使之產生變異從而獲得新的特異性.大量轉基因作物的研究表明,作物基因工程是在基因水平上對作物的遺傳物質的改造,定向地對作物遺傳性狀進行改造,擴展了育種范圍,打破了物種間的生殖隔離障礙,豐富了基因資源,使育種具有科學性、精確性、目的性和可操作性.作物遺傳轉化的方法有農桿菌介導法、基因槍法、電激法、PEG法、脂質體法、低能離子束法、超聲波介導法、顯微注射法、花粉管通道法等.在當前作物基因工程研究中,主要采用農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法,這三種轉基因技術相對較為成熟.其他幾種方法雖然也應用于作物轉基因,但是由于技術本身的限制及其他原因,報道的轉基因植株較少.本文主要論述了農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法在作物基因工程上的最新進展,綜述了主要農作物在抗病蟲、抗逆、改良品質、抗除草劑以及雄性不育等方面的研究現狀.

1 作物遺傳轉化方法

1.1 農桿菌介導法

農桿菌介導的遺傳轉化是利用根癌農桿菌上的Ti質粒,將外源DNA導入植物細胞核基因組中并進行整合表達的轉化方法.其基本原理為：植物受到創傷后,細胞合成并分泌如乙酰丁香酮等類的酚類化合物,它們作為信號物質,促使農桿菌附著到受傷植物細胞表面.這些酚類化合物能誘導農桿菌的Vir區基因活化,T-DNA復制,Vir區編碼的特異蛋白與T-DNA結合形成T鏈蛋白復合體,跨越農桿菌、植物細胞壁進入核膜,整合至植物基因組DNA中.1983年比利時科學家Montagu等人和美國Monsanto公司Fraley等人分別將T-DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,獲得了世界上第一株轉基因植株——轉基因煙草,首次證明可以通過Ti質粒來實現外源基因對植物細胞的遺傳轉化.農桿菌介導法以其費用低、重復性好、單拷貝數、基因沉默現象少、轉育周期短及能轉化較大片段等獨特優點而備受科學工作者的青睞,隨后不同的研究者利用該方法先后獲得了胡蘿卜、牽?；?、番茄和油菜等雙子葉植物的轉基因植株.

1985年Horsch等創立葉盤法進行植物遺傳轉化,利用根癌農桿菌侵染煙草、番茄和矮牽牛葉片,成功獲得了轉基因植物.該方法簡單高效,為植物進行遺傳轉化開創了新途徑.雙子葉植物是根癌農桿菌的天然寄主,該方法在雙子葉植物遺傳轉化中得到了廣泛的應用,已成為大多數植物轉基因的首選方法.蘇玉春等以木聚糖酶xynB基因為外源基因,利用根癌農桿菌介導法轉化紫花苜蓿,獲得了整合有外源基因的再生植株,且鮮葉片木聚糖酶活性為10.5U/g[1].

由于單子葉植物不是根癌農桿菌的天然寄主,體內很少或者很難產生激活Ti質粒上Vir基因的信號分子,大多數沒有明顯的創傷反應,不能誘導創傷區臨近的細胞脫分化形成大量感受態細胞,對農桿菌感染不敏感,因而使用農桿菌轉化單子葉植物很難獲得成功.研究表明,乙酰丁香酮等酚類化合物可以促進農桿菌在水稻、玉米、小麥、谷子培養細胞及幼苗上吸附,從而有效地提高轉化效率[2].農桿菌菌株類型、轉化材料年齡及生理狀態也是影響轉化能否成功的關鍵因素.經過改良后的農桿菌介導遺傳轉化方法在一些重要的單子葉作物如水稻、玉米、小麥等成功獲得轉基因植株后,根癌農桿菌侵染單子葉的遺傳轉化研究迅速發展起來,并逐步獲得了一部分作物轉基因植株或品系.王秀紅等利用該方法將新型抗草甘膦基因導入玉米優良再生材料Hi-Ⅱ中,獲得了抗草甘膦轉基因玉米[3].

1.2 基因槍法

基因槍法又稱為微彈轟擊法,其原理是外源DNA包被在微小的金?；蜴u粉中,以火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體為驅動力,將附著于其表面的外源DNA分子導入受體細胞,然后通過細胞和組織培養技術再生出整合有外源DNA的新植株.最早的基因槍是由美國Cornel大學的Sanford等在1987年研制成功的.同年,Klein首次利用基因槍法轉化玉米；1989年采用該方法將GUS和PAT基因導入玉米懸浮細胞系,獲得了轉基因玉米[4].研究發現,在轉化過程中加入氯化鈣和亞精胺能提高核酸與微彈的結合力,選擇合適的轉基因表達載體及受體組織,優化基因槍轟擊參數（轟擊次數、轟擊時金粉用量、轟擊距離、DNA濃度、氦氣壓力和微彈速度等）可有效提高基因槍的轉化效率[5].伍成祥等利用基因槍將連有MAR序列的bar基因導入水稻獲得抗性植株[6].余桂容等研究表明,金粉用量100μg/槍,發射點與靶細胞距離60mm,可提高玉米基因槍的轉化效率[7].

自基因槍法建立以來,有力地推動了作物基因工程的發展,采用該方法已成功將抗病、抗蟲、抗逆、品質改良等基因導入作物基因組中.基因槍法對一些難以再生的作物更實用,幼胚、花粉細胞、莖尖分生組織等均可作為受體材料.基因槍法以其受體來源廣泛,方法簡單等優點,成為迄今為止單子葉作物轉基因的主要方法,且轉化的方法也相對比較成熟.然而基因槍法仍存在一些不足,如易形成嵌合體,多基因拷貝的整合,易出現共抑制和基因沉默現象,而且基因槍法所用的儀器設備昂貴,也限制其廣泛應用.

1.3 花粉管通道法

上世紀70年代,周光宇等結合我國遠緣雜交的成功經驗,提出了DNA片段雜交假說,為建立花粉管通道法奠定了重要的理論基礎.而后周光宇等從分子水平上加以驗證,模擬授粉雜交設計出花粉管通道轉基因技術,成功地將外源海島棉DNA導入陸地棉,培育出抗枯萎病的栽培品種,正式創立花粉管通道法.該方法是在植物授粉后,將含有目的外源基因的DNA溶液注射或涂抹到子房,利用植物開花,受精形成的花粉管通道,將外源的DNA導入到受精的卵細胞中,最終整合到植物基因組中,伴隨著受精卵的發育而形成轉基因新個體.盡管花粉管通道法獲得的轉基因植株,在性狀方面的確發生了明顯的變異,但由于缺乏確切的分子生物學證據,致使國內外一些學者對其可靠性提出了質疑.龔蓁蓁等利用同位素示蹤法表明通過3′H-DNA標記的棉花總DNA經珠孔進入開放的珠心到達胚后,30 s～8 h之間取樣放射自顯影觀察,80%以上的胚囊2～4 h均有外源DNA進入.在進入胚囊的途徑中,自顯斑點主要集中在珠心孔道內——即花粉管通道,在花粉管通道以外的珠心組織無標記顯示,表明授粉后形成的花粉管通道是外源DNA進入胚囊的唯一途徑[8].1988年Luo和Wu首次利用花粉管通道法將含報告基因的質粒DNA轉入水稻,經Southern雜交和酶學測定證明,得到了外源基因整合并表達的轉基因水稻植株[9],從而使花粉管通道法得到分子水平驗證.自此,外源DNA導入技術的研究工作在多種植物中陸續開展起來,已在水稻、小麥、棉花、玉米、大豆等作物育種中得到了成功應用,培育了許多具有抗病蟲、抗逆及其他優良性狀的作物新品種或新品系.董春林等采用改進的花粉管通道法,將海藻糖合酶基因（TPS）導入玉米自交系鄭58中,獲得了抗旱性高于對照的轉化植株[10].

花粉管通道法最突出的優點是不依賴組織培養人工再生植株,技術簡單,不需要裝備精良的實驗室,常規育種工作者易于掌握等.然而由于受到轉化時間、轉化時溫度和濕度、轉化載體的DNA濃度及受體植株花粉發育狀態的影響,目前該方法的轉化效率仍然較低.外源DNA片段與受體染色體組交換和重組的隨機性決定了轉基因后代變異性狀也有很大的隨機性和多向性.外源DNA導入引起變異的種類多、范圍廣、幅度大,使得對后代的篩選變得很復雜.

2 主要作物基因工程的研究現狀

2.1 轉基因水稻

水稻是世界的主要糧食作物之一,世界上有二分之一以上的人口以稻米為主食.自1988年獲得第一批轉基因水稻以來,研究者利用轉基因技術對傳統的水稻進行改良,成功地獲得了許多具有高產、抗性、營養乃至藥用價值的轉基因水稻.1991年Christou等利用基因槍法轟擊水稻幼胚,獲得轉基因秈稻和粳稻植株,并發現轉化性狀能傳遞到子代并符合孟德爾遺傳分離規律,同時利用分子生物學雜交證實了外源基因已穩定整合到子代植株中[11].Ignacimuthu等利用農桿菌介導法將來源于菜豆種子的淀粉酶阻抑基因導入Basmati水稻中,獲得了174株潮霉素抗性植株且呈GUS陽性反應,PCR和Southern bolts雜交證實淀粉酶阻抑基因已整合至水稻中,Western印記雜交證明相關蛋白已表達.除抗除草劑、改良品質基因外,抗病蟲、抗逆基因、高產以及與C4光合作用相關的PEPC基因等都已應用于水稻的遺傳轉化[12].

2.2 轉基因小麥

1992年Vasil利用長期培養的胚性愈傷組織為外植體,通過基因槍法將Gus/Bar基因導入小麥品種“pavn”,獲得對除草劑Basra具有抗性的再生植株（T0）及其后一代（T1）,從而獲得了世界上第一株轉基因小麥[13].基因槍轉基因技術的誕生,為小麥基因工程遺傳改良提供了新途徑.迄今為止,基因槍法仍是國際上小麥轉基因的主要方法.然而,其他轉基因技術在小麥遺傳轉化中也發揮著重要作用,并取得了一系列成果.劉香利等利用花粉管通道法將高分子量麥谷蛋白14亞基基因整合到不含該亞基的小麥品種[14]. Daniel等利用根癌農桿菌介導法將GBSS（I限制性淀粉粒合成酶）基因導入小麥幼胚中,Southern bolts雜交分析確定了外源基因已整合至小麥基因組中[15].

2.3 轉基因棉花

自1987年Umbeck等首次報道利用農桿菌介導法將NPTII基因和CAT基因導入陸地棉品種珂字312、310以來,棉花基因工程研究快速發展[16].中國農科院生物技術研究中心郭三堆等利用花粉管通道法,將構建的植物表達載體pGBI121S4ABC（攜帶高效雙價殺蟲基因CryIA和CpTI）導入石遠321、中棉所19號等黃淮海棉區主栽的棉花品種中,首次獲得了雙價轉基因抗蟲棉株系[17].目前,棉花基因工程研究主要集中在抗病害、抗除草劑方面.王振怡等利用基因槍轟擊陸地棉“邯208”的成熟種子胚尖,將抗黃萎病相關基因GhDAHPS轉化到棉花中,獲得了抗性植株[18].郭彩菊等利用農桿菌介導的方法,將含有根特異性表達啟動子的植酸酶基因（PhyA）轉入棉花的胚性愈傷中,PCR檢測證明PhyA已整合到棉花基因組中[19].

2.4 轉基因玉米

自1989年Klein[4]首次獲得轉基因玉米以來,玉米的遺傳轉化取得突破性進展,目前已建立了一套比較完整的理論和技術體系.玉米基因工程在抗病蟲害、抗除草劑、改良品質等方面研究十分廣泛. Schnepf等首次成功地克隆了一個編碼為Bt的殺蟲晶體蛋白基因,它在植物體內能合成毒素蛋白,害蟲吃過毒素蛋白后就會死亡,該基因成功地開啟了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕[20].Koziel等利用基因槍法將Cry1b基因轉入玉米幼胚,培育出抗蟲轉基因玉米[21].關淑艷等利用農桿菌介導法,將淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表達載體轉入玉米自交系H99和丹598胚性愈傷組織,PCR檢測初步證明外源基因已整合至玉米基因組中[22].

2.5 其他轉基因作物

大豆、苜蓿等作物基因工程研究與上述四大作物同步,目前已培育出了數千份具有各類特殊性狀的作物轉基因新材料.1988年Hinchee首次利用農桿菌介導法獲得轉基因大豆[23].自此,大豆遺傳轉化的外源基因覆蓋了抗蟲、抗除草劑及品質改良等方面,且在優化組織再生條件、提高遺傳轉化效率、去除選擇標記等方面獲得了突破性的進展.葉美等以“荷豆12”成熟種子胚尖為外植體,利用基因槍法進行遺傳轉化,基因槍轉化后的胚尖組織和轉基因植株后代的葉片中均觀察到GUS基因的表達；PCR證明外源GUS基因插入到轉基因后代的基因組中[24].張立全等利用花粉管通道法將鹽生植物紅樹總DNA導入紫花苜蓿阿爾岡金,獲得了在225mmol/LNaCl脅迫條件下具有高耐鹽性的植株[25].

3 結語

作物基因工程研究開展近三十年來,已取得了可喜成績.全世界分離出的目的基因已達100多個,獲得的轉基因植物達200多種.玉米、大豆、棉花、油菜轉基因作物等均已在田間釋放并在全球大面積種植.2010年全球轉基因作物種植面積14 800萬hm2.作物基因工程育種為獲得新種質資源以及具優良農藝性狀的品系提供了合理有效的新途徑.然而作物轉基因技術還普遍存在著作物遺傳轉化體系不穩定、轉化效率低、外源基因表達量低或不表達、實驗重復性差等問題.因此,今后的發展方向仍然是圍繞著提高轉化效率,克服基因表達后沉默等問題.我們相信隨著基因工程的進一步發展,尤其是轉化方法、轉化機理、轉化策略等不斷完善,轉基因技術將在作物遺傳改良中發揮越來越重要的作用.

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Advances in crop genetic engineering research

Zhou Yan,Xue Xiaofeng,Zhao Junjie,He Jie
（Henan Instituteof Scienceand Technology,Xinxiang453003,China）

The researsh of crop genetic engineering have extensively developed and gradually become effective complement of the conventional breeding.This paper briefly reviews current progress in the development of research and applications inmain crop transgenic breeding;summarizesmain transgenetic techniqueswidely used inmain crop breeding（e.g.rice,wheat,cotton,maize,soybean and alfalfa）,such as Agrobacterium-mediated transformation,particle bombardment,pollen tube pathway.Illustrates the advanced progress in the applications of crop genetic improvement, including diseases and insects resistance,quality improvment,abiotic stresses tolerance,male sterility and some other aspects.

crop,transgenic technology,advance

Q789

A

1008-7516（2011）05-0001-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.001

2011-08-12

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（072300430120）

周巖（1962-）,女,河南新鄉人,博士,教授.主要從事植物基因組學及分子生物學研究.

鄧天福）