黃連解毒湯對代謝綜合征大鼠心肌的保護作用及對胰島素信號轉導的影響

李曉星 包成梅 李傳保 季曉平 (山東大學齊魯醫院干部保健科，山東 濟南 500)

代謝綜合征(MS)是以糖代謝異常、高血壓、血脂紊亂、中心型肥胖等多種代謝紊亂或危險因素聚集一體的臨床癥候群，胰島素抵抗在MS的發病機制中處于中心地位。黃連解毒湯是清熱解毒經典方劑，由黃連、黃岑、黃柏、桅子四味生藥組成。系統研究表明，黃連解毒湯具有降糖、調脂、抗炎、改善胰島素抵抗等作用〔1，2〕。本研究以高糖、高脂結合高鹽飲食建立MS大鼠模型，旨在觀察MS大鼠肌損傷的特點，評價黃連解毒湯對核因子-κB(NF-κB)表達及胰島素受體底物1(IRS-1)絲氨酸磷酸化水平的影響，從而為闡明黃連解毒湯保護MS大鼠心肌的機制，提供重要的理論依據。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶2比例組成，其藥材均購于濟南建聯中藥，煎煮取汁，濃縮成清膏。取清膏送山東大學齊魯醫院藥劑科以薄層掃描方法測得其所含鹽酸小檗堿為18 mg/g;黃連解毒湯清膏臨用前以PBS溶液(pH 7.4)配成含鹽酸小檗堿37.4 g/L的混懸液;胰島素放射免疫分析試劑盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司;血糖、甘油三酯(TG)酶免試劑盒購自羅氏公司。一抗為美國Cell signal公司產品，二抗購于北京中杉生物技術有限公司。

1.2 動物及分組 雄性6周齡Wistar大鼠65只，均購自山東大學實驗動物中心，隨機分為兩組:正常對照組(NC組，n=10)，模型組(n=55)。NC組給予標準大鼠飼料及普通飲水喂養，模型組給予高糖、高脂及高鹽飼料及20%高蔗糖水喂養(HF飲食)。HF飲食喂養16 w后，將成模的其中21只大鼠隨機分為MS組(n=10)和黃連解毒湯組(MS+H組，n=11)。此后12 w，MS+H組繼續給予HF飲食同時每天以黃連解毒湯0.5 ml/100 g灌胃;MS組繼續給予HF飲食同時每天以等量生理鹽水灌胃;NC組繼續給予標準大鼠飼料及普通飲水喂養同時每天以等量生理鹽水灌胃。

1.3 生化指標的檢測 整個實驗過程中，每2周稱量體重(BW)及測尾動脈收縮期血壓(SBP)1次;分別于造模前、HF飲食喂養16 w、實驗末抽取靜脈血測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、總膽固醇(TC)、TG。血清胰島素用放免法測定，嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 組織學觀察 實驗結束時處死動物，留取心臟標本，以10%中性甲醛溶液固定24 h，取固定后心肌組織，梯度酒精系列脫水，常規石蠟包埋切片，行天狼猩紅染色。光鏡下觀察膠原纖維，拍片，掃描。

1.5 透射電鏡觀察 留取心臟標本，用4℃預冷的2%戊二醛固定液固定，再以鋨酸后固定，取固定后心肌組織經脫水、浸透、包埋后制備超薄切片，在透射電鏡下，觀察心肌組織超微結構的變化，選取典型視野拍照。

1.6 Western印跡法檢測各蛋白的表達 每20 mg心肌組織置于培養皿中，手術剪剪碎成細小碎片(冰上進行);組織中加入細胞裂解液，混勻。每20 mg組織加入200 μl裂解液，1 μl PMSF;將組織充分勻漿裂解，冰浴 20 min;離心10 000～14 000 r/min，4℃離心5 min;取上清轉移至新的預冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量;分裝保存于－70℃，避免反復凍融。配膠，將蛋白質Marker與待測樣品一次上樣，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳;待染料到達分離膠底部，斷開電源，行蛋白質的電轉移，200 mA恒流轉移3 h。取出電轉移完畢的硝纖膜至10 ml 5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下搖床搖2 h。用抗體稀釋液分別稀釋 β-actin抗體(1∶1 000)，NF-κB P65抗體(1∶500)，磷酸化 IRS-1(Ser307)抗體(1∶1 000)，磷酸化 Akt抗體(1∶1 000);將硝纖膜浸入一抗溶液的培養皿中，室溫震蕩2 h(或4℃反應過夜)。根據一抗選用合適的二抗，用5%脫脂奶粉封閉液分別配制二抗反應液(1∶3 000～1∶20 000)。二抗反應過后，取出膜于1×TBST溶液中漂洗，10 min×3次。

將上述反應過后的硝纖膜進行放射自顯影處理。應用生物凝膠電泳圖像分析系統(AlphaImager 2200)掃描定量，計算各組目的蛋白相對于β-actin的相對光密度值作為各蛋白的相對含量。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、血壓比較 見表1、圖1。各組大鼠在基礎狀態時BW、SBP無明顯差異，但在HF飲食喂養16 w后，MS組大鼠BW、SBP明顯高于NC組，用藥物干預12 w后，MS+H組BW及SBP明顯低于MS組(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 實驗末各組大鼠體重、血壓及生化指標比較(±s)

表1 實驗末各組大鼠體重、血壓及生化指標比較(±s)

與NC組比較:1)P＜0.01;與MS組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 BW(g) SBP(mmol/L) FBG(mmol/L) FINS(μIU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)NC組(n=10) 567.50±28.28 102.35±4.38 5.48±0.48 17.68±5.21 0.73±0.26 1.60±0.17 MS組(n=10) 661.78±26.711) 139.80±6.921) 8.51±0.991) 35.85±10.451) 0.91±0.26 2.04±0.151)MS+H組(n=11) 552.35±34.563) 128.00±7.313) 6.53±0.983) 23.86±8.512) 0.75±0.30 1.90±0.302)

圖1 MS大鼠與NC大鼠不同周齡體重、血壓比較

2.2 生化指標比較 見表1。藥物干預前，與NC組比較，MS組及MS+H組大鼠FBG、FINS及TC升高(P＜0.01);藥物干預12 w后，與MS組比較，MS+H組FBG、FINS明顯下降(P＜0.05);MS+H組TC水平明顯下降(P＜0.05)。

2.3 天狼猩紅染色結果 見圖2。偏振光鏡下可見膠原纖維呈紅色，與NC組相比，MS組心肌間質膠原纖維明顯增多;MS+H組較MS組心肌間質膠原纖維明顯減少。

2.4 透射電鏡觀察結果 見圖3。NC組左室心肌組織細胞排列整齊;粗細肌絲排列整齊，肌小節及明暗各帶清晰可見;線粒體豐富、大小均一、圓形或橢圓形;MS組左室心肌組織細胞部分肌節寬窄不一，肌絲排列紊亂;線粒體明顯增多，腫脹，可見指紋狀線粒體(箭頭所示);MS+H組大鼠左室心肌組織總體較MS組明顯好轉，細胞排列較整齊;線粒體大小較一致，排列較規整，未見指紋狀線粒體。

圖2 各組大鼠心肌組織天狼猩紅染色(×400)

圖3 各組大鼠心肌組織透射電鏡結果(×1 000)

2.5 Western印跡檢測結果 見圖4。與NC組比較，MS組蛋白NF-κB含量明顯升高(P＜0.05);絲氨酸磷酸化IRS-1(PIRS-1)水平明顯升高(P＜0.01);磷酸化Akt(P-Akt)水平明顯降低(P＜0.01);與MS組比較MS+H組蛋白NF-κB表達明顯降低(P＜0.01);MS+H組P-IRS-1表達明顯降低(P＜0.05);MS+H組P-Akt表達明顯升高(P＜0.01)。

圖4 各組大鼠心肌組織NF-κB、P-IRS-1及P-Akt蛋白水平比較

3 討論

黃連解毒湯出自唐·王燾所著《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥按3∶2∶2∶3比例配伍組成，其中以黃連瀉心火、兼瀉中焦之火為君;黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣;黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火，導熱下行，合為佐使，共以收瀉火解毒之功，無論內服、外服，均有良好的治療作用〔3〕。方素萍等〔4〕研究表明，黃連解毒湯含藥血清不僅能抑制非致炎狀態下中性粒細胞與血管內皮細胞的黏附，而且能抑制致炎因子所誘導的中性粒細胞與血管內皮細胞黏附作用增強，這可能是其抗炎作用機制之一。同樣有研究表明黃連解毒湯能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的發展〔5〕。動物實驗證明，黃連解毒湯中的重要成分小檗堿能改善心肌肥厚大鼠異常的心功能，抑制心肌細胞增生，阻止壓力負荷過重而引起的心肌肥厚的發展〔6，7〕。本研究進一步證明黃連解毒湯對MS大鼠心肌的保護作用及其改善胰島素抵抗的機制。

MS所有組成成分都是心血管疾病的獨立危險因素，這些與代謝有關的多種疾病或致病因素同時出現在一個個體身上，其臨床預后不良的危險大于僅有一種危險因素患者，而且其效應不是簡單相加，而是協同加劇，嚴重危害人類健康〔8〕。糖脂代謝紊亂是導致心臟結構和功能改變的重要原因。而改善IRS/PI3K/Akt通路進而改善糖脂代謝，具有重要的保護心臟結構和功能的作用。本結果提示HF飲食喂養28 w MS大鼠出現明顯的心肌損傷結構改變。黃連解毒湯對MS大鼠心肌起到明顯的保護作用。

IR是MS發病的中心環節之一，生理情況下，胰島素轉導信號通路為:胰島素與胰島素受體結合-胰島素受體磷酸化-胰島素受體底物(IRS)酪氨酸磷酸化-激活其下游底物-胰島素信號轉導至效應器。MS是一種全身慢性系統性的低度炎癥狀態，炎癥反應在MS發生發展中起重要作用，炎癥是引起胰島素抵抗的病理生理基礎〔9〕。胰島素受體后的信號通路與炎癥因子的信號傳導存在交叉作用，導致IR的主要分子機制是非特異性炎癥所產生的炎癥因子干擾胰島素受體底物/磷脂酰肌醇-3-激酶(IRS/PI3K)信號轉導通路〔10〕。體外實驗已發現至少有8種激酶使IRS的絲氨酸磷酸化，炎性因子TNF-α、IL-6等均可激活這些激酶。干擾胰島素信號轉導的激酶包括c-jun氨基末端激酶、核因子-κB(NF-κB)抑制物激酶(IKK)、蛋白激酶 C和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等〔11，12〕。目前研究較多的是導致胰島素抵抗的三條途徑，即IKK/NF-κB、JNK、SOCS-3。本研究結果顯示，MS組大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達增多，間接證實炎癥在MS大鼠心肌中的啟動;MS大鼠心肌組織中存在炎癥的激活，使得IRS307位點的絲氨酸磷酸化增強，阻礙IRS正常的酪氨酸磷酸化，進而影響胰島素信號傳導通路。給予黃連解毒湯后，炎癥激活受抑制，胰島素信號傳導通路正常發揮作用，進而起到保護心肌結構和功能的作用。

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