粵北山區并殖吸蟲流行分布現狀初步研究＊

傅廣華，鄧文強，劉 巧，陸予云，李旭文，陳少華，李宏光，王 萌

2.廣州醫學院衛生職業技術學院，廣州 510925；

3.從化市中醫醫院，廣州 510925

并殖吸蟲（Paragonimus）俗稱肺吸蟲。某些種類可感染人引起人肺吸蟲?。╬aragonimiasis），對人體健康危害極大。肺吸蟲病是我國重要的人獸共患食源性寄生蟲病之一。在早期的并殖吸蟲流行病學研究中發現，廣東粵北山區存在并殖吸蟲疫源地，并有衛氏并殖吸蟲（Paragonimuswestermani，）、斯氏貍殖吸蟲（Pagumogonimusskrjabini，）感染的病例報告［1－2］。近年來，傅廣華等人在粵北山區進行了并殖吸蟲疫源地調查，新發現報告衛氏并殖吸蟲與三平正并殖吸蟲（Euparagonimuscenocopiosus，）疫源地各1處［3－4］。為了全面了解粵北山區并殖吸蟲流行分布現狀，并殖吸蟲及第一、二中間宿主的種類，做好應對可能由并殖吸蟲引發的公共衛生安全事件，采用現埸流行病學調查與分子生物學技術DNA序列分析相結合進行物種鑒定方法，于2008年8月至2011年10月對粵北韶關市所轄的樂昌市、南雄市、始興縣、翁源縣、乳源縣、新豐縣、仁化縣及曲江區等地進行并殖吸蟲自然疫源地分布，并殖吸蟲種類及中間宿主種類分布狀況調查，現將初步研究結果資料匯總報告。

1 材料與方法

1.1 第一、二中間宿主采集與檢查 粵北地區每個縣、市各選擇3～5個調查點，山溪中捕捉螺螄1 000～3 000只、溪蟹30只～100只，按常規法解剖螺螄、溪蟹，分別檢查并殖吸蟲尾蚴、囊蚴，并作螺螄、溪蟹物種鑒定［5］。

1.2 保蟲宿主糞便收集與檢查 收集調查地附近村莊村民家中飼養的貓、犬糞便若干份，或調查地附近野生動物山貓糞便若干份。采用沉淀集卵法，取沉渣檢查并殖吸蟲卵。

1.3 人工感染動物試驗 選擇購自并殖吸蟲非流行區成年家貓、家犬若干只，實驗前進行糞便查找并殖吸蟲卵，結果陰性雄性貓、犬用作動物試驗。每只家貓飼喂并殖吸蟲囊蚴50個，每只家犬飼喂并殖吸蟲囊蚴200個，飼養100 d后取糞便查找并殖吸蟲卵，剖殺糞便檢查并殖吸蟲卵陽性貓、犬，肺臟內查找并殖吸蟲成蟲。

2 結 果

2.1 第一、二中間宿主檢查結果 乳源縣、新豐縣、仁化縣各調查點采集的螺螄、溪蟹樣本均未檢出并殖吸蟲短尾尾蚴及囊蚴。南雄市珠璣鎮里東、叟里元、下洞河3個調查點溪蟹檢出三平正并殖吸蟲囊蚴及體外脫囊的后尾蚴，見圖1、2。感染率分別為74.54﹪ （41/53）、68.91﹪ （32/47）、77.77﹪（24/32）。溪蟹經福建省疾病預防控制中心程由注主任鑒定為平和華溪蟹 （Sinopotamonpinheense，），見圖3、4。翁源縣新江鎮太坪調查點溪蟹檢出三平正并殖吸蟲囊蚴，感染率為76.92﹪ （40/52）。溪蟹物種鑒定為平和華溪蟹。曲江區小坑調查點溪蟹也檢出三平正并殖吸蟲囊蚴，感染率為81.5% （22/27）。溪蟹物種鑒定為平和華溪蟹。樂昌市樂城鎮大洞調查點螺螄檢出并殖吸蟲短尾尾蚴，見圖5。感染率為0.058%（1/1 700），螺螄物種鑒定為放逸短溝蜷（Semisulcospiralibertine，）見圖6。溪蟹檢出衛氏并殖吸蟲吸蟲囊蚴及體外脫囊的后尾蚴，見圖7、8。感染率為38.09﹪ （32/84）。感染度：9.16個囊蚴/只蟹，0.58個囊蚴/g蟹。溪蟹物種鑒定為平和華溪蟹，見圖3、4。結果見表1。

2.2 保蟲宿主檢查結果 對粵北地區6個市、縣調查點采集的多份貓、犬糞便，采用沉淀集卵法均未檢出并殖吸蟲卵。

2.3 人工感染動物試驗檢查結果 取每個調查點溪蟹解剖檢獲衛氏并殖吸蟲囊蚴或三平正并殖吸蟲囊蚴，各感染貓、犬1條，飼養100 d后分別剖殺查找成蟲。感染衛氏并殖吸蟲囊蚴貓肺臟有7個囊包，共檢獲13條成蟲和大量蟲卵，見圖9。感染衛氏并殖吸蟲囊蚴犬肺臟有18個囊包，共檢獲34條成蟲和大量蟲卵。5條感染不同地點三平正并殖吸蟲囊蚴貓肺臟分別有1～2個囊包，共檢獲12條成蟲和大量蟲卵，見圖10。5條感染三平正并殖吸蟲囊蚴犬肺臟分別有8～12個囊包，共檢獲83條成蟲和大量蟲卵。每只人工感染動物糞便檢獲蟲卵形態結構特征與肺部囊包內檢獲蟲卵相同。檢獲成蟲蟲體染色后，制成玻片裝大體標本，鏡下觀察形態特征分別符合衛氏并殖吸蟲、三平正并殖吸蟲，見圖11、12。

2.4COI、ITS2基因DNA檢測結果

2.4.1 COI與ITS2基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果 用檢獲粵北地區新發現5處三平正并殖吸蟲、1處衛氏并殖吸蟲疫源地囊蚴，人工感染動物實驗所獲成蟲樣品，進行COI與ITS2基因PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖13、14。

2.4.2 COI與ITS2基因DNA序列分析測序結果人工感染動物實驗所獲成蟲樣品COI與ITS2基因PCR擴增產物進序列測序，結果見圖15－18（為節約篇幅，P.w與E.c各列1個COI、ITS2基因序列結果圖）。將每個樣本測得COI與ITS2基因DNA序列與GenBank（美國國家生物工程信息中心、國立醫學圖書館、國立衛生院聯合成立，www.mcbi.nih.gov）檢索三平正并殖吸蟲 COI基因（AF159594.1）、ITS2基因（AF159602.1），衛氏并殖 吸 蟲 COI 基 因 （AY140694.1）、ITS2 基 因（AB354217.1）進行NCBI Blast序列比對，里東、叟里元、下洞河、大坪、小坑成蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索三平正并殖吸蟲COI基因序列同源性分別為：99.5% （319/320個堿基）；100% （320/320個堿 基）；99.5% （329/330 個 堿 基）；99.5%（299/300個堿基）；100% （334/334個堿基），大洞成蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索衛氏并殖吸蟲COI基因序列同源性100% （334/334個堿基）。里東、叟里元、下洞河、大坪、小坑成蟲樣本ITS2基因序列與GenBank檢索三平正并殖吸蟲ITS2基因序列同源性分別為：100%（349/340個堿基）；100% （360/360個堿基）；100%（360/360個堿基）；100%（360/360個堿基）；100% （360/360個堿基），大洞成蟲樣本ITS2基因序列與GenBank檢索衛氏并殖吸蟲ITS2基因序列同源性99.5%（415/420個堿基）。

表1 不同調查點樣本檢查結果Tab.1 Sample test in different survey sites

圖13 COI基因PCR擴增電泳結果1：里東；2：叟里元；3：下洞河；4：太坪；5：小坑三平正并殖吸蟲；6：大洞衛氏并殖吸蟲；M：PCR標志物Fig.13 PCR amplification results on electrophoresis of COL gene1：Li dong；2：Souliyuan；3：Xiadonghe；4：Taiping；5：Xiaokeng P.c；6：Dadong P.w；M：PCR marker.

圖14 ITS2基因PCR擴增電泳結果1：里東；2：叟里元；3：下洞河；4：太坪；5：小坑三平正并殖吸蟲；6：大洞衛氏并殖吸蟲；M：PCR標志物Fig.14 PCR amplification results on electrophoresis of ITS2 gene1：Li dong；2：Souliyuan；3：Xiadonghe；4：Taiping；5：Xiaokeng P.c；6：Dadong P.w；M：PCR marker.

圖15 三平正并殖吸蟲COI基因序列Fig.15 E.C COI gene sequences

圖16 三平正并殖吸蟲ITS2基因序列Fig.16 E.C ITS2 gene sequences

圖17 衛氏并殖吸蟲COI基因序列Fig.17 P.w COI gene sequences

圖18 衛氏并殖吸蟲ITS2基因序列Fig.18 P.w ITS2 gene sequences

3 討 論

粵北地區地處南嶺山脈之南，珠江水系的北江上游。地理位置介于東經112°50′～114°45′，北緯23°53′～25°31′。屬南亞熱帶和北亞熱帶過渡帶并以中亞熱帶氣候為主的濕潤性季風型氣候，年平均氣溫18～21℃，植物種類繁多，森林覆蓋率高達76.6%。多數山溪水流終年不枯。良好的自然生態環境，適合于并殖吸蟲第一中間宿主淡水螺類，第二中間宿主溪蟹類，終宿主貓科類動物如果子貍、野貓等繁衍生息。為并殖吸蟲的生活史環節提供了天然適宜的地理環境條件。根據目前已獲得研究結果顯示，粵北部分山區乃存在并殖吸蟲自然疫源地。結果1中南雄、翁源和曲江三個市、縣5個調查點溪蟹體內檢獲三平正并殖吸蟲囊蚴，樂昌市1調查點螺螄體內檢獲并殖吸蟲短尾尾蚴，溪蟹體內檢獲衛氏并殖吸蟲囊蚴。依據幼蟲尾蚴、囊蚴，人工動物感染實驗檢獲成蟲及蟲卵的形態結構特征鑒定，成蟲樣本的DNA測序結果比對分析聯合鑒定，本項研究在粵北四市、縣山區新發現三平正并殖吸蟲自然疫源地5處，衛氏并殖吸蟲自然疫源地1處。從5處三平正并殖吸蟲疫源地采集的放逸短溝蜷中均未檢出短尾尾蚴。自1962年陳心陶首次發現三平正并殖吸蟲至今已40余年，眾多的研究者為揭開三平正并殖吸蟲第一中間宿主之迷進行了大量的研究工作，至今未果［3］。本項研究中5處新發現三平正并殖吸蟲第一中間宿主暫時也是一個未知之迷。而新發現衛氏并殖吸蟲疫源地的第一中間宿則為放逸短溝蜷。值得注意的是，本項研究新發現的所有三平正并殖蟲與衛氏并殖吸蟲疫源地第二中間宿主淡水蟹種，均為平和華溪蟹。與陸予云等近年在廣東省新發現多處衛氏并殖吸蟲和三平正并殖吸蟲疫源地第二中間宿主相同，提示在粵北乃至廣東省平和華溪蟹是一個淡水蟹優勢種，也是廣東省并殖吸蟲的主要第二中間宿主。根據樊培方（1980）提出：以第二中間宿主囊蚴感染率及感染程度計算感染指數來劃分疫區等級［10］，南雄市里東、叟里元、下洞河3個調查點溪蟹三平正并殖吸蟲囊蚴感染指數分別為1.70、1.67、1.83，翁源縣大坪調查點為1.84，曲江縣小坑調查點為1.92。樂昌市大洞調查點溪蟹衛氏并殖吸蟲囊蚴感染指數為1.92。各調查點囊蚴感染指數均在1～99之間。因此，本項研究至今在粵北四市、縣山區新發現三平正并殖吸蟲與衛氏并殖吸蟲自然疫源地均為高度疫源地（II級）。鑒于衛氏并殖吸蟲是我國主要致病肺吸蟲蟲種，應做好疫源地人群中可能發生的并殖吸蟲感染防制措施，防止可能由此引發的公共衛生安全問題，保障疫源地人群身體健康。DNA測序研究結果顯示：5處三平正并殖吸蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索基因（AF159594.1）同源性分別為99.5%～100%之間。ITS2基因序列與檢索基因（AF159602.1）同源性均為100%。衛氏并殖吸蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索基因（AY140694.1）同源性為100% 。ITS2基因序列與檢索基因（AB354217.1）同源性均為99.5% 。迄今為止，檢測生物種DNA序列在親緣關系及物種分類鑒定上均具有重要價值。目前公認，并殖吸蟲COI基因適用于種遺傳差異的研究，ITS2基因適用于并殖吸蟲種間差異的研究［11］。結合本項研究中上述各樣本DNA測序比對結果分析，粵北四市、縣山區新發現5處三平正并殖吸蟲自然疫源地蟲種之間親緣性無差異性，并且與GenBank檢索基因也無明顯差異性。衛氏并殖吸蟲自然疫源地蟲種與GenBank檢索基因親緣性無明顯差異性。

本項研究中溪蟹物種鑒定得到福建省疾病預防控制中心程由注主任幫助，在此表示感謝！

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